Aqui, descrevemos um método de cultura tridimensional para analisar a morfologia da mama primário de células de câncer, também como para estudar suas interações direta/indireta com os monócitos e os resultados tais como a degradação do colagénio, recrutamento de células imunes, célula invasão e promoção de inflamação relacionadas ao câncer.
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Artigo de método
Analisando a comunicação entre monócitos e células de câncer primário da mama em uma matriz Extracellular extrair (ECME)-sistema tridimensional baseado em
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Incorporado na matriz extracelular (ECM), normais e neoplásicas de células epiteliais intimamente comunicar-se com células hematopoiéticas e não-hematopoiéticas, assim, extremamente influenciar o resultado de homeostase e doença do tecido normal. No câncer de mama, tumor-associado macrófagos (TAMs) desempenham um papel fundamental na progressão da doença, metástase e recorrência; Portanto, compreender os mecanismos da chemoattraction de monócitos para o microambiente do tumor e suas interações com as células do tumor é importante para controlar a doença. Aqui, nós fornecemos uma descrição detalhada de um sistema tridimensional (3D) co-cultura de células de câncer (BrC) de mama humano e monócitos humanos. BrC células produzidas elevados níveis basais de regulamentado na ativação, normal de célula T expressa e secretada (RANTES), monócitos quimiotático proteína-1 (MCP-1) e fator colônia-estimulando do Granulócito-macrófago (G-CSF), enquanto em co-cultura com monócitos, citocinas pró-inflamatórias interleucina (IL) -1 beta (IL-1 β) e IL-8 foram enriquecidos em conjunto com a matriz metaloproteinases (MMP) -1, MMP-2 e MMP-10. Este microambiente de estroma do tumor promovido resistência à anoikis em MCF-10A 3D acinar estruturas, chemoattraction de monócitos e invasão de células de BrC agressivas. Os protocolos aqui apresentados fornecem uma alternativa acessível para estudar comunicação intra-tumor e são um exemplo do grande potencial em vitro celular 3D sistemas fornecem para interrogar a características específicas da biologia do tumor relacionados ao tumor agressão.
Introdução
Biologia do tumor é muito mais complexa do que se pensava. Montagem a evidência mostra que as células do tumor são mais do que uma mera massa de células de proliferação não controladas; pelo contrário, diferentes células neoplásicas parecem desempenhar funções diferentes, exibindo alta organização e hierarquia dentro do tumor1. Células tumorais são também em comunicação íntima com células não-transformadas: macrófagos, fibroblastos, linfócitos, adipócitos, células endoteliais, entre outras células estão todos imersos no andaime proteínas e polissacarídeos que constituem o ECM. Numerosas interacções directas e indirectas são estabelecidas entre ....
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Protocolo
Amostras de pacientes do BrC foram obtidas do banco de tecidos da Unidad de Investigación en Virología y Cáncer, Hospital Infantil de México Federico Gómez. Este estudo foi aprovado pela comunidade científica, ética e biossegurança revisão placas do Hospital Infantil de México Federico Gómez: Comité de Investigación, Comité de Ética en Investigación e Comité de Bioseguridad. Todos os pacientes foram prospectivamente incluídos e foram informados sobre a natureza do estudo: aqueles que desejam participar assinaram um consentimento informado escrito antes da coleta de amostras e foram tratados de acordo com as diretrizes éticas e melhor prática clínica de a instituição. ....
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Resultados
Análise morfológica de células BrC em culturas 3D:
A morfologia das células de BrC primárias cresce em culturas 3D em baixas e altas densidades foi estudada durante 5 dias. Durante as primeiras 48 horas, as células aderirem a ECME e mantêm uma baixa densidade. Neste ponto do tempo, ele pode claramente ser apreciado que células apresentam uma forma alongada do eixo, como, alguns com dois ou mais projeções tempo c.......
