Se movendo para cima: Um simples e flexível em Vitro invasão tridimensional protocolo do ensaio

Summary

Este protocolo descreve um ensaio de invasão vertical invertida que poderia ser usado para quantificar os recursos de migração e invasão de células em uma configuração tridimensional, preservando o microambiente celular. Este ensaio é adequado para células raras e/ou sensíveis.

Abstract

Embora a invasão 3D ensaios têm sido desenvolvidos, persiste o desafio de estudar células sem afetar a integridade do seu microambiente. Ensaios de 3D tradicionais tais como a câmara de Boyden exigem que as células são deslocadas do local cultura original e mudou-se para um novo ambiente. Não só faz isso atrapalhar os processos celulares que são intrínsecos para o microambiente, mas muitas vezes resulta em uma perda de células. Estes problemas são especialmente desafiadoras quando se lida com as células que são raros ou extremamente sensível ao seu microambiente. Aqui, descrevemos o desenvolvimento de um ensaio de invasão 3D que evita as duas preocupações. Neste ensaio, as células são banhadas dentro de um pequeno bem e uma matriz de ECM contendo um quimiotático é colocada no topo das células. Isto requer nenhum deslocamento de célula e permite que as células invadir para cima dentro da matrix. Neste ensaio, invasão da célula, bem como a morfologia da célula pode ser avaliada dentro do gel de colágeno. Usando este teste, podemos caracterizar a capacidade invasiva das células de raras e sensíveis; as células híbridas resultantes da fusão entre células de câncer de mama MCF7 e mesenquimais/multipotentes haste/estroma células (MSCs).

Introduction

Motilidade celular é um processo fisiológico e de desenvolvimento normal das células. No entanto, as mudanças no padrão e a capacidade das células para migrar e invadir estão associadas com condições patológicas, incluindo doenças inflamatórias e câncer metástase^1,2,3. Metástase é, sem dúvida, o aspecto mais mal compreendido em câncer. Para metástase, as células cancerosas deve degradar a matriz extracelular (ECM), invadir o tecido local e intravasate. Uma vez em circulação, as células cancerosas vão divulgar o site distante, extravasate e formar tumores secundários. Portanto....

Protocol

Nota: Este protocolo é descrito no McArdle et al . ¹¹. um cronograma é fornecido na Figura 1.

1. preparação da placa de cultura

1. Lave o prato de 35mm cultura contendo um vidro de 10 mm-fundo bem com 1 mL de ácido clorídrico de 1 M (HCl) por 15 min abaixar a hidrofobicidade do vidro-fundo.
2. Lave a placa de cultura duas vezes com 1 mL de solução salina tampão de fosfato (PBS) para se livrar de todo o HCl.
3. Lave a placa de cultura duas vezes com 1 mL de etanol a 70%.
4. Lave a placa de cultura com 1 mL de meio de cultura celular específica (aqui, u....

Results

Nós usamos um prato de cultura 35mm com um vidro inferior e rato cauda de colágeno para desenvolver e otimizar uma invasão 3D em vitro ensaio protocolo. Usando este ensaio, nós mostramos aquele peito de células cancerosas MCF7 e MSC células poderiam invadir para o gel de colágeno a uma distância média de 0,04 ± 1,8 µm e 41,3 ± 76.0 µm respectivamente, após 48 h quando IGF1 (18.6 ng/mL) foi usado como quimiotático (Figura 2). Mais importante, nós most.......

Discussion

Aqui, descrevemos um ensaio simples invasão vertical invertida que é conveniente para uma variedade de tipos de células, incluindo células que são raras e/ou dependente seu microambiente. Neste ensaio 3D invasão, as células permanecem em seu microambiente original em são cobertas pelo gel de colágeno contendo um quimiotático. As células então migram e invadem em colágeno. Neste ensaio, as células podem ser manchadas e facilmente monitoradas dentro do gel. A simplicidade e a reprodutibilidade deste teste o torna uma ferra.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MatTek P35G-1.5-10C	MatTek Corporation, Ashland, MA	P35G-1.5-10-C	pratos de fundo de vidro fosco
Colágeno de cauda de rato I	Corning, Corning, NY, EUA	354236	Gel de colágeno
Ácido clorídrico	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 EUA	H1758	HCl
Solução salina tamponada com fosfato	Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, EUA	10010023	Pbs
10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA	D2429	10X DMEM
Bicarbonato de sódio	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA	S5761	NaHCO3
Microscópio Fluorescente Confocal	Olympus America, Center Valley, PA, USA	Olympus IX81	Confocal
Soro	Fetal Bovino DefinidoGE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, EUA	SH30070.03	FBS
Ti:Microscópio de varredura a laser multifóton Sapphire	Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, EUA	40x NA 0.8 objetiva	MPLSM
Imaris software	Bitplane Inc. Zurique, CH	Imaris 7.5.2	Software Imaris
DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, EUA	D9542	DAPI
Paraformaldeído	Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, EUA	50980487	PFA
&alfa;-meio essencial mínimo	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, EUA	M0894
MDA-MB-231	ATCC; Manassas, VA, EUA	HBT-22
MSC	Trivedi e Hematti, lente 20X 2007
UPLAPO	Olympus America, Center Valley, PA, USA	36-064	Olympus UPLSAPO 20X Objetiva