Summary
Her beskriver vi en metode mottagelig å samtidig quantitate og genomet-stort kart ribonucleotides i svært intakt DNA på enkelt-nukleotid oppløsning, kombinere enzymatisk spalting av genomisk DNA alkalisk hydrolyse og påfølgende 5´-ende sekvensering.
Abstract
Etablerte tilnærminger til å beregne antall ribonucleotides i et genom er begrenset til kvantifisering av innarbeidet ribonucleotides bruker kort syntetiske DNA fragmenter eller plasmider som maler og deretter ekstrapolere resultatene til hele genomet. Eventuelt kan antall ribonucleotides i et genom estimeres alkaliske gels eller sørlige blots. Nyere i vivo tilnærminger ansette neste generasjons sekvensering tillate genomet hele kartlegging av ribonucleotides, posisjon og identiteten til innebygde ribonucleotides. Men tillater de ikke kvantifisering av antall ribonucleotides som er innlemmet i et genom. Her beskriver vi hvordan kart og quantitate antall ribonucleotides som er innlemmet i menneskelig Mitokondrielt DNA i vivo av neste generasjons sekvensering samtidig. Vi bruker svært intakt DNA og innføre sekvens bestemt dobbel-strand bryter ved fordøye det med en endonuclease, senere hydrolyzing innlemmet ribonucleotides med lut. Genererte endene er samskrevet med kort, og disse er sekvensielt på en neste generasjons sekvensering maskin. Absolutte antallet ribonucleotides kan beregnes som antall leser anerkjennelse område per gjennomsnittlig antall leseoperasjoner på webområdet anerkjennelse for sekvensen bestemte endonuclease. Denne protokollen kan også brukes til å tilordne og quantitate gratis kutt i DNA og lar tilpasning til andre DNA lesjoner som kan behandles tilordnes 5´-OH ender eller 5´-fosfat ender. Videre, denne metoden kan brukes til enhver organisme, gitt at en passende referanse genom er tilgjengelig. Denne protokollen gir derfor et viktig verktøy for å studere utryddelse, 5´-end behandling, DNA skade og DNA-reparasjon.
Introduction
I en eukaryot celle er konsentrasjonen av ribonucleotides (rNTPs) mye høyere enn konsentrasjonen av deoxyribonucleotides (dNTPs)1. DNA polymerases diskriminere mot ribonucleotides, men dette diskriminering er ikke perfekt, og som en konsekvens, ribonucleotides i stedet for deoxyribonucleotides kan innlemmes i genomer utryddelse. Ribonucleotides kan være de vanligste ikke-kanoniske nukleotider innlemmet i genomet2. De fleste av disse ribonucleotides fjernes under Okazaki fragment modning RNase H2 initiert ribonucleotide excision reparasjon (RER) eller Topoisomerase 1 (omtalt i referanse3). Ribonucleotides som ikke kan fjernes bo stabilt inkorporert i DNA2,4 og kan påvirke det på både skadelig og gunstig måter (omtalt i gjennomgått5). Foruten å kunne fungere som positive signaler, for eksempel i parring type bytte i Schizosaccharomyces pombe6 og merke den nye DNA stranden under mismatch reparere (MMR)7,8, ribonucleotides påvirke den strukturen9 og stabilitet av omkringliggende DNA på grunn av 2´-hydroksyl gruppen av deres ribose10, noe som resulterer i replicative stress og genom ustabilitet11. Av ribonucleotides i genomic DNA (gDNA) og deres relevans for replikering og reparerer mekanismer, samt implikasjonene for genomet stabilitet, gir grunn til å undersøke sine presise forekomst og frekvens på genomet-bred måte.
RNase H2 aktivitet har ikke blitt funnet i menneskelige mitokondrier og ribonucleotides er derfor ikke effektivt fjernet i Mitokondrielt DNA (mtDNA). Flere veier er involvert i tilbudet av nukleotider til menneskelig mitokondrier og undersøke om forstyrrelser i mitokondrie nukleotid bassenget forårsake et forhøyet antall ribonucleotides i menneskelige mtDNA, vi utviklet en protokoll for kart og quantitate disse ribonucleotides i menneskelig mtDNA isolert fra fibroblaster HeLa celler og pasienten cellen linjer12.