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Discussão
As células epiteliais crescem em uma conformação espacial 3D e sua interação com as proteínas de ECM é essencial para a homeostase do tecido. Muitos estudos de câncer foram baseados em células cultivadas em monocamadas (2D), e embora eles têm sido fundamentais para a compreensão de muitos aspectos da formação de tumor e progressão, monocamadas não recapitular as características que o ECM impõe às células, para instância: limitar a proliferação, sobrevivência dependente de adesão celular, polaridade apical-basolateral, re.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm qualquer conflito de interesses.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo CONACyT FONSEC ISSSTE/SSA/IMSS projeto n. º 233061 para Ezequiel M. Fuentes-Pananá e pelo Fondo de Apoyo a la Investigación, Hospital Infantil de México Federico Gómez (número do projeto HIM-2014-053). Sánchez-Espinoza at é um estudante de doutorado do Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) e recebeu bolsa 231663 do CONACYT. AT E-S, também reconhece o apoio financeiro fornecido pelo Instituto mexicano de Seguro Social (IMSS).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| U937 | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1593.2 | Linha celular monocítica/linfoma histiocítico |
| THP-1 | Coleção de Cultura Tipo Americano ATCC | TIB-202 | Linha celular monocítica/leucemia monocítica aguda |
| MCF-10A | Coleção de Cultura Tipo Americana ATCC | CRL-10317 | Linha de células de mama não transformadas |
| MCF-7 | American Type Culture Collection ATCC | de Células de Câncer de Mama | HTB-22 |
| T47D | Coleção de Cultura Tipo Americano ATCC | HTB-133 | Linha Celular de Câncer de Mama |
| HS578T | Coleção de Cultura Tipo Americano ATCC | de Células de Câncer de Mama | HTB-126 |
| MDA-MB-231 | Coleção de Cultura Tipo Americano ATCC | celular de câncer de mama | HTB-26 |
| RPMI 1640 médio | GIBCO BRL Life Technologies | 11875-093 | |
| DMEM Alta glicose | GIBCO BRL Life Technologies | 11964-092 | 4,5 g/L glicose |
| DMEM/F12 | GIBCO BRL Life Technologies | 11039-021 | |
| Antibiótico/Antimicótico | GIBCO BRL Life Technologies | 15240-062 | 100 U/mL penicilina, 100 µ g/mL de estreptomicina e 0,25 µ g/mL |
| Fungizone Soro Fetal Bovino | GIBCO BRL Life Technologies | 16000-044 | |
| Soro de cavalo | GIBCO BRL Life Technologies | 16050114 | |
| 0,05% Tripsina-EDTA 1X | GIBCO BRL Life Technologies | 25300-062 | |
| PBS 1X (Solução salina tamponada com fosfato | GIBCO BRL Life Technologies | 20012-027 | |
| Fator de crescimento epidérmico (EGF) | PeproTech | AF-100-15 (1,00mg) | |
| Insulina | SIGMA-ALDRICH | I1882-100MG | |
| Hidrocortisona | SIGMA-ALDRICH | H088-5G | |
| Toxina da cólera Vibrio cholerae | SIGMA-ALDRICH | C8052-1MG | |
| Matrigel | Corning Inc | 356237 | Sarcoma de camundongo Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), extrato de matriz extracelular, Armazene a -20° C até o uso em 4° C |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| MCP-1 | PeproTech | 300-04 | |
| RANTES | PeproTech | 300-06 | |
| IL-8 | PeproTech | 200-08 | |
| IL-1β | PeproTech | 200-01B | |
| Hycel Cristal-violeta | Mé xico | 541 | |
| Paraformaldeído | SIGMA-ALDRICH | P6148 | |
| Transwell suportes permeáveis (inserções) | Corning Inc | 3422 | 6.5 mm de diâmetro, 8 µ Tamanho do poro M/placas de 24 poços |
| Suportes permeáveis a transwell (insertos) | Thermofisher Scientific | 140620 | 6.5 mm de diâmetro, 0.4 µ Tamanho do poro M/placas de 24 poços |
| Kit de Isolamento de Monócitos II Humano | Colunas LS Miltenyi Biotec | 130-091-153 | |
| Miltenyi Biotec | 130-042-401 | ||
| Kit de Painel de Esferas Magnéticas de Citocina/Quimiocina Humana 96 Bem Ensaio de Placa | EMD Millipore | HCYTOMAG-60K | |
| Magpix com software xPonent (instrumentação de teste analítico fluorescente baseada em laser) | Luminex Corporation | 40-072 | |
| Lab-Tek lâmina de câmara com tampa (8 poço) | Nalge Nunc International | 177402 | |
| Micropoço com fundo de vidro 35mm pratos de Petri | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
Referências
- Rich, J. N. Cancer stem cells: understanding tumor hierarchy and heterogeneity. Medicine (Baltimore). 95 (1), Suppl 1 2-7 (2016).
- Wang, M., et al. Role of tumor microenvironment in tumorigenesis. J Cancer. 8 (5), 761-773 (2017).
- Quail, D. F., Joy....
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Reimpressões e permissões
