Há uma demanda para fazer pré-clínicos de teste para uma novela classe de drogas "órfão" chamado acompanhantes farmacológicos podem ser reproduzidos, rápido e eficiente. Desenvolvemos um ensaio de baseado em cultura celular altamente padronizado, simples e versátil para tela para pacientes elegíveis, bem como drogas de romance acompanhante farmacológica.
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Artigo de método
In Vitro Enzima de medição para teste farmacológico acompanhante receptividade em Fabry e a doença de Pompe
Neste artigo
Resumo
Resumo
O uso da medicina personalizada para tratar doenças monogénicas raras como doenças de depósito lisossômico (DDL) é desafiado por projetos complexos de julgamento clínicos, custos elevados e baixos números de paciente. Centenas de alelos mutantes estão implicadas na maior parte a DDL. As doenças geralmente são classificadas em 2 ou 3 diferentes tipos clínicos de acordo com a gravidade. Além disso, a caracterização molecular do genótipo pode ajudar a prever os resultados clínicos e informar o atendimento ao paciente. Portanto, nós desenvolvemos um ensaio de cultura de células simples baseado em células HEK293H heterologously over expressando as mutações identificadas na doença de Fabry e Pompe. Um ensaio semelhante foi recentemente introduzido como um teste pré-clínicos para identificar mutações favoráveis para a terapia farmacológica de acompanhante (PCT) na doença de Fabry. Este manuscrito descreve um ensaio de cultura de célula alterada que permite rápida avaliação fenotípica de variantes alélicas na doença de Fabry e Pompe para identificar pacientes elegíveis para PCT e pode ajudar no desenvolvimento do romance pharmacochaperones.
Introdução
Há dúzias de desordens de doenças de depósito lisossômico (DDL) relacionados a disfunção glicosidase como resultado de mutações do gene principal. Em Fabry (OMIM #301500) e a doença de Pompe (OMIM #232300), mais de 500 e 200 mutações missense1,2,3 têm sido relatadas, respectivamente, que corresponde a cerca de 60% da contagem total de mutação. Numerosas novas variantes do gene ainda estão sendo identificadas, muitos dos quais têm desconhecido significado. Extensos estudos bioquímicos revelaram que certos genótipos não conduziu a uma completa perda de função do gene ABL (OMIM * 300644) na doença de Fabry, mas causam a enzima correspondente a falha alcançar um estado de dobramento termodinamicamente favorecido4 . Isso resulta em retenção de ER e degradação prematura da enzima funcional caso contrário. Conclusões similares foram desenhadas em outros LSDs, incluindo a doença de Pompe5. Além disso, caracterização molecular das variantes da enzima pode facilitar a interpretação clínica das mutações no momento do diagnóstico6, sugerindo que a progressão de LSD é um processo individual, com base na natureza da mutação. Portanto, a classificação convencional em diferentes tipos clínicos normalmente de 2 a 3 deve ser reavaliada a fim de racionalizar o aconselhamento clínico e decisões terapêuticas.
Terapia de reposição enzimática (ERT) está disponível para ambas as doenças. ERT, no entanto, tem limitada eficácia em tecidos/órgãos afetados como o cérebro e o músculo esquelético. Além disso, a ERT pode eliciar uma resposta imunogênica que coloca em risco seus benefícios terapêuticos. Acompanhantes farmacológicas (PCs) são uma alternativa atraente de tratamento para pacientes com mutações responsivos so-called. PCes servem como um andaime molecular para proteínas correto e estabilização que por sua vez impede a retenção de retículo endoplasmático (ER) e ER-associado a degradação da enzima. Além disso, PCs podem ser administrados por via oral e são potencialmente capazes de atravessar a barreira hemato-encefálica. Portanto, o PCT pode ser uma opção mais viável para o tratamento de pacientes com determinados genótipos. Para uma extensa revisão sobre aplicação de PC em DDL, consulte a excelente revisão por Parenti7.
