Summary
Это исследование свидетельствует о полезности и простота расширения измерение количественных клеточной мембраны и его корреляция клей способности клеток. Как пример мы показываем здесь что связанных с Dickkopf белком 3 (DKK3) способствует формированию более lobopodia и адгезии клеток в Адренокортикальной рак клеток в пробирке.
Abstract
Расширение репертуара клеточной мембраны модулирует различных злокачественных поведение раковых клеток, включая их клей и мигрирующих потенциалов. Способность точно классифицировать и подсчитать ячейки расширений и измерить эффект на клетки клей потенциала имеет решающее значение для определения как клетки сигнализации поведение клеток рака влияние события и агрессивность. Здесь мы описываем в vitro разработки и использования клеток количественного определения метода расширения в сочетании с assay способности адгезии в установленных в vitro модели для адренокортикальной карциномы (АКК). В частности мы тестируем воздействия DKK3, подавитель предполагаемого опухоли и про дифференциация фактором, на фенотип расширение мембраны клеточной линии АКК, SW-13. Мы предлагаем эти анализы предоставлять относительно простые, надежные и легко интерпретировать данные метрик для мер эти характеристики в различных экспериментальных условиях.
Introduction
Dysregulated WNT сигнализации играет важную роль в адренокортикальной злокачественных1. Методы, используемые в данном исследовании расследовать ли глушителей из DKK3, негативный регулятор WNT сигнализации, представляет собой событие дифференцировке в коры надпочечников и способствует формированию опухоли в контексте изменения клеток расширение репертуара. DKK3 — 38 кДа выделяется гликопротеин с пептидной сигнал N-стержня и предыдущие исследования показали его насильственного выражение привели к аресту клеточного цикла, тормозится агрессивное поведение злокачественных и вспять эпителия мезенхимальных 2переход.
Злокачественные поведение адренокортикальной карциномы (АКК) и другие виды рака, в части, под влиянием опухолевых клеток способность взаимодействовать с окружающих поверхностей, включая внеклеточного матрикса, который в свою очередь облегчает вторжение клеток опухоли и миграции3. Время роль конкретных клеточной мембраны расширений в прогрессии рака чаще проявляется в различных контекстах, главным образом через формирование filopodia. Например чтобы побудить filopodia формирования и поощрения опухолевых клеток вторжения4было установлено гиперэкспрессия L-типа кальциевых каналов. Аналогично Башчаршия, актина, связывая протеин минимально выраженные в нормальной ткани, также гиперэкспрессия в раковых клетках в ассоциации с filopodia формирования5. Lobopodia формирования позволяет незлокачественных фибробластов эффективно перенести через внеклеточных матрицы, однако, было показано, что клетки фибросаркома полагаются на металлопротеиназы деятельности вместо lobopodia для облегчения миграции клеток и вторжения6. Мы показали, что опухолевые супрессоры, включая рас Ассоциация домена семьи 1 изоформы (RASSF1A) и DKK3, может работать для изменения цитоскелета элементов и поощрения формирования lamellipodia и загнать в угол инвазивные свойства7,8.
Таким образом важно, чтобы характеризовать эффекты генов, участвующих в канцерогенеза и их отношения к клеточной мембраны расширение изменения, в частности оценки формирования filopodia, lobopodia и lamellipodia в условиях испытания. Текущее состояние оф-арт методы включают в себя использование микроскопии все более изощренные методы, люминесцентные маркировки и/или сложных компьютерных алгоритмов для сбора данных и интерпретации. Хотя эти методы предоставляют новые и мощные аналитические инструменты, их сложность ограничивает их широкого использования и адаптации в биологии клеток экспериментов. Кроме того точную количественную оценку и наблюдение изменений в морфологии клеток расширение не является обычно измеренных9,10. Напротив мы представляем технику, которая точно количественно изменения расширения клеток с помощью стандартных микроскопические и легко могут быть приспособлены в vitro методов. Эти методы также количественную оценку каждой ячейки тип расширения одновременно для каждой ячейки проанализированы и определить общие изменения в репертуаре расширение клеточной мембраны. Мы также показать, как эти изменения могут относиться к адгезионные свойства ячейки.
