Célula única quantificação das taxas de degradação de proteínas por microscopia de fluorescência de lapso de tempo em cultura de células aderentes

Resumo

Este protocolo descreve um método para determinar a proteína meia-vida em vida única células aderentes, usando pulso rotulagem e imagem latente de lapso de tempo de fluorescência de proteínas da fusão SNAP-marca.

Resumo

As proteínas estão em um estado dinâmico da síntese e degradação e sua meia-vida podem ser ajustada sob várias circunstâncias. No entanto, mais comumente usados abordagens para determinar ou Half-Life da proteína são limitados para as médias de população de células lisadas ou exigem o uso de inibidores da síntese de proteínas. Este protocolo descreve um método para medir a proteína meia-vida em vida única células aderentes, usando proteínas da fusão SNAP-etiqueta em combinação com microscopia de fluorescência lapso de tempo. Qualquer proteína de interesse fundido a um SNAP-tag pode ser ligados covalentemente por uma tintura fluorescente, de célula permeável que está acoplada a um derivado de benzylguanine, e a decadência da população rotulada de proteína pode ser monitorizada após a lavagem do corante residual. Célula subsequente acompanhamento e quantificação da intensidade da fluorescência integrado sobre resultados de tempo em uma curva de decaimento exponencial para cada célula rastreada, permitindo a determinação de taxas de degradação de proteínas em células únicas pelo encaixe de curva. Este método fornece uma estimativa para a heterogeneidade das meias-vidas em uma população de células cultivadas, que não podem ser facilmente avaliados por outros métodos. A abordagem apresentada aqui é aplicável a qualquer tipo de culturas de células aderentes de expressar uma proteína de interesse fundido a um SNAP-tag. Aqui usamos as células-tronco embrionárias (ES) do mouse cultivadas em placas de cultura de células E-caderina-revestido para ilustrar como único degradação celular, taxas de proteínas com uma ampla gama de meia-vida podem ser determinadas.

Introdução

É sabido que as proteínas celulares passam por extenso volume de negócios, com taxas de síntese e degradação, sendo específicas para cada proteína e sujeitas a regulação fisiológica. Tradicionalmente, taxas de degradação de proteínas são medidos usando métodos em massa, tais como análise de perseguição de pulso radioactivos, ou envolvendo inibidores da síntese de proteínas tais como cicloheximida¹. Mais recentemente, isótopo estável, etiquetando com aminoácidos na cultura de pilha (SILAC) em combinação com a espectrometria de massa foi estabelecido para quantificar o volume de negócios de proteína em uma escala global². No entanto, esses métodos são limitados por uma média de população, e informações sobre a variabilidade de célula para célula, portanto, estão perdidas. Além disso, mudanças transientes na degradação de proteínas que são sincronizadas através de população celular não podem ser identificadas.

Alternativamente, proteína de meia-vida também pode ser determinado por abordagens baseadas em fluorescência, que muitas vezes têm a vantagem de fornecer resolução de célula única. Por exemplo, uma proteína fluorescente verde photoactivatable (paGFP) tem sido usada para determinar o Oct4 Half-Life no início³embriões de mamíferos. Um outro método para monitorar a degradação de proteínas em células vivas é o uso de uma marca de SNAP em combinação com a imagem de lapso de tempo de fluorescência. A SNAP-tag é uma versão mutante da enzima O reparo DNA⁶- alkylguanine DNA-alkyltransferase (AGT) que reage especificamente com benzylguanine derivados de (BG), que podem ser acoplados ao sondas moleculares^{4,5, 6}. portanto, qualquer proteína de fusão SNAP-etiqueta pode ser irreversivelmente rotulada com um corante fluorescente, de permeável célula. Rotulagem de pulso de uma proteína de interesse fundido a marca do SNAP, seguida de esmaecimento do corante residual, permite para monitorar a degradação da população rotulada de proteína e, portanto, para a determinação de Half-Life da proteína. SNAP-etiquetas tem sido utilizados com sucesso para a rotulagem de pulso-perseguição de proteínas e para a determinação da proteína meias-vidas em aderente celulares cultura e na vivo^5,7,8,9. Uma grande variedade de substratos SNAP-marca cobrindo comumente usado de espectros fluorescentes são comercialmente disponíveis, permitindo a seleção do corante ideal para cada aplicação específica. Assim, SNAP-marcas também podem ser usadas para a imagem latente multicolor em combinação com outras proteínas da fusão fluorescente ou corantes. Corantes célula-impermeável são adequados para a rotulagem das proteínas de membrana-amarrados, Considerando que a célula-permeável corantes são aplicáveis para o monitoramento de proteínas intracelulares e membrana-limite. Além disso, alguns dos tais sondas não exibem quase nenhuma fluorescência basal e apenas começam a emitir um sinal fluorescente forte sobre vinculação a um SNAP-marca¹⁰.