De fleste i vitro tilnærminger (omtalt i vurdert13) for å fastslå DNA polymerases' selektivitet mot rNTPs er basert på én ribonucleotide innsetting eller primer forlengelsen eksperimenter der konkurrerende rNTPs er inkludert i reaksjonen Bland, slik at den identifikasjon eller relativ kvantifisering av ribonucleotide innlemmelse i kort DNA-maler. Kvantitativ tilnærminger på korte sekvenser kan ikke reflekterer dNTP og rNTP bassenger i mobilnettet konsentrasjoner og derfor gir innsikt i polymerase selektivitet men har begrenset betydning om hele genomer. Det har vist at relative ribonucleotides innlemmet under replikering av en lengre DNA-malen, for eksempel en plasmider, kan visualiseres på en sekvensering gel bruker radiolabeled dNTPs og hydrolyzing DNA i et alkalisk miljø14. Videre har gDNA blitt analysert på sørlige blots følgende alkalisk hydrolyse, slik at strand-spesifikke undersøkelser og fastsettelse av absolutt priser ribonucleotide innlemmelse i vivo15. Disse tillate en relativ sammenligning av inkorporering frekvens men levere ingen innsikt plasseringen eller identiteten til innarbeidet ribonucleotides. Nye tilnærminger til å analysere ribonucleotide innholdet i gDNA i vivosom HydEn-Seq16, Ribose-Seq17, Pu-Seq18eller emRiboSeq19, dra nytte av de innebygde ribonucleotides følsomhet for alkaliske eller RNase H2 behandling, henholdsvis, og benytte neste generasjons sekvensering å identifisere ribonucleotides genomet-wide. Disse metodene gir innsikt i absolutt innlemmelse hyppigheten av de oppdaget ribonucleotides. Legger til trinnet sekvens bestemt enzymatisk cleavage HydEn-seq-protokollen, metoden som beskrives her beleilig utvider opplysningene du får en sekvensering tilnærming, slik at samtidig kartlegging og kvantifisering av innebygd ribonucleotides12. Denne metoden gjelder for nesten alle organisme gitt at svært intakt DNA ekstrakter kan genereres og et passende referanse genom er tilgjengelig. Metoden kan være tilpasset quantitate og bestemme plasseringen av alle leksjonen det kan bli fordøyd av en nuclease og forlater en 5´-fosfat eller en 5´-OH slutt.
Kart og quantitate ribonucleotides i genomic DNA, kombinerer metoden spalting av en sekvens bestemte endonuclease og alkalisk hydrolyse generere 5´-fosfat ender på steder der innpassing rekkefølgen for endonuclease er plassert og 5´- OH ender posisjoner der ribonucleotides lå. Siden de genererte ledige endene er senere samskrevet med kort og sekvensielt ved hjelp av neste generasjons sekvensering, er det viktig å bruke svært intakt DNA og unngå tilfeldige fragmentering under DNA utvinning og biblioteket forberedelse. Vurdere disse leser normalisert til lest på endonuclease cleavage nettsteder kan en samtidige kvantifisering og kartlegging av de oppdaget ribonucleotides. Gratis 5´-ender oppdages kontroll eksperimenter hvor alkalisk hydrolyse av DNA er erstattet av behandling med KCl. Ervervet dataene gi innsikt i ribonucleotide plassering og antall og gir analyser med hensyn til ribonucleotide innhold og innlemmelse frekvens.
Protocol
denne protokollen er skissert i figur 1 og omfatter isolering av gDNA, fordøyelsen med begrensning enzymer kunne quantitate antall ribonucleotides, behandling med lut til hydrolyze phosphodiester båndene av ribonucleotides innlemmet i gDNA, fosforylering av gratis 5´-OH slutter, ssDNA ligation av kort, andre strand syntese og PCR forsterkning før sekvensering.
1. kort og indeks primere
- få ARC49, ARC140 oligonucleotides, ARC76/77, kort og ARC78-ARC107 indeks primere (se tabell 1).
Merk: Oligonucleotides må være HPLC renset. ARC76/77 er organisert som dupleks. - Forberede 100 µM lager løsninger for hver oligonucleotide i Tris-EDTA (TE) buffer (se Tabell for materiale) og lagre på -20 ° C.
- Forberede 10 µM løsninger ARC67/77 og 2 µM løsninger i ARC49 og indeks primere fortynne elueringsrør buffer (EB, se Tabellen for materiale). Butikken på 20 ° C.
2. Vekst og høsting av celler
- vokse HeLa celler i 70 mL Dulbecco ' s endret Eagle Medium (DMEM) med 10% fosterets bovin serum i en 250 mL Spinner bolle på 37 ° C.
- Teller hvor mange celler og samle 5 x 10 6 celler i en 50-mL tube, sentrifuge for 5 min på 200 x g, og forkaste nedbryting.
- Vask cellene med 20 mL 1 x PBS, sentrifuge for 5 min på 200 x g, og forkaste nedbryting.
- Fryse pellets på 20 ° C eller fortsette med DNA rensing.
3. DNA rensing og kvantifisering
- rense gDNA med fenol-kloroform utvinning som beskrevet under.
- Resuspend cellene i 2 mL lyseringsbuffer (se Tabell for materiale) og Inkuber i 30 min på 42 ° C på oppvarming blokk.
FORSIKTIG: Lyseringsbuffer inneholder farlige komponenter. SDS løsning er irriterende, proteinasen K sensibiliserende, irriterende og giftige. Bruk verneutstyr og hansker. - Delt eksemplet i to 2 mL rør og legge til 1-volum (V) av fenol-kloroform-isoamyl alkohol (25:24:1).
FORSIKTIG: Fenol-kloroform-isoamyl alkohol er giftig, mutagent, etsende og farlig for akvatiske miljøer. Bruke i avtrekksvifte, verneutstyr og hansker og kaste i spesielle fenol-kloroform avfall. - Blanding av inversjon for 30-60 s og sentrifuge for 5 min på 15.000 x g ved romtemperatur.
Merk: Gjøre vortex DNA for å unngå å innføre tilfeldig strand pauser, som vil forvrenge resultatene. - Overføre den øvre, vandige fasen til en ny 2 mL tube og legge 1 V fenol-kloroform-isoamyl alkohol (25:24:1).
