Este protocolo descreve um método para determinar a proteína meia-vida em vida única células aderentes, usando pulso rotulagem e imagem latente de lapso de tempo de fluorescência de proteínas da fusão SNAP-marca.
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Artigo de método
Célula única quantificação das taxas de degradação de proteínas por microscopia de fluorescência de lapso de tempo em cultura de células aderentes
Neste artigo
Resumo
Resumo
As proteínas estão em um estado dinâmico da síntese e degradação e sua meia-vida podem ser ajustada sob várias circunstâncias. No entanto, mais comumente usados abordagens para determinar ou Half-Life da proteína são limitados para as médias de população de células lisadas ou exigem o uso de inibidores da síntese de proteínas. Este protocolo descreve um método para medir a proteína meia-vida em vida única células aderentes, usando proteínas da fusão SNAP-etiqueta em combinação com microscopia de fluorescência lapso de tempo. Qualquer proteína de interesse fundido a um SNAP-tag pode ser ligados covalentemente por uma tintura fluorescente, de célula permeável que está acoplada a um derivado de benzylguanine, e a decadência da população rotulada de proteína pode ser monitorizada após a lavagem do corante residual. Célula subsequente acompanhamento e quantificação da intensidade da fluorescência integrado sobre resultados de tempo em uma curva de decaimento exponencial para cada célula rastreada, permitindo a determinação de taxas de degradação de proteínas em células únicas pelo encaixe de curva. Este método fornece uma estimativa para a heterogeneidade das meias-vidas em uma população de células cultivadas, que não podem ser facilmente avaliados por outros métodos. A abordagem apresentada aqui é aplicável a qualquer tipo de culturas de células aderentes de expressar uma proteína de interesse fundido a um SNAP-tag. Aqui usamos as células-tronco embrionárias (ES) do mouse cultivadas em placas de cultura de células E-caderina-revestido para ilustrar como único degradação celular, taxas de proteínas com uma ampla gama de meia-vida podem ser determinadas.
Introdução
É sabido que as proteínas celulares passam por extenso volume de negócios, com taxas de síntese e degradação, sendo específicas para cada proteína e sujeitas a regulação fisiológica. Tradicionalmente, taxas de degradação de proteínas são medidos usando métodos em massa, tais como análise de perseguição de pulso radioactivos, ou envolvendo inibidores da síntese de proteínas tais como cicloheximida1. Mais recentemente, isótopo estável, etiquetando com aminoácidos na cultura de pilha (SILAC) em combinação com a espectrometria de massa foi estabelecido para quantificar o volume de negócios de proteína em uma escala global2. ....
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Protocolo
Nota: Neste estudo, foi usada a linha da célula E14 ES. No entanto, este protocolo é directamente aplicável a qualquer outra linha de células de rato ES expressar uma proteína de interesse fundido a um SNAP-tag, marcando a proteína endógena ou usando superexpressão. Para os exemplos mostrados na seção de resultados, foram utilizadas linhas de células de fusão SNAP-tag doxiciclina-inducible (SNAP-marca fundiu-se para as seguintes proteínas: Nanog, Oct4, Srsf11, ou para o mOrange2 de proteínas fluorescentes e sfGFP e colocar sob o controle de um doxiciclina-inducible promotor. Veja11 para obter mais informações sobre o plasmídeo utilizado para a ....
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Resultados
O protocolo descrito fornece uma estimativa da variabilidade de célula para célula em Half-Life para qualquer proteína dada fundida a um SNAP-tag. O uso de recombinante E-caderina-Fc para o revestimento da placa de imagem permite a resolução única célula em células de ES, que, de outra forma, crescem nas colônias. Células individuais podem ser controladas separadamente ao longo do filme ( figura 1A).
Para determinar a meia-vida de proteína para cada célula única, .......
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Discussão
A etapa mais crucial quando usando um SNAP-tag para monitorar a deterioração de proteína é garantir que nenhuma tintura desacoplada residual é deixada no meio ou nas células após a lavagem, caso contrário pode vincular recém produzido moléculas SNAP-marca mais tarde durante o experimento e ther Eby comprometer a curva de decaimento. Isto é por um lado, alcançado realizando cuidadosamente todas as etapas de lavagem descritas. Por outro lado, a concentração de corante deve ser mantida tão baixa quanto possível, estando ain.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
No Biomolecular triagem Facility (BSF), EPFL, foram realizados experimentos de microscopia de lapso de tempo. Agradecemos a Marc Delachaux (serviço audiovisual, EPFL) para a produção de vídeo e edição do filme.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| ES linha celular expressando uma proteína de fusão SNAP-tag de interesse | - | ||
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Plate | Corning | 353003 | |
| 96 Well, Preto/Transparente, Placa Tratada com Cultura de Tecidos | Corning | 353219 | |
| Câmara de contagem melhorada por Neubauer, 0,1 mm | Marienfeld-superior | 640030 | |
| Incubadora de CO2 | Panasonic | MCO-170AICUV-PE | |
| Centrífuga 5804 R | Eppendorf | 5804000528 | |
| InCell Analyzer 2200 Sistema de Imagem Celular | GE Healthcare Life Sciences | 29027886 | |
| Nome | Empresa | Número do catálogo | Comentários |
| Reagentes | |||
| Glasgow Meio Essencial Mínimo | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| Soro Bovino Fetal, qualificado por células-tronco embyônicas | ThermoFisher | 16141-079 | |
| Solução de piruvato de sódio | Sigma-Aldrich | 113-24-6 | |
| Meio Essencial Mínimo Aminoácidos não essenciais | ThermoFisher | 11140-035 | |
| Penicilina-estreptomicina | BioConcept | 4-01F00H | |
| L-Glutamina 200mM | ThermoFisher | 25030-024 | |
| 2-Mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | 63689-25ML-F | |
| Fator inibidor de leucemia | - | - | Produzido em laboratório por transfecção transitória de células HEK-293T, seguida de coleta e filtragem do sobrenadante. |
| CHIR99021 (Inibidor XVI de GSK-3) | Merck Millipore | 361559 | |
| PD 0325901 | Sigma-Aldrich | 391210-10-9 | |
| Gelatina de pele bovina | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| PBS 10x concentrado de Dulbecco | BioConcept | 3-05K00-I | |
| PBS de Dulbecco sem Ca++/Mg++ | BioConcept | 3-05F29-I | |
| Trypsin-EDTA-Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| D systems | 748-EC-050 | ||
| Hidrato de doxiciclina | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| SNAP-Cell 647-SiR | New England BioLabs | S9102S | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A18967-01 | |
| Nome | Empresa | Número do catálogo | Comentários |
| Software | |||
| FIJI- | - | Software de análise de imagem de código aberto | |
| MATLAB R2014a | Mathworks-Microsoft | ||
| Excel | Microsoft | - |
Referências
- Zhou, P. Determining Protein Half-Lives. Signal Transduct Protoc. , 67-77 (2004).
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P.
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Reimpressões e permissões