Este protocolo descreve como medir as taxas de degradação de proteínas diferentes de interesse em células únicas usando um SNAP-tag. Aqui podemos aplicar esse método para as células-tronco embrionárias (ES) do mouse cultivadas na E-caderina, mas deve ser possível usá-lo com qualquer tipo de células cultivadas aderentes. Mostramos que pulso rotulagem de proteínas da fusão SNAP-marca seguidas por imagens de lapso de tempo de fluorescência permite determinar as única célula meias-vidas de várias proteínas de interesse e fornece uma estimativa para a variabilidade de célula para célula de meias-vidas em um população de células cultivadas.

Protocolo

Nota: Neste estudo, foi usada a linha da célula E14 ES. No entanto, este protocolo é directamente aplicável a qualquer outra linha de células de rato ES expressar uma proteína de interesse fundido a um SNAP-tag, marcando a proteína endógena ou usando superexpressão. Para os exemplos mostrados na seção de resultados, foram utilizadas linhas de células de fusão SNAP-tag doxiciclina-inducible (SNAP-marca fundiu-se para as seguintes proteínas: Nanog, Oct4, Srsf11, ou para o mOrange2 de proteínas fluorescentes e sfGFP e colocar sob o controle de um doxiciclina-inducible promotor. Veja¹¹ para obter mais informações sobre o plasmídeo utilizado para a geração das linhas de célula doxiciclina-inducible SNAP-marca fusão). O sistema de doxiciclina-inducible pode ser particularmente útil, pois permite controlar rigidamente o tempo e na intensidade da expressão da proteína de interesse. C-terminal de posicionamento de marca do SNAP é recomendado, como mudar o N-terminal sequência de aminoácidos é mais susceptível de modificar o Half-Life da proteína alvo (N-fim regra¹²).

