Lente livre de microscopia para a dinâmica e a análise quantitativa de cultura de células aderentes

Resumo

Lente livre de microscopia nos permite monitorar culturas celulares diretamente dentro da incubadora. Aqui descrevemos o protocolo completo usado para adquirir e analisar uma aquisição de 2,7 dia longo de culturas de células de HeLa, levando a um conjunto de dados de 2,2 x 10⁶ medições de morfologia de célula individual e 10584 ciclo celular rastreia.

Resumo

Aqui, demonstramos a lente livre vídeo microscopia nos permite capturar simultaneamente a cinética de milhares de células diretamente dentro da incubadora, e que é possível monitorar e quantificar células únicas ao longo de vários ciclos de célula. Descrevemos o protocolo completo usado para monitorar e quantificar uma cultura de célula HeLa 2,7 dias. Primeiro, aquisição de cultura de células é realizada com um microscópio lente livre de e, em seguida, os dados são analisados seguindo um processo de quatro etapas: comprimento de onda multi reconstrução holográfica, rastreamento de celular, celular segmentação e divisão celular deteção algoritmos. Como resultado, mostramos que é possível reunir um conjunto de dados apresentando mais de 10.000 faixas do ciclo celular e mais de 2 x 10⁶ células morfológica medições.

Introdução

Células de mamíferos cultivadas ao longo de vários ciclos de célula de monitoramento e medição com precisão de pilha tamanho e célula massa seca é uma tarefa desafiadora. Várias técnicas de etiqueta livre ópticas são capazes de realizar esta tarefa^1,2: fase de mudança interferometria³, microscopia holográfica digital (DHM)^{4,5,6, 7}, quadriwave lateral corte interferometria^8,9 e de^10,de tomografia computadorizada quantitativa fase¹¹. Esses métodos têm levado a muitos novos insights sobre a compreensão do ciclo celular de células de mamíferos. No entanto, eles raramente são acoplados com célula automática de algoritmos de controle e sua taxa de transferência permanece limitada, quando a medição da pilha trajetórias massa¹ (N < 20 em respectivamente^{3,4,5 , 6}). daí um método óptico romance é necessário medir trajetórias de massa celular com estatísticas grandes (N > 1000).

Neste trabalho, podemos demonstrar a capacidade da lente livre de microscopia imagem simultaneamente milhares de células diretamente dentro da incubadora, e então quantificar métricas de célula única ao longo de milhares de faixas individuais ciclo celular. Microscopia de lente-livre é uma fase quantitativa de imagem técnica que permite a aquisição de imagem da fase de células densamente em um grande campo de visão (tipicamente de várias dezenas de mm², aqui 29,4 mm²)^12,13 de^{14, ,15}. Várias métricas no nível da célula única são determinadas, por exemplo, área de célula, massa seca, célula espessura, comprimento do eixo principal de célula de célula e^12,de proporção¹⁵, de cada imagem de célula. Então, aplicando um algoritmo de rastreamento de celular, estas características podem ser plotadas para cada célula em função do tempo experimento^14,15. Além disso, ao detectar a ocorrência de divisões celulares em faixas a célula, é possível extrair outras informações importantes, tais como a célula inicial secar massa (logo após a divisão celular), a massa seca celular final (antes da divisão celular) e a célula ciclo de duração, ou seja, o tempo entre duas divisões consecutivas¹⁵. Todas estas medidas podem ser computadas com muito boas estatísticas (N > 1000) desde que o grande campo de visão normalmente permitiria a análise de 200 a 10.000 células em uma única lente livre aquisição.

Para explicar esta metodologia baseada na lente livre de microscopia, descrevemos o protocolo para monitorar e quantificar uma cultura de célula HeLa 2,7 dias. Análise de dados é um processo de quatro etapas, com base em múltiplos de comprimento de onda reconstrução holográfica, rastreamento de celular, segmentação de célula e algoritmos de divisão celular. Aqui é mostrado que a resolução espacial e a taxa de quadros relativamente rápida (uma aquisição a cada 10 minutos), obtidos com esta configuração de lente livre de microscopia é compatível com algoritmos de controle de célula padrão. A análise completa deste dataset resulta na medição de 10.584 célula faixas sobre ciclos completos de célula.

Para resumir, a lente livre de microscopia é uma ferramenta poderosa para monitorar automaticamente milhares de sem rótulo, não sincronizado e células não modificadas por experiência; cada célula sendo controlada ao longo de vários ciclos de célula. Nossas medições, portanto, fornecem o valor médio dos vários parâmetros de célula, mas mais importante, a variabilidade inter celular sobre uma grande população de células.