A descoberta de centenas de doenças causando alelos mutantes desafia testar da droga do pre-clínica e exige uma avaliação simples, rápida e altamente padronizada de pacientes passíveis de uma abordagem de medicina personalizada. A fim de avaliar os efeitos nocivos de mutações do gene de LSD e testar mutações candidato para predizer pacientes passíveis de PCT, era um sistema de sobre-expressão altamente padronizados em células HEK293H que permite a medição de atividade enzimática rápida e confiável desenvolvido. Sistemas de sobre-expressão semelhantes têm sido descritos anteriormente para a doença de Fabry e Pompe com COS-78,9,10,11, de células HeLa12ou HEK29313 ,14,15,16 células para o gene glicosidase.
Um método muito semelhante mesmo foi patenteado como "Método para predizer a resposta ao tratamento farmacológico acompanhante de doenças"17 , indicando a relevância de uma célula de cultura sistema capaz de ser integrada na prática clínica.
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Protocolo
1. preparação das construções de mutante pcDNA3.1/ABL e pcDNA3.1/GAA
Nota: As estratégias de clonagem para a ABL e GAA codificação de sequências (cds) têm sido relatados anteriores15,18.
- Mutagenesis local-dirigido usando o Mutagenesis local-dirigido
- Uso a referência sequências NM_000169.2 e NM_000152.4 como modelos para o mutagenesis de genes GLA e GA , respectivamente. Tenho um conjunto de alta pureza sal gratuito primers (25-37-mers) sintetizada por um provedor comercial, com sentido e antisentido primers carregando um das alterações respectivas sequência centrais ao seu comprimento apresentar individualmente a mutação. Use a ferramenta de projeto de epoxi para apoiar o projeto de cartilha19.
- Para a mistura de reação, use as condições padrão para a solução de reação e condições PCR fornecidas pelo fabricante.
- Mistura de 5 µ l de 10 x 10, amortecedor da reação ng modelo dupla-hélice do ADN do plasmídeo (pcDNA3.1/ABL ou pcDNA3.1/GAA), 125 ng de cada primer, 1 µ l da mistura fornecida dNTP, 3 µ l de reagente de DMSO em um volume adequado de água desionizada (volume final de reação : 50 Μ L). Finalmente, adicione 2,5 U de DNA polimerase e misturar pipetando para cima e para baixo. Como um controle negativo, transporte ao longo de uma amostra não-primer.
- Iniciar o PCR usando o programa a seguir: passo 1: 95 ° C por 1 min, passo 2: 95 ° C por 50 s, etapa 3: 60 ° C para 50 s, passo 4: 68 ° C por 8 min, repita a etapa 2-4 18 vezes e passo 5: 68 ° C por 10 min.
- PCR, a seguir adicione 1 µ l do Dpnenzima de restrição (10 U / µ l) e ainda mais, incubar o frasco de reação a 37 ° C por 1h.
- Transformação e triagem para o desejado Clone
- Transforme uma alíquota de células ultracompetent em conformidade com as recomendações do fabricante. Médio de utilização SOC (triptona 2% (p/v), levedura extrato 0,5% (p/v), NaCl 10 mM, KCl 2.5 mM, esterilizar a 121 ° C e em seguida, adicionar soluções estéreis filtrada de MgCl2 e glicose até concentrações finais de 10 e 20 mM, respectivamente) em vez do fabricante médio. Após o procedimento, placa 250 µ l do mutagenesis de amostra em um LB contendo ampicilina de 100 µ g/mL a placa e incubar a 37 ° C por 18 h.
- Assegurar que o número de transformants é > 10 e a reação produz pelo menos três vezes mais colônias como a reação de controle não-primer, por exemplo, usando uma placa luminosa para facilitar a contagem de colônia. Em seguida, escolher 3 colônias e preparar 3 mL culturas durante a noite, no meio de caldo LB.
- No dia seguinte, realizar preparação de plasmídeo com um kit padrão e analisar toda a sequência usando T7 (5ʹ-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3ʹ) e BGHr (5ʹ-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3ʹ) primers através de Sanger padrão sequenciamento.