1. E-caderina revestimento e propagação de células

1. Gere uma linha de celular ES expressar uma proteína de interesse fundido ao SNAP-marca⁴.
2. Pratos de cultura de célula casaco 100 mm com 4 mL de gelatina de 0,1% (diluída em solução salina tamponada fosfato (PBS) sem Ca^{2 +}/ mg^{2 +}) por 1 h. Retire a gelatina e deixem secos por 1 h. uso imediatamente ou armazenam os pratos revestidos por até 2 meses.
3. Crescer a linhagem de células de interesse em meio de cultura celular ES (Glasgow mínimo essencial médio, suplementado com 10% ES qualificado célula fetal de soro bovino, piruvato de sódio 2 mM, 1% não aminoácidos essenciais, 1% penicilina/estreptomicina, 2 mM L-glutamina, 100 µM 2- Mercaptoetanol, fator inibitório de leucemia (LIF), 3 µM CHIR99021 e 0,8 µM PD184352) em pratos de gelatina-revestido a 37 ° C e 5% CO₂ por 2 dias até atingir uma confluência de 10-20 células de Mio por prato.
   Nota: Aqui, LIF foi produzido por transfection transiente de células de 293T HEK, seguido pela coleta de sobrenadante e filtragem. Cada lote de LIF foi testado por seu potencial para manter a pluripotência, mas concentrações não foram determinadas. No entanto, LIF recombinante também está disponível comercialmente e a concentração comumente utilizada para cultura de células de rato ES é de 1000 unidades/mL¹³.
4. Revestir uma placa de 96 poços adequada para imagens com 30 µ l de rato recombinante da proteína de Quimera de E-caderina Fc (E-cad-Fc) por alvéolo (5 ng / µ l, diluído em PBS com Ca^{2 +}/ mg^{2 +}. Use concentrações estoque de 100 ng / µ l, armazenado a-80 ° C). Evite pipetagem extensa, como E-cad-Fc é muito frágil. Incube a 37 ° C por 1,5 h.
   Nota: Dependendo do microscópio, outros formatos podem ser usados.
5. Aspire o E-cad-Fc, lave uma vez com 100 µ l de PBS com Ca^{2 +}/ mg^{2 +}e adicionar 100 µ l de meio de cultura de células ES previamente aquecido.
6. Lavam-se as células de interesse com 5 mL de PBS sem Ca^{2 +}/ mg^{2 +}. Aspire e adicionar 2 mL de EDTA-tripsina 0,25%. Incubar durante 4 min a 37 ° C. Adicionar 4 mL de meio de cultura celular ES, resuspenda e spin para baixo a 1000 x g, durante 4 min. Aspire o sobrenadante e resuspenda o pellet em 2 mL de meio de cultura celular ES fresco.
   Nota: PBS sem Ca^{2 +}/ mg^{2 +} deve ser usado para as células antes tripsinização de lavagem para remover Ca^{2 +} íons, que são necessários para a adesão celular. Em contraste, para a diluição E-cad-Fc e revestimento (etapa 1.4), use o PBS com Ca^{2 +}/ mg^{2 +}, desde a adesão de células ES de E-cad-Fc pratos revestidos é Ca^{2 +}-dependente¹⁴.
7. Dilua a ressuspensão células 01:10 em 1 mL de meio de cultura celular ES e contagem, utilizando uma câmara de contagem (carga 10 µ l para uma câmara de 0,1 mm de profundidade).
8. Semente de 30.000 células/cm² no E-cad-Fc revestido placa de imagem. Encha até 200 µ l por alvéolo com meio de cultura celular ES. Para linhas de célula doxiciclina-inducible, induzir com uma dose apropriada de doxiciclina (otimizar dose e temporização da indução com antecedência. As linhas celulares usadas aqui foram tratadas com doxiciclina de ng/mL 500 24 h antes de imagem). Incubar a 37 ° C e 5% de CO₂ e prossiga com o pulso, rotulagem e imagem 24h após a semeadura da célula.

2. pulso rotulagem da SNAP-tag

Nota: Para experimentos de degradação de proteínas é fundamental usar uma adequada concentração de corante SNAP. A concentração deve ser alta o suficiente para produzir um sinal brilhante no início do lapso de tempo, como a fluorescência irá diminuir ao longo do tempo. No entanto, usando concentrações de tintura muito alto pode causar corante residual, sendo deixado no meio ou nas células mesmo após a lavagem. O corante livre posteriormente pode vincular a recém-produzido SNAP-marca moléculas ao longo do filme, que vai distorcer a curva de decaimento. O sinal de fluorescência observado dependerá das propriedades do corante, a linha de celular usado, bem como o nível de expressão da proteína correspondente. Portanto, é fundamental otimizar a concentração de corante, testando diferentes diluições, a partir da diluição sugerida para a imagem latente de célula viva pelo fabricante. Para este estudo, utilizou-se um substrato fluorescente far-red. Uma concentração ideal de 12 nM foi determinada para as linhas de célula de doxiciclina-inducible superexpressão.