Protocolo

1. celular cultura monitoramento aquisição

1. Desenvolvem-se células HeLa em DMEM + glutamina (por exemplo, GlutaMAX) suplementado com 10% (v/v) bezerro fetal-inactivados por calor, soro e 1% penicilina e estreptomicina.
2. Revestimento de placas de cultura de fundo de vidro 6-poços com fibronectina (25 µ g/mL) por 1h. Então as sementes 2 x 10⁴ células por poço.
3. Durante a aquisição, mude o meio em 3 dias.
4. Para a aquisição de lapso de tempo, use o vídeo livre de lente microscópio (comercialmente disponível).
   Nota: Isto é baseado na técnica de imagem livre de lente computacional, conforme descrito por Ozcan et al ¹⁶ que foi modificado para realizar o monitoramento contínuo em uma incubadora a uma temperatura controlada de 37 ° C^12,15. Possui um sensor de imagem complementares de óxido metálico semicondutor (CMOS) com uma densidade de pixel de 1,67 µm e uma área de imagem de 6,4 x 4,6 mm². Iluminação múltipla do comprimento de onda é fornecida por um multichip luz emitindo diodo (LEDs) dispositivo, que proporciona iluminação vermelha, verde e azul. Os comprimentos de onda são centralizados, em 636, 521 e 452 nm respectivamente, com uma largura de banda espectral de 25, 45 e 25 nm respectivamente. Os vermelho-verde-azul (RGB) LEDs estão localizados acima um 150 µm pinhole a uma distância de aproximadamente 5 cm, a partir das células. A potência de luz medida perto o LED é tão baixa quanto 10 µW em cada comprimento de onda e o tempo de iluminação é apenas de um segundo por aquisição. Portanto, sem problemas de foto-toxicidade são esperados quando culturas de células são observadas ao microscópio lente livre de.
5. Colocar o recipiente de cultura celular colocar em contato com o sensor CMOS (Figura 1). Utilize um recipiente com uma lamela de vidro na parte inferior, o que é importante para a qualidade da lente-livre aquisição. Recipientes de plástico também podem ser usados, mas a lente livre aquisição será degradada devido à pobre qualidade óptica destes recipientes.
6. Controle o vídeo livre de lente microscópio com o software de aquisição (comercialmente disponível), que executa tanto a lapso de tempo aquisição e reconstrução holográfica. Os parâmetros que precisam ser digitados pelo usuário na interface do software são a taxa de quadros, a duração do experimento e o tipo de cultura de células, ou seja, aderente nas células ou flutuante.
7. Defina os parâmetros de entrada do software aquisição. Defina a taxa de quadro definido para a aquisição de um a cada 10 minutos e defina o tipo de cultura celular de «aderentes».
   Nota: Uma taxa de quadros de uma aquisição em 10 minutos é um bom compromisso, pois garante uma célula confiável de rastreamento enquanto o tamanho do conjunto de dados resultante a ser analisado é ainda razoável. A mais rápida taxa de quadros realizável com esta configuração de lente-free microscopia é uma aquisição cada 5 minutos. Aumentando ainda mais o framerate resulta em um aquecimento excessivo do sensor CMOS que pode afetar a viabilidade das células em cultura.
8. Iniciar a aquisição de lapso de tempo, e o algoritmo de reconstrução holográfica (comercialmente disponível) processará automaticamente a aquisição livre de lente para obter a imagem da fase da cultura de pilha. O algoritmo de reconstrução holográfica é baseado em um comprimento de onda multi fase recuperação algoritmo¹⁷ e fornece uma imagem RGB fase reconstruído no intervalo de [-π, + π] para cada célula única ao longo de um grande campo de visão de 29,4 mm². O princípio da holografia lente livre em linha é iluminar uma amostra fina (z = 0) com uma onda de avião (de amplitude 1 após normalização) e para detectar em um sensor CMOS a imagem de intensidade de difração subsequentes em uma curta distância z = Z, tipicamente de 1 mm após o amostra. Em nossa configuração, a iluminação é sequencialmente mudou-se para 3 comprimentos de onda (λ₁= 0.450 µm, λ₂= 0.540 µm, λ₃= 0.647 µm) para medir três padrões de difração da mesma amostra.