- Use uma ferramenta adequada de biologia molecular para analisar a sequência. Quando a mutação desejada é detectada e não mais sequência anormalidade em relação ao NM_000169.2 (α-galactosidase A) ou NM_000152.4 (ácido α-glucosidase) é visto, selecione o clone para purificação de plasmídeo de transfeccao-grau.
- Determine a pureza do DNA por medir a absorvância em espectrofotómetro.
Nota: Permitir que apenas os preparativos que rendem uma pureza de plasmídeo com um rácio de absorvância 260/280 de > 1.8 para celular cultura experiências.
2. cultivo de células HEK293H
- Manter as células HEK293H em glicose alta (4,5 g/L) Dulbecco´s Modified Eagle suplementado (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina. Manter as células uma incubadora a 37 ° C, sob uma atmosfera de2 5% CO de water-jacket.
- Cultive as células para uma densidade de 80-90%.
- Aspire o meio e lavar uma vez usar o fosfato tampão salino (PBS) sem Ca2 + e Mg2 +.
- Passagem pela adição de 0.05% Trypsin-EDTA e incubar durante 5 min a 37 ° C e 5% de CO2.
- Dividi as células 01:15 em meio fresco e a semente para um novo balão T75 para manter a cultura permanente. Não utilize pilhas com mais de 25 passagens.
3. pcDNA3.1/ABL e pcDNA3.1/GAA transfeccao Plasmideo e tratamento de HEK293H
- 24 h antes o transfeccao, lavar as células HEK293H em um frasco de cultura celular T75 uma vez com PBS com Ca2 +, Mg2 +. As células com 0,05% Trypsin-EDTA como foi dito acima e semente de 1,5 x 105 células nas cavidades de uma placa de cultura bem 24 usando 500 µ l DMEM suplementado com 10% da colheita FBS sem antibióticos.
- Realize um protocolo de Transfeccao de acordo com o manual do fabricante. Normalmente, use uma mistura de 1 µ g de DNA de plasmídeo e 2,5 µ l de reagente de transfeccao em 100 µ l de soro livre DMEM. Incubar durante 20 min à temperatura ambiente e adicionar às células de maneira algumas, depois disso.
- Remova a mídia que contém o reagente de transfeccao após um período de 4 h em 37 °C/5% CO2 e adicione 500 µ l de fresco DMEM com 10% FBS / 1% penicilina/estreptomicina.
Nota: Durante esta etapa, cloridrato de 1-Deoxygalactonojirimycin (DGJ) ou cloridrato de 1-Deoxynojirimycin (DNJ) pode ser adicionado ao meio de cultura onde se destina (usar uma solução aquosa de estoque de 10 mM a fim de obter uma concentração final de 20 µM DGJ e DNJ ). Fresco DGJ ou DNJ foi adicionado h 42 depois de transfeccao Plasmideo.
4. celular colheita e α-galactosidase A ou medição de atividade de ácido α-glicosidase
- Colheita da pilha
- No dia da colheita, remover as células da incubadora e aspire o meio. Lave cuidadosamente as células 2 vezes com PBS com Ca2 + e Mg2 +.
Nota: Esta etapa é essencial porque DGJ e DNJ são potentes inibidores da α-galactosidase e α-glucosidase, respectivamente, e qualquer sobra invalidaria o teste. - Adicione 200 µ l de água desionizada diretamente sobre as células. Enxagúe as células da placa e transferi-los para um tubo de reação de 1,5 mL.
- No dia da colheita, remover as células da incubadora e aspire o meio. Lave cuidadosamente as células 2 vezes com PBS com Ca2 + e Mg2 +.
- Homogeneização por congelamento e descongelamento
- Colocar as amostras em um rack de espuma apropriado e vórtice para 5 s para fazer a lise mais eficiente. Colocar as amostras alternando em nitrogênio líquido para 10 s e um banho de água de temperatura ambiente até o descongelamento foi completa (5 min).
- Repita este procedimento 5 vezes e em seguida girar as amostras durante 5 min à 10.000 x g.