- Blanding av inversjon og sentrifuge for 5 min på 15.000 x g på 4 ° C.
- Overføre øvre, vandige fasen en ny 2 mL tube og legge til 20 µL NaCl (5 M) og 1 V av kaldt isopropanol.
FORSIKTIG: Isopropanol er brannfarlig, irriterende og giftige. Oppbevares i en ventilert regjering ha beskyttende klær og hansker og hold den unna flammer. - Blanding av inversjon og Inkuber minst 1t på -20 ° C.
- Sentrifuge for 20 min på 15.000 x g, 4 ° C og Forkast nedbryting.
- Vask DNA pellets med 200 µL kaldt 70% etanol, sentrifuge for 20 min 15.000 x g på 4 ° C og kast nedbryting.
FORSIKTIG: 70% etanol er brannfarlig og irriterende. Holde fungerende løsning på 20 ° C, ellers store ventilert regjering, bære beskyttende klær og hansker, og hold den unna flammer. - Tørr DNA pellet ved romtemperatur for 20-25 min.
- Oppløse DNA pellets i 100 µL TE buffer og basseng eksemplene i en tube.
- Resuspend cellene i 2 mL lyseringsbuffer (se Tabell for materiale) og Inkuber i 30 min på 42 ° C på oppvarming blokk.
- Quantitate DNA konsentrasjon bruker en dsDNA kvantifisering reagens ifølge produsenten ' s spesifikasjoner (se Tabell av materialer).
Merk: Bruk en dsDNA kvantifisering reagens, fordi Spektrofotometri DNA kvantifisering kan påvirkes av gjenværende fenol. - Store DNA på 20 ° C eller fortsette med HincII behandling.
4. HincII behandling og alkalisk hydrolyse
- Digest 1 µg DNA i en reaksjon blanding som inneholder 5 µL 10 x buffer 3.1, 1 µL (10 U) HincII, og nuclease-fri H 2 O til en endelig mengde 50 µL.
Merk: For å oppnå optimale forhold for hemorroider, andre strand syntese og PCR forsterkning, det kan være nødvendig å øke input DNA hvis det er forventet at DNA inneholder et svært lavt antall ribonucleotides. På samme måte kan det være nødvendig å redusere inn DNA hvis ribonucleotides er svært høy. - Inkuber i 30 min på 37 ° C.
- Rense HincII behandlet DNA med spinn perler.
Merk: Holde røret lokk åpne i fremgangsmåten ikke forstyrre pellets ved å åpne rørene.- Legge til 1,8 V av spinn perler til hver prøve, nøye blanding av pipettering, og ruge ved romtemperatur for 10 min.
- Bruker en magnetisk rack pellets perlene i 5 minutter, deretter fjerne og forkaste nedbryting.
- Vask pellets med 150 µL av 70% etanol (romtemperatur) for ca 30 s så fjern og Forkast nedbryting.
- Vask pellets med 200 µL av 70% etanol (romtemperatur) for om 30 s deretter fjerne og slette nedbryting.
Merk: Gjenværende etanol kan fjernes med en 10 µL pipette. Dråper kan være spunnet ned kort forhånd. - Tørr prøvene i romtemperatur i ca 15-20 min.
Merk: Nøyaktig tid avhenger av antall perler og form av pellet, derfor pellets bør kontrolleres visuelt. - Fjerne rør fra magnetiske rack og elute pellets i 45 µL EB, blandingen av pipettering nøye.
- Ruge etter 5 min deretter pellets perler på magnetiske stativet og bruke 45 µL av renset DNA i trinn 4.4.
- Legge til 5 µL av KOH (3 M) eller KCl (3 M) til DNA å skape et totalt volum på 50 µL.
FORSIKTIG: 3 M KOH løsning er etsende. Bruk verneutstyr og hansker. - Incubate for 2t ved 55 ° C i en hybridisering ovnen etterfulgt av 5 min på ice.
Merk: Det anbefales å utføre KOH behandling i en ovn i stedet for en oppvarming blokk å opprettholde en jevn varme av røret og hindre kondens på lokket. - Føre DNA ved å legge 10 µL natrium acetate (3 M, pH = 5.2) og 125 µL kaldt 100% etanol. Ruge på is 5 min.
FORSIKTIG: 100% etanol er brannfarlig og irriterende. Lagre i en ventilert regjering ha beskyttende klær og hansker og holde unna flammer. - Pellets gDNA av sentrifugering 21000 x g, 4 ° C i 5 min og kast nedbryting.
- Vask DNA pellets med 250 µL kaldt 70% EtOH, sentrifuge 21000 x g, 4 ° C i 5 minutter, og kast nedbryting.
Merk: For å fjerne dråper, røret kan være spunnet ned kort igjen og nedbryting kan fjernes med en 10 µl pipette. - La pellet tørke i en åpen rør i ca 5-10 min til noen synlig væsken har fordampet.
- La DNA pellet oppløses i 20 µL EB i 30 min ved romtemperatur.
5. 5´ slutten fosforylering
- forberede reaksjonen blanding for hvert utvalg på forhånd ulemperjemmeside av 2,5 µL 10 x T4 polynucleotide kinase reaksjon buffer, 1 µL (10 U) 3´-fosfatase-minus T4 polynucleotide kinase og 2,5 µL ATP (10 mM).
