Method Article

Método para a rotulagem transcritos em células individuais Escherichia coli para único-molécula fluorescência In Situ as experiências de hibridação

DOI:

10.3791/56600

⸱

December 21st, 2017

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1Department of Physics of Complex Systems, Weizmann Institute of Science

In This Article

Summary

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Este manuscrito descreve um método para a rotulagem individual RNA mensageiro (mRNA) transcrições com fluorescente-etiquetadas sondas de DNA, para uso em único-molécula fluorescência em situ (smFISH) as experiências de hibridação em e. coli. smFISH é um método de visualização que permite a deteção simultânea, localização e quantificação de simples moléculas de mRNA em células individuais fixas.

Abstract

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Um método é descrito para a rotulagem individual RNA mensageiro (mRNA) transcritos em bactérias fixas para uso em único-molécula fluorescência em situ (smFISH) as experiências de hibridação em e. coli. smFISH permite a medição de célula para célula variabilidade no número de cópia de mRNA de genes de interesse, bem como a Localização subcellular de transcrições. As principais etapas envolvidas são a fixação da cultura de pilha bacteriana, permeabilização de membranas celulares e a hibridação de transcrições o alvo com conjuntos de sondas comercialmente disponível do oligonucleotide fluorescente-etiquetadas curto. smFISH pode permitir que a imagem da transcrição de genes múltiplos na mesma cela, com limitações impostas pela sobreposição espectral entre diferentes marcadores fluorescentes. Após a conclusão do protocolo ilustrado abaixo, células podem ser prontamente fotografadas usando um microscópio acoplado com uma câmera apropriada para fluorescência de baixa intensidade. Estas imagens, juntamente com contornos de células obtidas a partir de segmentação de quadros de contraste de fase ou coloração de membrana celular, permitem o cálculo da distribuição número da cópia do mRNA de uma amostra de células usando o software de código-fonte aberto ou personalizada. O método de rotulagem descrito aqui também pode ser aplicado a transcrições de imagem com microscopia de reconstrução óptica estocástico (Tempestade).

Introduction

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Sem rumo é um aspecto fundamental e inevitável da expressão genética e dá origem a célula-célula heterogeneidade1, tanto a nível de proteínas e transcrições de2,3. Quantificar a variabilidade entre as células sob condições bem definidas oferece uma única janela para os processos básicos que fundamentam a expressão dos genes e sua regulação. Uma importante fonte de heterogeneidade celular em bactérias ocorre no nível transcricional. Transcrição de números variam não apenas devido o crescimento da transcrição, mas também para processos pós-transcricional como regulamento por pequenos RNAs....

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Protocol

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1. sonda Design

Nota: Este protocolo utiliza sondas comercialmente disponível do oligonucleotide já marcadas com fluorophores. As sondas consistem de um conjunto de sequências específicas complementares para um destino de mRNA, cada sonda ser conjugada com uma molécula fluorescente. Alternativamente, é possível anexar marcadores fluorescentes para sondas, conforme descrito em outro lugar5,16.

  1. Sondas de smFISH de projeto usando o algoritmo de16 sonda Designer desenvolvido por Arjun Raj (van Oudenaarden laboratório, Massachusetts Institute of Techno....

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Results

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Realizamos medições de smFISH de galK e sodB transcritos em células de Escherichia coli . As transcrições foram hibridizadas com um conjunto de sequências específicas complementares à sequência alvo, cada sonda ser conjugada com uma molécula fluorescente (ver tabela de materiais). Fluorescência e fase de contraste de imagens de MG1655 selvagem-tipo estirpe de Escherichia coli (WT) ou uma JW0740 (coleção de Keio)19 galK-excluído estirpe (ΔgalK<.......

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Discussion

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Medimos em nosso laboratório o número de transcrição de diferentes genes em células de Escherichia coli usando o smFISH método2. Em breve, este procedimento consiste das seguintes etapas: fixação da pilha, permeabilização de membranas para permitir a penetração da sonda, sonda de hibridização e amostra de imagem usando um microscópio de fluorescência padrão. Este procedimento baseia-se os publicados anteriormente, com algumas modificações6,

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Disclosures

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Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