- Prepare um tubo fresco para cada amostra contendo 40 µ l de deionizada H2O e adicionar 10 µ l de amostra. Misturar a solução vortexing brevemente e transferir 10 µ l em uma cavidade de uma placa bem 96 (cada amostra em triplicata). Diluir uma solução de reserva de albumina de soro bovino (BSA) 2 mg/mL em desionizada H2O da seguinte maneira para obter uma curva padrão: 50 µ l H2O/50 µ l BSA; 60 µ l H2O/40 µ l BSA; 70 µ l H2O/30 µ l BSA; 80 µ l H2O/20 µ l BSA; 90 µ l H2O/10 µ l BSA; 100 µ l de H2O.
- Comece a reação adicionando-se 200 µ l de reagente BCA (Reagente A e Reagente B misturado na proporção de 50: 1) e incube por 1h no escuro a 37 ° C, sob agitação ligeira em um agitador orbital (300 rpm). Medir a absorvância a 560 nm em um leitor de placa.
Nota: As amostras contêm tipicamente entre 1 e 1,5 µ g proteína por µ l.
- Dilua a quantidade calculada de cada amostra e pipeta nos tubos de reação fresca 1,5 mL para obter 0,05 (para A α-galactosidase) ou 0,5 (para ácido α-glucosidase) soluções de proteína / µ l µ g. Vórtice amostras para 5 s novamente e pipetar 10 µ l desta diluição em um 96 placa bem (cada amostra em duplicado).
- Inicie a reação pela adição de 20 µ l da solução de substrato respectivos:
Para α-galactosidase r: 2 mM 4-Methylumbelliferyl-α-D-galactopyranoside (4-MU-gal) em tampão de citrato de fosfato 0,06 M, pH 4,7.
Para ácido α-glucosidase: 2 mM 4-methylumbelliferyl α-D-glucopiranósido (4-MU-glu) em acetato de sódio 0,025 M, pH 4.0. - Incube as reacções enzimáticas por 1h no escuro a 37 ° C, sob agitação ligeira em um agitador orbital (300 rpm). Terminar a reação pela adição de 200 µ l de 1,0 M, tampão de pH 10,5 ajustado glicina-NaOH.
- Prepare uma curva padrão de 4-methylumbelliferone de um estoque de 0,01 mg/mL (4-MU), como segue:
100 µ l de H2O / não 4-MU; 80 µ l H2O / 20 µ l 4-MU; 60 µ l H2O / 40 µ l 4-MU; 40 µ l H2O / 60 µ l 4-MU; 20 µ l H2O / 80 µ l 4-MU; Não H2O / 100 µ l 4-MU, pipetar 10 µ l de cada diluição em 96 poço da placa (em duplicatas) e adicione 200 µ l de buffer de glicina-NaOH 1.0 M a cada poço a fim de ajustar o volume e o pH. - Medida da atividade enzimática em um leitor de fluorescência, equipado com o filtro apropriado definir e analisar os dados usando o software apropriado para o dispositivo do leitor de fluorescência.
Nota: Ambos os substratos 4-caneca são reduzidos a 4-MU durante a exposição ao α-galactosidase A ou ácido α-glucosidase. 4-MU lançado é um fluorocromo, que pode ser medido em 360 e 465 nm como os excitação e emissão de comprimentos de onda, respectivamente, um leitor de fluorescência de microplaca.
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Resultados
O procedimento de mutagênese
Para avaliar a eficiência de mutagênese do gene ABL , as mutações foram classificadas em uma das seguintes categorias. Esta abordagem para gerar mutações revelou que cerca de 66,5% das mutações ABL foram obtidas na primeira tentativa. Mais 25% pode ser obtido após uma PCR segundo ligeiramente modificada.
Categoria 1: O mutagenesis PCR foi eficaz na primeira tenta...
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Discussão
O protocolo descrito neste documento proporciona resultados robustos para avaliação dos danos da enzima em doenças lisossômicas hereditárias do metabolismo. Este manuscrito é que uma alteração do protocolo publicado anteriores15. As modificações mais cruciais envolvem rigor (ou seja, no processo de preparação de construção vector mutante), padronização do protocolo de cultura de célula (ou seja, as condições de manutenção e transfecção de células HEK293H) e a alta número de repet...