- Overføre 19 µL av hver DNA smak i en ny 200 µL rør og denature i 3 minutter på 85 ° C i en thermo-cycler.
- Cool DNA prøver på is og legge 6 µL av reaksjonen blanding til hvert utvalg.
- Incubate reaksjon blander på 37 ° C for 30 min og slutte reaksjonen av rugende prøvene ved 65 ° C i 20 min.
- Renser DNA som beskrevet i 4.3, med 1,8 V av spinn perler, men elute i 14 µL EB.
6. ssDNA Ligation
- forberede reaksjonen blanding for hvert utvalg på forhånd bestående av 0,5 µL ATP (2 mM), 5 µL 10 x T4 RNA ligase reaksjon buffer, 5 µL CoCl 3 (NH 3) 6 (10 mM), 0,5 µL ARC140 (100 µM), og 25 µL 50% pinne 8000. Bland godt av pipettering.
FORSIKTIG: CoCl 3 (NH 3) 6 er kreftfremkallende sensibiliserende og farlig for vannmiljøet. Bruk verneutstyr og hansker. - Overføre 13 µL av renset DNA fra trinn 5.5 slik nye 200 µL og denature i 3 minutter på 85 ° C i en thermo-cycler.
- Cool DNA på is legge 36 µL av reaksjonen blanding hver prøve, blande av pipettering og Nedspinning kort.
- Legge til 1 µL (10 U) av T4 RNA Ligase til hver reaksjon, blande av pipettering og Nedspinning kort.
- Ruge prøvene i romtemperatur i den mørke natten.
7. Andre-strand syntese
- rense samskrevet DNA som beskrevet i 4.3, men bruke 0,8 V av spinn perler, pellets perler på 10 min og elute i 20 µL EB.
Merk: På grunn av høyere viskositet av hemorroider reaksjonen blanding, pelleting steg er langvarig. - Overføring 20 µL av DNA-prøve slik nye 200 µL PCR. Gjenta rensing trinnet med 0,8 V av spinn perler etter produsenten ' s spesifikasjoner og elute i 14 µL EB.
- Forberede reaksjonen blanding for hvert utvalg på forhånd bestående av 2 µL av 10 x T7 DNA polymerase reaksjon buffer, 2 µL ARC76/77 (2 µM), 2 µL dNTPs (2 mM) og 0,8 µL BSA (1 mg/mL).
- Overføre 12,8 µL renset DNA slik nye 200 µL, denature i 3 minutter på 85 ° C i en thermo-cycler.
- Cool DNA på is og legge 6.8 µL av reaksjonen blanding hver prøve, blande av pipettering, Nedspinning kort og ruge i 5 minutter ved romtemperatur.
- Legge til 0,4 µL (4 U) T7 DNA polymerase hver reaksjon og ruge i 5 minutter ved romtemperatur.
- Renser DNA som beskrevet i 4.3, bruker 0,8 V av spinn perler og elute i 11 µL EB.
8. PCR forsterkning og biblioteket kvantifisering
- forberede reaksjonen blanding for hvert utvalg i en ny 200 µL rør på forhånd bestående av 7,5 µL ARC49 (2 µM), 7,5 µL indeks primer (2 µM, unik for hver prøve), og 25 µL 2 x varmt start klar mix.
- Legge til 10 µL av DNA-prøve å hver reaksjon. Forsterke biblioteket bruker følgende: denature ved 95 ° C i 45 s, etterfulgt av 18 sykluser av 98 ° C for 15 s, 65 ° C for 30 s, 72 ° C for 30 s, slutter med en avsluttende forlengelse ved 72 ° C for 2 min. Hold prøver på 4 ° C etter forsterkning.
- Rense biblioteker som beskrevet i 4.3, med 0.8 V av spinn perler, og elute i 20 µL TE buffer.
- Quantitate biblioteker med en dsDNA kvantifisering reagens, ifølge produsenten ' s spesifikasjoner (se Tabell av materialer).
- Lagre prøver på 20 ° C eller fortsette med biblioteket analyse.
9. Biblioteket analyse og Pooling
- bestemme kvaliteten på hvert bibliotek og beregne gjennomsnittlig fragment størrelsen ved å bruke en digital geleelektroforese.
Merk: Gjennomsnittlig fragment størrelsen vurderes ved å estimere hvor området under kurven av electropherogram er halvert, hensyn peaks markører. Representant resultatene av passende biblioteket profiler etter KOH eller KCl er gitt i figur 2A. - Beregn konsentrasjonen (nM) bibliotekene som:
(c/10 3) /(p*650)] * 10 9
der c er konsentrasjonen av biblioteket i ng/µL og p er gjennomsnittlig fragment størrelsen i bp, som estimerte i 9.1. - Svømmebasseng like molar mengder av opptil 24 biblioteker forsterket med annen indeks primere for sekvenser. Legge TE buffer til et endelig antall 25 µL og konsentrasjonen av 10 nM.