1. Dilua o corante SNAP na concentração apropriada em meio de cultura de células ES previamente aquecido. Usar uma pipeta para remover suavemente o meio das células previamente semeadas na placa de 96 poços e adicionar 50 μL de tintura SNAP diluída por bem. Incubar durante 30 min a 37 ° C.
2. Aspirar a tintura diluída com uma pipeta e lavar 3x com 200 µ l de PBS pré-aquecido (sem o Ca^{2 +}/ mg^{2 +}). Acrescente 200 µ l de meio de cultura celular ES e incube por 15 min a 37 ° C.
3. Repita as etapas anteriores de lavagem mais duas vezes.
   Nota: Lavagem extensa é importante a fim de remover qualquer corante não acoplado. As etapas de lavagem repetida com PBS remover a tintura extracellular residual no meio, Considerando que a incubação do 15 min assegurar robusto rotulagem das proteínas de fusão de SNAP-etiqueta antes de iniciar a experiência de imagem. No entanto, execute as etapas de lavagem pipetando suave e não usar um aspirador automático, como células semeadas na E-cad-Fc tendem a separar-se facilmente.
4. Adicione 200 µ l de meio de imagem. Para reduzir o fundo de fluorescência, utilize meio livre de vermelho de fenol (suplementado com 10% ES qualificado célula fetal de soro bovino, piruvato de sódio 2 mM, 1% não aminoácidos essenciais, 1% penicilina/estreptomicina, 2 mM L-glutamina, 100 µM 2-Mercaptoetanol, LIF, 3 µM CHIR99021 e 0,8 µM PD184352).

3. Time-Lapse microscopia

1. Use um microscópio apropriado para geração de imagens ao vivo, permitindo que a temperatura controlada e CO₂. Defina a temperatura de 37 ° C e o CO₂ a 5% antes de usar e permitem equilibrar para 1-2 h.
2. Coloque o prato no microscópio e encontrar locais adequados para a imagem latente. Selecione os pontos onde as células são uniformemente distribuídas, mas não muito denso, como isso irá facilitar a análise. Ajuste o número de pontos selecionados para o número de células necessárias para a análise. Neste estudo, foram registrados 3-5 pontos por linha celular.
3. Selecione o objetivo. Um objectivo X 20 é apropriado para o tamanho de pilhas do ES.
4. Selecione as configurações de iluminação para o canal fluorescente (s) a ser gravado. Ajuste a potência do laser e a exposição de acordo com a intensidade do sinal de fluorescência das células de interesse. Certifique-se de obter um forte sinal inicial, uma vez que irá diminuir ao longo do filme, mas evitar os poderes do laser superior a 30% a fim de minimizar a fototoxicidade e fotobranqueamento. Para este estudo, um filtro de excitação de 632/22 nm (comprimento de onda/bandpass), filtro de emissão de 679/34 nm (comprimento de onda/bandpass), poder do laser do tempo de exposição e 10% de 100 ms foram usados.
5. Selecione os intervalos e a duração da experiência do tempo-lapso de imagem. Para proteínas com esperado meia-vida de 2-20 h, escolha tempos de aquisição de 12-24 h com intervalos de tempo de 15 min. Para proteínas do cliente, reduza os intervalos e tempos de aquisição, para aumento de proteínas caudais em conformidade.
6. Começa a imagem.