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Divulgações
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Agradecimentos
Os autores que gostaria de agradecer a Mandy Loebert e Tina Czajka por excelente suporte técnico. Agradecemos a Flora Luo (Harvard Medical School, Boston, MA, EUA) para o idioma de edição ajuda.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Material | |||
| QuikChange II XL Kit de Mutagênese Dirigida ao Local | Stratagene, La Jolla, CA, EUA | #200522 | |
| Primer GLA[R301Q]-frw: 5&agudo;- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3&agudo; | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanha | n.a.Primer | |
| GLA[R301Q]-rev: 5&agudo;- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3&agudo; | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanha | n.a.Primer | |
| GLA[A156V]-frw: 5&agudo;-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3&agudo; | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanha | n.a.Primer | |
| GLA[A156V]-rev: 5&agudo;-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3&agudo; | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanha | n.a.Primer | |
| GLA[A156V]-frw: 5&agudo;-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3&agudo; | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanha | n.a.Primer | |
| GLA[A143T]-rev: 5&agudo;-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3&agudo; | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanha | n.a.Primer | |
| GAA[F455Y]-frw: 5´-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3&agudo; | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanha | n.a.Primer | |
| GAA[F455Y]-rev: 5&agudo;-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3&agudo; | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanha | n.a.Primer | |
| GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3&agudo; | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanha | n.a.Primer | |
| GAA[P545L]-rev: 5&agudo;-CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3&agudo; | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanha | n.a.Primer | |
| GAA[L552P]-frw: 5&agudo;-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3&agudo; | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanha | n.a.Primer | |
| GAA[P545L]-rev: 5&agudo;-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3&agudo; | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanha | n.a.Primer | |
| T7: 5&agudo;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3&agudo; | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanha | n.a.Primer | |
| BGHrev: 5&agudo;-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3&agudo; | MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanha | n.a.Triptona | |
| Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha | 8952.1 | ||
| Extrato de levedura | Merck, Darmstadt, Alemanha | 103.753 | |
| Cloreto de sódio | Merck, Darmstadt, Alemanha | 1.064.041.000 | |
| Cloreto de potássio | Merck, Darmstadt, Alemanha | 1.049.360.500 | |
| MgCl2 x 6H2O | Merck, Darmstadt, Alemanha | 1.058.330.250 | |
| D (+)-Glicose monohidratada | Merck, Darmstadt, Alemanha | 1.083.422.500 | |
| Hidróxido de Sódio | Merck, Darmstadt, Alemanha | 1.064.980.500 | |
| Glicina | Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha | 3908.2 | |
| Ácido cítrico | Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha | X863.3 | |
| hidrogenofosfato dissódico | Merck, Darmstadt, Alemanha | 1.065.860.500 | |
| Acetato de sódio | Merck, Darmstadt, Alemanha | 1.062.640.050 | |
| Ácido acético glacial | Sigma Aldrich, Munique, Alemanha | A6283 | |
| LB Agar | Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha | X969.2 | |
| LB Medium | Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha | X968.2 | |
| Kit de Minipreparação de Plasmídeo | Zyppy ZymoResearch, Freiburg, Alemanha | D4020 | |
| QIAfilter Kit Midi de Plasmídeo | Qiagen, Hilden, Alemanha | 12245 | |
| Linha celular HEK293H | Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha | 11631-017 | |
| Dulbecco&agudo; s Modified Eagle Medium | Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha | 31966-047 | |