Merk: Avhengig av antall biblioteker for å være samlet, mengden av DNA fra hvert bibliotek justeres. Hvis primer dimers ble oppdaget i trinn 9.1 som en distinkt peak av ca 130 bp, det siste bindet av biblioteket kan overskride 25 µL, fordi rensing trinn gjentas som beskrevet i 4.3, med 0.8 V av spinn perler, og DNA er elut i 25 µL TE buf fer.- Finne ut nye biblioteket bassenget konsentrasjonen med en dsDNA kvantifisering reagens ifølge produsenten ' s spesifikasjoner og gjennomsnittet topp størrelse som beskrevet ovenfor. Videre til sekvensering og dataanalyse (seksjoner 10 og 11).
10. Sekvensering
- utføre 75-base sammen-end sekvensering på grupperte biblioteker 12.
11. dataanalyse
- Trim alle leser fjerne kortet sekvenser, filtrere kvalitet og lese lengde.
Merk: Dette kan gjøres med kommandoen cutadapt 1.2.1 20 ' cutadapt -f fastq - match-Les-jokertegn - stille -m 15 - q 10 - en NNNNNNN < fil > ", der NNNNNNN er erstattet med den faktiske kort sekvensen og < filen > er erstattet med filnavnet fastq. - Fjerne vennene av lyder som ble forkastet i forrige trinn bruker egendefinerte skript.
- Juster kompis 1 gjenværende par på en indeks som inneholder sekvensen av alle oligonucleotides i biblioteket utarbeidelse (f.eks Bowtie 0.12.8 21 og kommandolinjen alternativer - m1-v2). Forkaste alle par med vellykket justeringer.
- Justerer gjenstående par organisme referanse genomet Bowtie med kommandolinjen alternativer - v2 -X 10000 - beste.
- Kart leser som spenner mellom mitokondrie molekyl begynnelsen og slutten av justere kompis 1 av alle unaligned par (Bowtie med kommandolinjen alternativer - v2).
- Bestemmer antall 5´-ender for alle enkelt og sammenkoblede justeringer. Skifte plasseringen av dette av en base oppstrøms til plasseringen der de hydrolyzed ribonucleotides var.
- Eksportere data fra filen bowtie format for et bedgraph format ved hjelp av egendefinerte skript for visualisering felles genomet nettlesere. Normalisere lest for hver strand til leser per million.
- Bruker posisjon og teller fra filen bedgraph, referanse organisme Genova orden å fastslå identiteten til incorporated ribonucleotides.
Merk: For menneskelig mitokondrie genomet leser fra regionene 16,200-300 og 5,747-5,847 for hver strand bør utelukkes siden disse områdene inneholder mange gratis 5´-ender relatert til ribonucleotide innlemmelse av DNA polymerase γ. - Dele den totale lest, ikke inkludert leser i elleve HincII steder, med gjennomsnittlig antall leser per HincII nettsted for å få antall ribonucleotides per enkelt strand pause, (dvs. antallet ribonucleotides per mitokondrie molekylet).
Representative Results
Illustrerer metodene som er beskrevet ovenfor, representant dataene ble generert analysere menneskelig Mitokondrielt DNA fra HeLa celler12. Figur 2B viser den summerte lest hele HincII områder i tunge (HS) og lys strand (LS) av menneskelig mtDNA etter KCl behandling (venstre panel). Rundt lokalisere 70% av alle oppdaget 5´-ender til cut-nettsteder, demonstrere høy virkningsgrad på HincII fordøyelsen. Behandle biblioteker med KOH til hydrolyze DNA på innebygde ribonucleotides reduserer antall leseoperasjoner på HincII steder 40% (figur 2B, høyre panel). Dette er forventet stort antall 5´-ender genereres ved ribonucleotide innlemmelse, og antyder en tilstrekkelig bibliotek-kvalitet. Figur 2C viser den lokalisering og hyppigheten av 5´-ender (grønn) etter KCl behandling og leser generert av HydEn-seq (rosa) etter KOH behandling, oppdage både gratis 5´-ender og ender generert på ribonucleotides av alkalisk hydrolyse. Gratis 5´-ender og ribonucleotides lokalisere til HS av menneskelig mtDNA vises i informasjonsvinduet og de lokalisere til LS er vist i panelet til høyre. Det relative antallet lese rådata på ribonucleotides (figur 2D, øvre panel) eller HincII områder (nedre panel) på HS og LS av mtDNA viser, henholdsvis en 14-fold eller 31-fold sterkere dekning av LS i forhold til HS, mens en lignende skjevhet ikke var observert i kjernefysisk DNA. Denne strand skjevhet kan forklares med forskjellige forskjellen i base sammensetning av de to trådene og illustrerer betydningen av normalisering til leser på HincII steder.
Normalisere lese teller til HincII gir et kvantitativt mål for antall ribonucleotides per mitokondrie genomet (figur 3A). Som illustrert i figur 3B, viser lest etter KOH behandling for hver ribonucleotide normalisert til sekvens sammensetningen av hver strand en annerledes enn 1, angir en ikke tilfeldig fordeling av antyder en distinkt ribonucleotide mønster og en høy biblioteket kvalitet. Det er upåvirket av tidligere fordøyelsen med HincII, bekrefter enzymets cleavage spesifisitet. Normalisere lest ved innebygde ribonucleotides til de på HincII cleavage nettsteder og genom nukleotid innholdet, genererer kvantitativt mål på hvor mange av hver ribonucleotide er innlemmet per 1000 komplementære baser ( Figur 3 c).