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Este trabalho foi apoiado por um Israel Science Foundation grant 514415 (J.S.) e uma subvenção de BSF-NSF (MCB) 2016707 (a J.S.). Suporte de Siegfried e Irma Ullman professoral cadeira (J.S.) também é reconhecida.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sal de sódio de sulfato de dextranoSigma-AldrichD8906
Etanol puro, 99,5%, reagente ACS, absolutoMallinckrodt Baker - Avantor8025.25
Dietilpirocarbonato (DEPC)Sigma-AldrichD5758
Livre de RNase 20X SSCLife Technologies/AmbionAM9763
Sem RNase 10X PBSLife Technologies/AmbionTampão AM9625
TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) BioUltra, para biologia molecularSigma-Aldrich93283
água sem nucleaseThermo Fisher Scientific10977035
Solução de formaldeído para biologia molecular, 36,5-38% em águaSigma-AldrichF8775
Formamida deionizada, livre de nucleaseThermo Fisher Scientific/AmbionAM9342
E. coli tRNA (ácido ribonucleico, transferência tipo xx de escherichia)Sigma-AldrichR1753-500UN
UltraPure BSA (50mg / ml)Thermo Fisher Scientific / AmbionAM2616
Complexo vanadil-ribonucleosídeo, VRC, 200 mMNew England BiolabS1402S
Poly-L-LysineSigmaP4707
Cisteamina e oxigênioSigma-Aldrich30070
Glicose Oxidase de Aspergillus niger, Tipo VII, 50KUSigma-AldrichG2133
CatalaseSigma-AldrichC40
D-glicoseSigma-AldrichG8270
D-fucoseSigma-AldrichF8150
Vybrant DiO Solução de Marcação deCélulas Vida Útil TecnologiasV2286
Agarose, reagente de baixo ponto de fusãoSigma-AldrichA9414
Isolador de silicone adesivo 24-2mm Dia. X 1,8 mm profundidade JTR24R-A2-2.0Grace Bio-LabsJTR24R-A2-2.0 666208
fundo de vidro revestido com poli-D-lisina Pratos de cultura de fundo de vidroMatTek CorporationP35GC-1.5-14-C
Luvas de exame sem pó de nitrilo super lifeSupermaxTC-N-9889
Fita de incubadora de esterilização da marcaSigma-AldrichBR61750
Tubos de microcentrífuga (1,8 ml)Axygen - Corning Life SciencesMCT-175C
Falcon tubos de polipropileno de fundo redondo (14 ml)BD Biosciences352059
Centrífuga de polipropileno de fundo cônico tubos (50 ml)Pipetassorológicas Corning 430828
(Corning 5 ml)Corning Life Sciences4051
(Corning 10 ml)Corning Life Sciences4488
(Corning 25 ml)Corning Life Sciences4251
Cubetas espectrofotônicasSarstedt67.742
Ponteiras de pipeta sem RNase 0,2 - 20 μ lFroggaBioFT20
Pontas de pipeta sem RNase 10 - 200 μ lAxigene/corningTF-200
100 - 1000 μ lFroggaBioFT1000
Pontas de pipeta sem RNase 100 - 1000 μ lSorenson14200
Descartável de seringa 10 mL agulha G-21Becton Dickinson, BiosciencesBD-309643
Minisart 0.2 um Filtro de seringaSartorius16534 K
Instrumentos Nikon microscópio tipo A óleo de imersão A, 8ccNikonMXA20233
lâminas de microscópio 76 x26, 3"x1"x1mmThermo Fisher Scientific421-004ET
# 0 lamínula slide 24x60Thermo Fisher Scientific / MenzelBNBB024060A0
agitador orbitalM.R.CTOU-50
Bloco quenteM.R.C
VortexFried Electric CompanyG-560-E
MicrocentrífugaEppendorf5427R
CentrífugaEppendorf5810R
Portable Pipet-Aid XP2, Controlador de PipetaDrummond Scientific Company4-000-501-I
OD600 Espectrofotômetro para Taxas de Crescimento Bacteriano DiluPhotometerMidsciOD600-10
iXon X3 EMCCD câmeraAndorDU-897E-CS0-#BV
Microscópio Eclipse TiNikonMEA53100
CFI plano apocromático DM 100X objetiva de óleo lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13NikonMRD31905
Conjunto de filtros (TRITC/CY3): EX - ET545/30X; EM - ET620/60M; BS - T570LPNikon49005
Conjunto de filtros (CY5): EX - ET640/30X; EM - ET690/50M; BS - T660PNikon49009
Nis-elements AR auto reaserch softwareNikonMQS31000
microscópio STORMVutaraSR-200
NA 1.2 objetiva de imersão em água < span> < / span>Olympus
SRX aquisição de imagem e software de análiseVutara
Evolve 512 EMCCD câmeraPhotometrics
Stellaris® Sondas FISH, Ensaio Personalizado com CAL Fluor® Red 590 DyeBiosearch Technologies IncSMF-1083-5
Probe Sequence for galK mRNA:
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Probe Sequence for sodB mRNA:
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Pipetas sorológicas Pipetas sorológicas Ponteiras de pipeta sem RNase

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsimring, L. S. Noise in biology. Reports Prog. Phys. 77 (2), 26601(2014).
  2. Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14)....

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Single molecule FISHE coli mRNA labelingvisualizationFluorescent oligonucleotide probesBacterial cell fixationPermeabilization protocolHybridization bufferAgarose gel mountingFluorescence microscopySTORM imaging

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