4. processamento e análise de imagem

1. Recolha as imagens adquiridas como uma pilha no formato tiff. Para análise e tratamento subsequente, use o software de FIJI¹⁵. Se os dados de lapso de tempo não são coletados como uma pilha pelo software do microscópio, abrir todos os quadros da experiência do tempo-lapso no software (ou clicando em arquivo | Abrir... ou arrastar e soltar os arquivos correspondentes à barra de ferramentas) e clique em imagem | Pilhas | Imagens de empilhar.
2. Use a função de fundo subtrair para remover o fundo de todas as imagens na pilha. Para isso, clique em processo | Subtrair a fundo. Selecione o raio de bola rolando na janela pop-up. Use um raio que é pelo menos o tamanho das células fotografada. Para aplicar a subtração de fundo para todas as células na pilha, selecione Sim no pilha processo? janela pop-up.
3. Selecione uma célula de interesse e desenhar uma região de interesse (ROI) em torno dele usando a barra de ferramentas. Para sinais nucleares, use a seleção Oval primeiro clicando na guia correspondente na barra de ferramentas e depois clicando sobre o núcleo de interesse e ajustando o oval em torno dele. Para sinais citoplasmáticos ou regiões muito densas use a seleção à mão livre para ser capaz de acompanhar de perto os contornos da célula. Evite incluindo regiões muito grandes, de fundo, mesmo que não é necessário seguir os contornos de célula precisamente devido a posterior subtração de todos os pixels do fundo (etapa 4.8-4.9).
4. Adicione a região de interesse para o Gerenciador de ROI clicando Analyze | Ferramentas | Gerente de ROI | Adicionar, ou com a tecla T no teclado.
5. Prosseguir para o próximo quadro movendo a guia na janela pilha ou por pressionando shift + < no teclado, em seguida, repita as ações anteriores. Siga a célula de interesse ao longo do filme e adicionar o ROI de cada frame para o Gerenciador de ROI. Salvar o ROI final definido para cada célula controlada clicando mais | Salve... no Gerenciador de ROI.
   Nota: Depois de divisões celulares, rastrear as duas células-filhas separadamente e resumir sua intensidade integrada após subtracção de fundo (ver passos 4.6-4.9) a conta para diluição de proteína durante a divisão celular. Salve os conjuntos ROI para as duas células-filhas.
6. Uma vez que a célula de interesse é controlada durante todo o filme, clique em medida, para obter valores de intensidade média e a área do ROIs. Copie os valores obtidos em um programa de planilha eletrônica e calcular a intensidade integrada cru da célula para cada ponto de tempo da seguinte maneira:
   
   onde quer dizer_ca intensidade média eárea_Ca área do ROI correspondente.
7. Para estimar o fundo local, adicione um ROI perto da célula de interesse para cada período de tempo. Evite incluindo qualquer sinal de fluorescência celular. Use um ROI circular que é aproximadamente do tamanho de uma célula e mover ou reduzi-lo em conformidade, se necessário, por exemplo, se as células vizinhas a interferir. Proceda como descrito anteriormente, com o celular ROI em conjunto a fim de obter um ROI de fundo definida e copiar os valores de medida de intensidade para a planilha.
8. Para obter um valor de correção de fundo para a intensidade integrada da célula, primeiro Calcule a intensidade integrada do plano de fundo para cada ponto de tempo:
   
   onde quer dizer_BG é a intensidade média do sinal de fundo e área_C é a área do ROI circundando a célula. Não utilize a área do plano de fundo ROI, a menos que ambas as áreas têm o mesmo tamanho.
9. Calcule a intensidade integrada final subtraído de plano de fundo da célula para cada ponto de tempo:
   
10. Para normalizar as curvas de decaimento de célula única, divida o valor de intensidade de cada ponto do tempo pelo valor do primeiro tempo-ponto de intensidade.
    Nota: A curva de ajuste (ver passo 4.11) pode também ser executada em cada célula única ou sobre a média da população. Uma normalização é necessária se uma população com base média é calculada para evitar vieses de intensidades de fluorescência diferentes entre as células. A normalização, assim, garante que cada célula contribui com o mesmo peso para a curva de decaimento final. Além disso, a normalização pode ser útil para visualizar os decaimentos única célula independentemente suas intensidades de fluorescência absoluto (ver Figuras 3A-3C). No entanto, se apenas a meia-vida de célula única é determinado e os dados não é uma média, a etapa de normalização pode ser omitida e a curva de ajuste pode ser executada diretamente em dados brutos.
11. Para a estimativa do Half-Life da proteína, use uma ferramenta de encaixe de curva. Neste estudo, utilizou-se a curva MATLAB, montagem de ferramentas 3.4.1, que está localizado por padrão na seção de aplicativos de interface de usuário do MATLAB. Importar a intensidade da fluorescência e valores de tempo da planilha eletrônica em MATLAB, clicando na guia Importar dados Abra a caixa de ferramentas de encaixe de curva e selecionar os pontos de tempo e dados de decaimento de fluorescência no dados X e Y de dados Tab. Choose Custom equação no encaixe de curva tab e insira a equação para um decaimento exponencial:
    