Figur 1: skjematisk for DNA behandling og biblioteket forberedelse. (1) hele genomisk DNA er kløyvde av HincII for normalisering i påfølgende kvantifisering av ribonucleotides, generere Butte endene på HincII steder (svart pilspiss). (2) i DNA er behandlet med KOH til hydrolyze på ribonucleotide områder, fører til 2´, 3´-sykliske fosfat (rød pentagon) på 3´-ender og gratis 5´-OH ender. (3) 5´-OH ender er fosforylert av T4 Polynucleotide Kinase 3´-fosfatase-minus. (4) alle 5´-ender bærer en fosfatgruppe er samskrevet til ARC140 oligonucleotide av T4 RNA ligase. (5) andre strand er syntetisert T7 DNA Polymerase og ARC76-77 oligonucleotides med tilfeldige N6 sekvenser. (6) bibliotek forsterkes av et Hi-Fi-DNA Polymerase bruker ARC49 og en av ARC78 til ARC107 indeks primere som inneholder en unik strekkode for multiplexing. (7) 5´-ender ligger ved sammen-end sekvensering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: metoden validering. (A) representant electropherograms generert ved hjelp av en automatisert geleelektroforese system for å fastslå kvaliteten på generert biblioteker behandlet med KOH eller KCl. (B) Summarized signal på HincII steder i tunge (HS) og lys strand (LS) menneskelige mtDNA etter KCl (venstre panel) eller KOH (høyre panel) behandling. (C) Circos figur av gratis 5´-ender (grønn) og HydEn-Seq (gratis 5´-ender og ribonucleotides, magenta) i HS (venstre panel) og LS (høyre panel) menneskelige mtDNA. Toppene er normalisert til per million leser og den høyeste fjelltoppen er tilpasset maksimalt antall leser av HydEn-seq biblioteket. (D) Summarized rå leser ved ribonucleotides (øvre panel) og HincII områder (nedre panel) i tunge (H) og light (L) strand i menneskelig mtDNA (Mito.) eller i revers (RV) eller fremover (FW) strand i kjernefysiske (Nuc.) DNA. B, C og D er tilpasset fra referanse12. Feilfelt representerer standard feil av gjsnitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representant resultater. (A) relative antall ribonucleotides normalisert til leser på HincII steder for KOH behandlet biblioteker på tunge (H) eller lys (L) strand. (B) forholdet ribonucleotide identitet mtDNA genomet komposisjon for KOH behandlet (KOH) og HincII kløyvde med KOH behandlet (HincII + KOH) bibliotekene på tunge (H) eller lys (L) strand av mtDNA. (C) Ribonucleotide frekvens normalisert til 1000 komplementære baser for HincII og KOH behandlet biblioteker på tunge (H) eller lys (L) strand av mtDNA. Tallene er tilpasset fra referanse12. Feilfelt representerer standard feil av gjsnitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| navn | Sekvens | |||
| ARC49 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC76 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNN * N * N | |||
| ARC77 | AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC * EN * C | |||
| ARC78 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC84 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC85 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC86 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||
| ARC87 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA | |||
Tabell 1: Oligonucleotides. Oppført er oligonucleotides brukes for HydEn-Seq. Modig ansikt angir indeksering. * angir en phosphorothioate bånd. ARC140 inneholder en 5´-amino gruppe i stedet for en 5´-OH gruppe, i kombinasjon med et C6 linker. Denne endringen reduserer dannelsen av ARC140 concatemers under hemorroider.
Discussion
Her presenterer vi en teknikk for å samtidig kart og kvantifisere ribonucleotides i gDNA og mtDNA spesielt enkle innføringen av DNA cleavage ved sekvens bestemte områder i genomet som et tillegg til etablerte HydEn-seq-protokollen. Mens denne studien fokuserer på menneskelige mtDNA, ble opprinnelig HydEn-seq metoden utviklet i Saccharomyces cerevisiae, illustrerer metodens oversettelse til andre organismer12,16.
For pålitelig resultatene fra denne tilnærmingen, noen viktige skritt bør bemerkes: (A) siden sekvensering kort ligate til alle tilgjengelige 5´-ender, er det avgjørende å jobbe med svært intakt DNA. DNA skal isoleres biblioteker gjøres helst umiddelbart etter DNA isolasjon og DNA kan lagres på 20 ° C. Det anbefales ikke å lagre DNA i kjøleskapet for lenge eller å fryse og tine det gjentatte ganger. (B) for å generere egnet biblioteker med denne metoden, er det avgjørende å utføre KOH behandling av DNA i inkubasjon ovn, snarere enn en oppvarming blokk, sikre homogen oppvarming av hele utvalget og kvantitative hydrolyse. (C) er det viktig å kontrollere kvaliteten på biblioteker før pooling og sekvenser. DNA bør kvantifiseres og analysert ved hjelp av en automatisert geleelektroforese system for å sikre tilstrekkelige mengder biblioteket DNA, bekrefte riktig fragment størrelser, og se etter primer dimers.