2. análise de dados de cultura de célula

1. Para rastreamento de celular, use o algoritmo de Trackmate, um plugin de Fiji de código aberto para o monitoramento automatizado de partículas única¹⁸. Pelo primeiro, carregar a aquisição completa lapso de tempo em Fiji (comando de sequência de imagem de carga). Devido ao grande tamanho dos conjuntos de dados, que caracteriza tipicamente 400 quadros RGB de 29,7 Mb, é mais rápido para carregá-los no formato de 8 bits. Em seguida o plugin Trackmate Fiji orienta o usuário através de vários estágios do algoritmo de rastreamento de celular, ou seja um palco de deteção de célula, um palco de rastreador de celular e vários filtros aplicados para as detecções de célula e as faixas computadas. Em cada estágio, os algoritmos de configurar e exibir os resultados imediatamente de modo que, se necessário, um pode facilmente navegar e para trás para ajustar as configurações. Os vários menus da interface do Trackmate são mostrados na Figura 2 com as configurações reais utilizadas para o experimento de células HeLa.
2. Defina os parâmetros de entrada do software aquisição como a seguir (ver Figura 2). Defina o diâmetro estimado blob para 15 pixels, o limiar de detector de 0,25, a distância máxima vinculação de 15 pixels, a distância máxima de abertura-fechamento para 15 pixels e o número de pontos nas faixas de 3,5.
   Nota: Essas configurações serão obviamente diferente de um experimento para o outro, especialmente o 'blob estimado diâmetro' que corresponde ao tamanho da célula (aqui, dado em pixels de 1,67 µm). A mesma observação aplica-se para a 'distância máxima vinculação' que representam a distância máxima percorrida por uma célula em dois quadros consecutivos (aqui, dado em pixels de 1,67 µm). Seu valor ideal depende na motilidade celular, mas também na densidade celular.
3. No final do processo de rastreamento de celular, gerar os resultados sob a forma de três arquivos de texto ('Análise' botão, ver Figura 2). O arquivo mais útil, chamado 'Spots nas estatísticas de faixas', consiste em uma tabela listando todos detectadas células com suas posições respectivas (x, y) na aquisição, o número do quadro e seu número da faixa. Com base neste dados, executar a segmentação da célula e detectar divisões celulares usando algoritmos dedicados (ver arquivos de código complementar). Os outros dois arquivos são nomeados 'Links estatísticas faixas' e 'Track estatísticas' e incluir todos os resultados, lidando com as faixas, por exemplo, a faixa durações, número de lacunas detectadas, rastrear o frame inicial, etc.
4. Use o algoritmo de segmentação de célula (ver arquivo de código suplementar) para extrair automaticamente várias métricas, descrevendo a morfologia celular da imagem reconstruída fase. Essas métricas são a área de superfície de célula (S), o comprimento do eixo principal de célula (L), o comprimento do eixo menor célula (l) e a relação de aspecto de célula (L/l). A fase recuperada de microscopia livre de lente é proporcional a densidade e a espessura da camada de amostra, conforme discutido anteriormente,¹⁵.
5. Além das características morfológicas da célula, extrair as medições do (CDM) de massa secas célula quantitativa do reconstruído fase^13,19,20
   EQ. (1)
   onde φ(x,y) é a fase reconstruído turno¹⁹, λ o comprimento de onda e α = 1,8 x 10^-4 m³/kg índice de refração específico que relaciona a variação do índice de refração para secar massa^{1, 19}.
6. Avalie a espessura de célula, usando uma estimativa da diferença entre o índice de refração de célula e que os meios de cultura. A relação entre a célula de espessura h(x,y) e a mudança de fase medidos, é dado por²⁰:
   EQ. (2.1)
   EQ. (2.2)
   com Δn(x,y) = n_célula (x,y) - _médio de n (x,y), a diferença de índice de refração entre a célula e o meio de cultura. A seguir, assumir um valor constante de Δn = 0,025, que é estimado a partir do índice de refração, medido em núcleos de células HeLa (n = 1.355¹¹) e de meios de cultura de tampão fosfato salino (PBS) (n = 1,33). Embora o valor de espessura da célula é apenas indicativo, como é baseado em uma suposição, suas variações relativas são significativas e podem ser exploradas para detectar células divisórias.
7. Usar o algoritmo dedicado (ver arquivo de código complementar) para detectar a ocorrência de divisões celulares e, em seguida, extrair faixas de células que estão associadas às divisões celulares detectados, a fim de detectar uma divisão celular, células com uma espessura medida maior do que 8 µm são primeiramente identificados, em seguida, verifique se uma nova célula aparece estreitamente em espaço e tempo. Desta forma, a detecção de divisões celulares baseia-se em dois critérios robustos. Alternativa e mais elaborados métodos para detecção de divisão celular podem ser aplicados a lensfree aquisição de lapso de tempo^21,22,23.

Resultados

Para o processo de reconstrução holográfica, o campo de luz é descrito por um campo escalar um (onde é o valor complexo de A no avião em distância z da posição de amostra e lateral e no comprimento de onda λ). Propagação de luz é modelada pela teoria de Huygens-Fresnel, que fornece um kernel propagador

Discussão

Neste trabalho, mostramos que essa lente livre de microscopia pode ser usada dentro de uma incubadora para capturar a cinética de milhares de células. A fim de descrever a metodologia global, que nós explicamos como uma aquisição de lapso de tempo dia 2,7 de células HeLa em cultura pode ser analisada com algoritmos de controle de célula padrão. O resultado é um conjunto de dados com 2,2 x 10⁶ medidas de célula e 10.584 faixas do ciclo celular. As aquisições foram realizadas sobre uma cultura de células Hela co...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microscópio de vídeo sem lentes Cytonote	de aquisição Iprasense
Horus	Iprasense
6 poços	MatTek corporation	Parte No: P06G-0-14-F
Meio DMEM + GlutaMAX	Soro
	Penicilina e estreptomicina Eurobio
	Gibco
Fibronectina	Sigma Aldrich
Matlab, caixa de ferramentas de processamento de imagem	Obras matemáticas