В качестве примера экспериментальный мы будем использовать ранее созданные ячейки линия SW-13 места для SW-DDK3, которая была стабильно transfected с pCMV6-вход/DKK3 плазмиды векторов и конститутивно overexpresses DKK3, дифференцирующим фактором в надпочечников. Non-transfected SW-13 клетки и клетки SW-13, стабильно transfected с пустой вектор (pCMV6-вход), Места для SW-нео, будет служить экспериментальных элементов управления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. клетки расширение характеристики
- Поддерживать SW-13, SW-нео и SW-DKK3 клетки в стандартной увлажненные инкубатор 37.0 ° c и 5% CO2 в среде орла изменения Дульбекко дополненные плода бычьим сывороточным 10% и 10 000 ед/мл пенициллина и стрептомицина (обозначенного как «средство роста»).
- Подсчитать ячейки с помощью Горяева и пластина 5 000 ячеек на хорошо для SW-13, SW-нео и SW-DKK3 линий в отдельные пластины 6-Ну и растут на ночь в средство роста на стерильных стеклянных coverslips.
- После ночи роста, для каждой скважины, аспирационная среднего роста, вымыть клетки с 1 мл теплой фосфат амортизированное saline (PBS), а затем исправить клетки с 1 мл раствора формальдегида 3,7% за 10 мин.
- Аспирата формальдегида и пятно клеток в каждой скважине с 1 мл 0,05% фиолетовый кристалл для 30 min. мыть избыток краски, с помощью трех моет 1 мл деионизированной воды.
Примечание: В зависимости от уровня поглощения краски, несколько дополнительных моет может быть необходимо удалить фон, окрашивание содействовать визуализации ячейки.- С помощью тонкой наконечником щипцы, получить coverslips и поместите их лицевой стороной вниз на слайде помечены стекла с капли реагента четкие установки.
- Под микроскопом света случайным образом выбираете 20 просмотров non перекроя клеток от каждого coverslip для расширения assay клетки.
- Возьмите микрофотографиями при 400-кратном каждого поля зрения. Прямо подсчитать количество каждого типа расширения для каждого представителя 20 клеток.
Примечание: таким образом, 20 изолированных клеток должны рассматриваться для каждого проверяемое условие для обеспечения надежных результатов. Filopodia были определены сотовой расширений с базой 5 микрон или меньше и одной вершиной. Lobopodia были определены сотовой расширений с базой 5 до 20 микрон длиной содержащие расширений с несколькими Апицес. Lamellipodia были определены путем расширения клеток, которые больше чем 20 мкм в длину и с или без Апицес. В зависимости от типа испытания клеток размеры ячейки расширений могут различаться и может потребоваться уточнение определения параметров.
- Возьмите микрофотографиями при 400-кратном каждого поля зрения. Прямо подсчитать количество каждого типа расширения для каждого представителя 20 клеток.
- Определите среднее количество расширения каждой ячейки в каждой ячейке тип (т.е., SW-13, SW-нео, SW-DDK) через 6 скважин изучены.
- С помощью односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) статистический тест, сравните различия в средний процент клеточной мембраны расширений среди различных тестовых типов клеток.
2. приклеивание Assay
- Поддерживать SW-13, SW-нео и SW-DKK3 клетки в стандартной увлажненные инкубатора в 37.0 ° C и 5% CO2 в среднего роста.
- С помощью Горяева, рассчитывать и пластины 100000 клеток SW-13, SW-нео и SW-DKK3 за хорошо в отдельные пластины 6-Ну и расти на ночь в среднего роста.
- Протестированы семян 6-ну пластины для каждого типа клеток, используя одну плиту для каждой из 6 точек назначенное время испытания ниже.
Примечание: Время может различаться для различных типов клеток.
- После ночи инкубации вымыть клетки с теплой PBS один раз, а затем добавить 0,5 мл 1 x неферментативного клеток диссоциации решение каждой скважины.
- Вихрем пластину распространить решение диссоциации клеток. Аспирационная пластину назначенный в определенное время точках (т.е., 1, 2, 3, 5, 10 и 15 мин) и затем смывают теплым раствором PBS 1 мл три раза.
- Между моет аккуратно коснитесь пластины для отсоединения слабо прилагаемый клетки.
- Аспирационная оставшиеся PBS и исправить остальные клетки прилагается к пластине с 1 мл раствора формальдегида 3,7% за 10 мин.