For en meningsfull dataanalyse er det også viktig å merke seg at informativ verdien av denne metoden er avhengig av egnede kontroller å vurdere bakgrunn teller og orden eller strand biases. Vi oppnå rutinemessig en kartlegging effektivitet i KCl prøver av nær 70% når bare fordøye med sekvensen bestemte endonuclease (figur 2B, venstre panel). I tillegg er det viktig å bekrefte at endonuclease behandling ikke påvirker totalt påvisning av innarbeidet ribonucleotides ved å sammenligne HincII behandlet og ubehandlet prøver (figur 3B). I disse eksperimentene, har vi brukt HincII for å innføre stedsspesifikke kutt, men andre Hi-Fi-begrensning enzymer kan også brukes.
Protokollen kan tilpasses å studere andre typer DNA lesjoner som kan sendes til 5´-fosfat eller 5´-OH ender. Nøyaktigheten av resultatene er avhengig av spesifisitet av behandling og krever egnede kontroller (f.eks villtype eller ubehandlet) for bekreftelse. Videre, når du tilpasser denne metoden for andre programmer eller for bruk med andre organismer, bør man vurdere at metoden i sin nåværende installasjonsprogrammet krever ca 1 µg av DNA som behandles i et bibliotek. Siden antall ender er avhengig av antall innebygde ribonucleotides, som varierer avhengig av organismen eller mutant, prøver inkludert et lavere antall ribonucleotides ville kreve flere innkommende DNA for å generere et tilstrekkelig antall ender i den etterfølgende biblioteket konstruksjon. Tilsvarende, hvis DNA-prøver har en mye høyere antall ribonucleotides, vil det også kreve bruke mindre inn DNA for å oppnå optimale forhold for hemorroider og andre strand syntese PCR forsterkning. Det er bemerkelsesverdig at biblioteket bygging som beskrevet i denne protokollen også generert angående kjernefysiske genomet (som vist i figur 2D) og bare dataanalyse ble fokusert på mtDNA. Dette illustrerer at større genomer med moderat lavere ribonucleotide frekvenser er også fanget av denne metoden.
Når denne metoden, visse begrensninger bør tas i betraktning: selv om denne metoden bør, i teorien være gjelder for nesten alle organisme, en passende referanse genom er nødvendig for justering av leser. Videre representerer resultatene fra våre Protokoll lest fra et stort antall celler. Bestemt ribonucleotide innlemmelse mønstre av en gruppe celler kan ikke identifiseres ved denne tilnærmingen. Hvis ribonucleotides er tilordnet i større genomer med et svært lavt antall ribonucleotides, det kan være utfordrende for å diskriminere ribonucleotides fra tilfeldige kutt og aktuelle kontroller er derfor nødvendig.
Metoden som beskrives her, utvider tilgjengelig i vivo teknikker som HydEn-Seq16, Ribose-Seq17, Pu-Seq18eller emRiboSeq19. Disse dra nytte av den innebygde ribonucleotides' følsomhet for alkaliske eller RNase H2 behandling, henholdsvis ansette neste generasjons sekvensering å identifisere ribonucleotides genomet hele, som gjør deres kartlegging og sammenligning av relativ innlemmelse. Av cleaving DNA sekvensen spesielt, som beskrevet ovenfor, i tillegg til alkalisk hydrolyse på innebygde ribonucleotides, kan lest for ribonucleotides være normalisert til nettstedene cleavage, slik at ikke bare identifikasjon og tilordning av ribonucleotides, men også deres kvantifisering for hver DNA-molekylet. Anvendelsen av vår teknikk i sammenheng med sykdommer relatert til utryddelse, DNA-reparasjon og TLS kunne gi en dypere forståelse av rollen ribonucleotides i underliggende molekylære mekanismer og genom integritet generelt.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av svenske Research Council (www.vr.se) gir ARC (2014-6466 og svensk Foundation til strategisk forskning (www.stratresearch.se) til ARC (ICA14-0060). Chalmers Tekniska högskola gitt økonomisk støtte til MKME under dette arbeidet. Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0201S | |
| 10x T4 RNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0216L | |
| 1x PBS | Medicago | 09-9400-100 | dissolve 1 tablet in H2O to a final volume of 1 L |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 33539-1L-GL-R | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| 50 mL Centrifuge Tube | VWR | 525-0610 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP, 10 mM) | New England Biolabs | P0756S | dilute with EB to 2 mM |
| Agilent DNA 1000 Kit | Agilent Technologies | 5067-1504 | |
| BSA, Molecular Biology Grade (20 mg/mL) | New England Biolabs | B9000S | diltue with nuclease-free H2O to 1 mg/mL |
| Buffer EB | QIAGEN | 19086 | referred to as EB |
| CleanPCR paramagnetic beads | CleanNA | CPCR-0050 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix (10 mM each) | New England Biolabs | N0447L | dilute with EB to 2 mM |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61965026 | |
| DynaMag 96 Side | Thermo Fisher | 12331D | |
| Ethanol 99.5% analytical grade | Solveco | 1395 | dilute with milliQ water to 70% |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA, 0.5 M) | Sigma-Aldrich | 03690-100ML | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10500056 | |
| HEPES buffer pH 8.0 (1 M) sterile BC | AppliChem | A6906,0125 | |