| HyClone soro fetal bovino | GE Healthcare, South Logan, Utah, EUA | SV30160.03 | |
| Penicilina/estreptomicina | Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha | 15140-122 | |
| Frascos de Cultura de Células Padrão CELLSTAR, Greiner Bio One | VWR International GmbH, Hannover, Alemanha | 82050-854 | |
| Placas de cultura de células (24 poços) | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemanha | 831,836 | |
| Placa de 96 poços Cellstar | Greiner bio one, Frickenhausen, Alemanha | 655185 | |
| Tubos de reação SafeSeal, 1,5mL | Sarstedt, Nü mbrecht, Alemanha | 72,706 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha | 11668-019 | |
| Cloridrato de 1-Desoxigalactonojirimicina | Sigma Aldrich, Munique, Alemanha | D9641 | |
| 1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride | Toronto Research Chemicals, Toronto, Canadá | D236500 | |
| 1-Desoxinojirimicina | Sigma Aldrich, Munique, Alemanha | D9305 | |
| PBS Dulbecco sem cálcio, sem biocromo de magnésio | , Berlim, Alemanha | L 1825 | |
| Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol | Thermo Scientific, Braunschweig, Alemanha | 25300054 | |
| Kit de ensaio de proteína Pierce BCA | Thermo Scientific, Braunschweig, Alemanha | 23225 | |
| 4-metilumbeliferona | Sigma Aldrich, Munique, Alemanha | M1381 | |
| 4-metilumbelliferil &alfa;-D-galactopiranosídeo Sigma | Aldrich, Munique, Alemanha | M7633 | |
| 4-metilumbelliferil &alfa;-D-glucopiranosídeo | Sigma Aldrich, Munique, Alemanha | M9766 | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Equipamento | |||
| incubadora tipo T6 | Heraeus Instruments, Hanau, Alemanha | n.a.Placa | |
| Luminosa Gr. 2 E | Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha | P265.1 | |
| 3130 xl Analisador Genético | Applied Biosystems, Darmstadt, Alemanha | n.a.GFL-3032 | |
| agitador bacteriano | GFL, Burgwedel, Alemanha | n.a.Avanti | |
| J-25 centrífuga | Beckman/Coulter, Krefeld, Alemanha | n.a.Ultraspec | |
| 3100 pro Espectrofotômetro | Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido | n.a.incubadora | |
| de jaqueta d'água | Binder, Tuttlingen, Alemanha | n.a.Vortex | |
| Genie 1 misturador de toque | Scientific Industries, Bohemia, NY, EUA | n.a.Z | |
| 233 MK-2 centrífuga de microtubos refrigerada | Hermle, Tuttlingen, Alemanha | n.a.LaboStar | |
| dispositivo de água ultrapura | Siemens, Berlim, Alemanha | n.a.Thermo | |
| Shaker PST-60HL-4 agitador orbital | Biosan, Riga, Letônia | n.a.Tecan | |
| GENios Reader | Tecan, Mä nnedorf, Suíça | n.a.HI | |
| 223 Medidor de pH Microprocessador | HANNA Instruments, Arvore, Portugal | n.a.CASY | |
| br/> Contador de Células + Sistema Analisador Modelo TT | Innovatis AG, Cham/Zug, Suíça | ||
| Nome | Empresa | Número de Catálogo | Comentários |
| Software | |||
| Magellan software de análise de dados v6.6 | Tecan, Mä nnedorf, Suíça | n.a.GraphPad | |
| Prism 5.04 | GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; EUA | n.a.Microsoft | |
| Office 2010 | Microsoft Corporation, Redmond, WA, EUA | n.a.BioEdit | |
| Alignment Editor, V7.0.1 | http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html | n.a. | |
| Abreviações | |||
| frw = para a frente; rev = reverse | |||
| n.a. = não aplicável |
Referências
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- Meiji Pharmaceutical University. , http://fabry-database.org (2017).
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- Ishii, S., et al. Mutant alpha-galactosidase A enzymes identified in Fabry disease patients with residual enzyme activity: biochemical characterization and restoration of normal intracellular processing by 1-deoxygalactonojirimycin. Biochem J. 406, 285-295 (2007).
- Tajima, Y. Structural and biochemical studies on Pompe disease and a "pseudodeficiency of acid alpha-glucosidase". J Hum Genet. 52, 898-906 (2007).
- Lukas, J. Functional and Clinical Consequences of Novel α-Galactosidase A Mutations in Fabry Disease. Hum Mutat. 37, 43-51 (2016).
- Parenti, G. Treating lysosomal storage diseases with pharmacological chaperones: from concept to clinics. EMBO Mol Med. 1, 268-279 (2009).
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