- Запятнать клетки с 1 мл 0,05% фиолетовый кристалл для 30 минут, затем промыть избыточного красителя с 1 мл деионизованной воды. Титруйте мыть содействовать визуализации ячейки.
Примечание: В зависимости от уровня поглощения краски, несколько дополнительных мойки могут быть необходимы для содействия визуализации ячейки. - С помощью световой микроскоп на 100 крат, количество оставшихся придает ячейки в каждой скважине для каждой пластины.
Примечание: Использование транспарентных правителей или маркировки тонкой ручкой направляющих на нижней стороне пластины поможет избежать повторного подсчета же клеток. - Определите среднее количество вложенных ячеек на хорошо для каждой пластины.
- Сравните скорость отряда ячейки между SW-13, SW-нео и SW-DDK3 клетки за определенный период времени с помощью двухсторонней статистического теста ANOVA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя выше анализов, эффекты Сверхэкспрессия DKK3 на расширение морфологии клеток и клеток адгезионные свойства были протестированы в установленных АКК клеточная линия SW-13, в пробирке. Клеток, экспрессирующих DKK3 вызвал стабильно transfecting SW-13 клетки с Myc-DDK тегами плазмида pCMV6-вход/DKK3 векторные и назначил SW-DKK3. Аналогичным образом клетки стабильно transfected с пустой вектор pCMV6-записи были созданы как transfection и пассированый управления и определяется как SW-нео. SW-13 клетки были использованы в качестве дополнительной родительской ячейки. Сверхэкспрессия DKK3 в SW-DKK3 было подтверждено Количественная ПЦР в реальном времени и западной помарки методы8.
Кратко протестированных клетки SW-13, SW-нео и SW-DKK3 выращивались на ночь в 6 хорошо пластины на обложке скользит. Клетки затем были исправлены с формальдегидом и витражи с Фиолетовый Кристалл. Расширение характеристики клеток были затем количественно под микроскопия на параметров, описанных выше. На анализе, SW-DKK3 клетки отображаются более дифференцированной фенотип отметил увеличение lobopodia и разнонаправленные клеток полярности (p = 0,01, односторонняя ANOVA, рис. 1 и рис. 2), указывающие на отсутствие направленного подвижности. В отличие от родительскими SW-13 и SW-нео клетки поддерживать полярности и отображаются более filopodia расположены в плоскости ориентации (p = 0,01, односторонняя ANOVA, рис. 1 и рис. 2)8.
Чтобы определить, выполняются ли увеличение lobopodia формирования изменены свойства ячейки привязанности, мы assay прилипания клетки. Кратко клетки были выращены на ночь и ячейки отряда была исполнена раствором диссоциации неферментативного клеток в прогрессивное время интервалов до 15 мин клетки затем фиксировали с формальдегидом, окрашенных с Фиолетовый Кристалл и рассчитывает с помощью света Микроскоп. Клетки SW-DKK3 показало значительно большую близость вложений по сравнению с SW-13 и SW-нео клетки (p < 0.01, 2-полосная ANOVA, рис. 3). Эти результаты показывают, что DKK3 способствует формированию lobopodia, который в свою очередь способствует ячейки насадку8.