| Hexammine cobalt(III) chloride (CoCl3(NH3)6) | Sigma-Aldrich | H7891-5G | dissolve in nuclease-free H2O for 10 M solution, sterile filter. CAUTION: carcinogenic, sensitizing and hazardous to aquatic environment. |
| HincII | New England Biolabs | R0103S | supplied with NEBuffer 3.1 |
| Hybridiser HB-1D | Techne | FHB4DD | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | Kapa Biosystems | KK2602 | |
| Lysis buffer | 50 mM EDTA, 20 mM HEPES, NaCl 75 mM, Proteinase K (200 µg/mL), 1% SDS | ||
| Micro tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Microcentrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000014 | |
| Microcentrifuge MiniStar silverline | VWR | 521-2844 | |
| Multiply µStripPro 0.2 mL tube | Sarstedt | 72.991.992 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| Phenol – chloroform – isoamyl alcohol (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617-500ML | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 26764.232 | dissolve in nuclease-free H2O for 3 M solution, sterile filter |
| Potassium hydroxide (KOH) | VWR | 26668.296 | dissolve in nuclease-free H2O for 3 M solution, sterile filter |
| Proteinase K | Ambion | AM2546 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32850 | CAUTION: Contains flammable and toxic components |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | CAUTION: Contains flammable and toxic components |
| Refrigerated Centrifuge 4K15 | Sigma Laboratory Centrifuges | No. 10740 | |
| SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553-035 | |
| Sodium acetate buffer solution, pH 5.2, 3 M (NaAc) | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| Sodium chloride (NaCl) | VWR | 27810.295 | dissolve in nuclease-free H2O for 5 M solution, sterile filter |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (3' phosphatase minus) | New England Biolabs | M0236L | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204L | supplied with PEG 8000 (50%) |
| T7 DNA Polymerase (unmodified) | New England Biolabs | M0274S | supplied with 10x T7 DNA Polymerase Reaction Buffer |
| TE Buffer | Invitrogen | 12090015 | |
| ThermoMixer F2.0 | Eppendorf | 5387000013 |
References
- Traut, T. W. Physiological Concentrations of Purines and Pyrimidines. Mol. Cell. Biochem. 140, 1-22 (1994).
- McElhinny, S. A. N., et al. Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 4949-4954 (2010).
- Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17, 350-363 (2016).
- Clausen, A. R., Zhang, S., Burgers, P. M., Lee, M. Y., Kunkel, T. A. Ribonucleotide incorporation, proofreading and bypass by human DNA polymerase delta. DNA Repair. 12, 121-127 (2013).
- Potenski, C. J., Klein, H. L. How the misincorporation of ribonucleotides into genomic DNA can be both harmful and helpful to cells. Nucleic Acids Res. 42, 10226 (2014).
- Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. RNase-sensitive DNA modification(s) initiates S. pombe mating-type switching. Gene. Dev. 18, 794-804 (2004).
- Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. Ribonucleotides Are Signals for Mismatch Repair of Leading-Strand Replication Errors. Mol. Cell. 50, 437-443 (2013).
- Ghodgaonkar, M. M., et al. Ribonucleotides Misincorporated into DNA Act as Strand-Discrimination Signals in Eukaryotic Mismatch Repair. Mol. Cell. 50, 323-332 (2013).
- DeRose, E. F., Perera, L., Murray, M. S., Kunkel, T. A., London, R. E. Solution Structure of the Dickerson DNA Dodecamer Containing a Single Ribonucleotide. Biochemistry. 51, 2407-2416 (2012).
- Li, Y. F., Breaker, R. R. Kinetics of RNA degradation by specific base catalysis of transesterification involving the 2 '-hydroxyl group. J. Am. Chem. Soc. 121, 5364-5372 (1999).
- McElhinny, S. A. N., et al. Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA. Nat. Chem. Biol. 6, 774-781 (2010).
- Berglund, A. K., et al. Nucleotide pools dictate the identity and frequency of ribonucleotide incorporation in mitochondrial DNA. Plos Genet. 13, (2017).
- Brown, J. A., Suo, Z. C. Unlocking the Sugar "Steric Gate" of DNA Polymerases. Biochemistry. 50, 1135-1142 (2011).
- Sparks, J. L., et al. RNase H2-Initiated Ribonucleotide Excision Repair. Mol. Cell. 47, 980-986 (2012).
- Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. The Major Roles of DNA Polymerases Epsilon and Delta at the Eukaryotic Replication Fork Are Evolutionarily Conserved. Plos Genet. 7, (2011).
- Clausen, A. R., et al. Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation. Nat. Struct. Mol. Biol. 22, 185-191 (2015).
- Koh, K. D., Balachander, S., Hesselberth, J. R., Storici, F. Ribose-seq: global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA. Nat. Methods. 12, 251 (2015).
- Keszthelyi, A., Daigaku, Y., Ptasinska, K., Miyabe, I., Carr, A. M. Mapping ribonucleotides in genomic DNA and exploring replication dynamics by polymerase usage sequencing (Pu-seq). Nat. Protoc. 10, 1786-1801 (2015).
- Ding, J., Taylor, M. S., Jackson, A. P., Reijns, M. A. M. Genome-wide mapping of embedded ribonucleotides and other noncanonical nucleotides using emRiboSeq and EndoSeq. Nat. Protoc. 10, 1433-1444 (2015).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17, 10-12 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10, (2009).