    onde f é a intensidade da fluorescência em um determinado ponto de tempo, um a intensidade inicial e b a taxa de decaimento. Nas Opções de ajuste... guia, selecione 0 para o limite de um e b. Os valores estimados para a e b aparecerá na janela de resultados. Calcule a meia-vida da seguinte maneira:
    

Resultados

O protocolo descrito fornece uma estimativa da variabilidade de célula para célula em Half-Life para qualquer proteína dada fundida a um SNAP-tag. O uso de recombinante E-caderina-Fc para o revestimento da placa de imagem permite a resolução única célula em células de ES, que, de outra forma, crescem nas colônias. Células individuais podem ser controladas separadamente ao longo do filme ( figura 1A).

Para determinar a meia-vida de proteína para cada célula única, ...

Discussão

A etapa mais crucial quando usando um SNAP-tag para monitorar a deterioração de proteína é garantir que nenhuma tintura desacoplada residual é deixada no meio ou nas células após a lavagem, caso contrário pode vincular recém produzido moléculas SNAP-marca mais tarde durante o experimento e ther Eby comprometer a curva de decaimento. Isto é por um lado, alcançado realizando cuidadosamente todas as etapas de lavagem descritas. Por outro lado, a concentração de corante deve ser mantida tão baixa quanto possível, estando ain...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Equipment
ES linha celular expressando uma proteína de fusão SNAP-tag de interesse	-
Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Plate	Corning	353003
96 Well, Preto/Transparente, Placa Tratada com Cultura de Tecidos	Corning	353219
Câmara de contagem melhorada por Neubauer, 0,1 mm	Marienfeld-superior	640030
Incubadora de CO2	Panasonic	MCO-170AICUV-PE
Centrífuga 5804 R	Eppendorf	5804000528
InCell Analyzer 2200 Sistema de Imagem Celular	GE Healthcare Life Sciences	29027886
Nome	Empresa	Número do catálogo	Comentários
Reagentes
Glasgow Meio Essencial Mínimo	Sigma-Aldrich	G5154
Soro Bovino Fetal, qualificado por células-tronco embyônicas	ThermoFisher	16141-079
Solução de piruvato de sódio	Sigma-Aldrich	113-24-6
Meio Essencial Mínimo  Aminoácidos não essenciais	ThermoFisher	11140-035
Penicilina-estreptomicina	BioConcept	4-01F00H
L-Glutamina 200mM	ThermoFisher	25030-024
2-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	63689-25ML-F
Fator inibidor de leucemia	-	-	Produzido em laboratório por transfecção transitória de células HEK-293T, seguida de coleta e filtragem do sobrenadante.
CHIR99021 (Inibidor XVI de GSK-3)	Merck Millipore	361559
PD 0325901	Sigma-Aldrich	391210-10-9
Gelatina de pele bovina	Sigma-Aldrich	9000-70-8
PBS 10x concentrado de Dulbecco	BioConcept	3-05K00-I
PBS de Dulbecco sem Ca++/Mg++	BioConcept	3-05F29-I
Trypsin-EDTA-Solution 0.25%	Sigma-Aldrich	T4049
	D systems	748-EC-050
Hidrato de doxiciclina	Sigma-Aldrich	D9891
SNAP-Cell 647-SiR	New England BioLabs	S9102S
FluoroBrite DMEM	ThermoFisher	A18967-01
Nome	Empresa	Número do catálogo	Comentários
Software
FIJI-		-	Software de análise de imagem de código aberto
MATLAB R2014a	Mathworks-Microsoft
Excel	Microsoft	-