Рисунок 1: насильственное проявление DKK3 изменяет мембраны клетки расширения. SW-13 (A), (B)SW-нео и SW-DKK3 (C) клетки выросли на coverslips стекла, фиксировали с формальдегидом, окрашенных с Фиолетовый Кристалл и образы. Микрофотографиями, взяты с использованием световой микроскоп с увеличением 400 x. SW-13 и SW-нео клетки образуется главным образом filopodia (красные стрелки) и lamellipodia (голубая дуга) клеток расширений. В противоположность этому SW-DKK3 клетки образуется больше lobopodia (маленький зеленый дуги), с почти полное отсутствие lamellipodia и очень немногие filopodia. В то время как клетки (B) SW-13 (A) и SW-нео, как представляется, поляризованные (оранжевые стрелки) с filopodia на переднем крае и lamellipodia на краю отстает, SW-DKK3 клеток (C) показал равномерно разнонаправленный lobopodia. Эксперименты были проведены в двух экземплярах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: DKK3 способствует формированию lobopodia. Относительное представление filopodia, lobopodia и lamellipodia в клетку для каждого типа клеток были рассчитаны табулированию клеток расширения на отдельные клетки. Клетки в двадцати микрофотографиями произвольно принятые микроскопическом поле мнений (400 x увеличение) SW-13, SW-нео и SW-DKK были использованы для количественной оценки. Планки погрешностей указано стандартное отклонение и (*) указывает p < 0.01 с помощью односторонней ANOVA, представляющих значительное увеличение числа lobopodia в SW-DKK клеток. В общей сложности 20 клеток были изучены для каждого типа испытания ячейки и эксперименты были проведены в двух экземплярах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: DKK способствует клеточной адгезии. SW-13 сто тысяч, SW-нео и SW-DKK3 клеток на хорошо 6-ну плит было позволено расти на ночь и лечили для отряда в назначенное время точках (ось x). Клетки, остающиеся прилагаемый фиксировали, витражи и подсчет и процент клеток, оставшихся прилагаемый были построены (ось y). Планки погрешностей указать стандартное отклонение и (*) указывает p < 0.01 и (*) указывает p < 0,001, используя 2-полосная ANOVA, представляющих значительное увеличение SW-DKK ячейки прочности крепления. Каждый эксперимент начался с 100000 клеток и эксперименты были проведены в двух экземплярах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем в vitro количественный метод для характеристики клеток расширения с легкостью, несколько Пит Фолс и надежный воспроизводимости результатов, которые могут применяться для различных условий теста. Кроме того простой, количественно адгезии и/или подвижности анализов может выполняться одновременно для соотнесения потенциальных функциональную значимость наблюдаемых изменений в клеточной мембраны расширений.
Однако эти методы могут представить некоторые потенциальные ограничения. Во-первых критерии, указанные здесь для выявления различных типов клеток расширений основаны на адренокортикальной морфологии клеток SW-13 и следовательно скорее всего нужно уточнение классификации параметров при применении других типов клеток и/или экспериментальных условиях. Кроме того в расширенный курс эксперименты, потенциального влияния клеточной мембраны расширение изменений на гибель клеток и клеточного цикла должны рассматриваться.
Во-вторых протокол может полагаться на потенциальных индивидуального вызова экзаменатор, которые могли бы ограничить воспроизводимость анализа из-за различия между наблюдателя. Большое количество клеток, которые рассматриваются для каждой группы тестов, вероятно, преодолевает частью этой предвзятости; в частности, когда 20 клетки расмотрены для калибровочных. Включение нескольких лиц для выполнения вызова в ослепленный моды расширение предлагается для смягчения потенциальных субъективные вызова предвзятости.
Наконец, следует позаботиться когда связывание изменения в ячейке расширение класса switch с изменения в свойства вложенного, где упрощенная версия адгезионные свойства могут быть результатом изменены предпочтения для вложения субстрат вместо изменены сродство для испытания субстрата. Муфта переключатель класс расширения клеток с миграции или вторжения в контексте различных компонентов внеклеточных матрица пояснить наблюдаемое адгезионные свойства.
В заключение протокола, изложенные здесь обеспечивает простой и надежный способ для измерения функциональное значение переключателя расширение клеточной мембраны при различных условиях испытания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
ОГСЕ Грант фонда финансирование этой работы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11965-092 | Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin |
| Deulbeco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | 1X solution, used directly |
| 3.7% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute stock solution |
| 0.05% crystal violet | Harleco | 192-12 | Dilute stock solution |
| De-ionized water | NA | NA | NA |
| Microscope with 400X magnification | NA | NA | NA |
| 6-well plates | Corning | 353046 | NA |
| Cell dissociation solution non-enzymatic 1X | Sigma-Aldrich | C5914 | 1X solution, used directly |
References
- Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management. Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).
- Veeck, J., Dahl, E. Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3. Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).
- Jacquemet, G., et al. L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling. Nat Commun. 7, 13297 (2016).
- Machesky, L. M., Li, A. Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis. Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).
- Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells. J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).
- Korah, R., et al. Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma. Molecular cancer. 12, 87 (2013).
- Cheng, J. Y., et al. A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis. BMC cancer. 17 (1), 164 (2017).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).
- Cliffe, A., et al. Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration. Nat Commun. 8, 14905 (2017).
