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Artigo de método

Síntese de monócitos-direcionamento do Peptide Amphiphile micelas para a imagem latente da aterosclerose

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⸱

DOI:

10.3791/56625

⸱

17 de novembro de 2017

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Southern California

Neste artigo

Resumo

Este trabalho apresenta um método que envolve a síntese e caracterização de micelas de amphiphile peptídeo monócito-direcionamento e o correspondente ensaios para testar a capacidade do micelle para vincular a monócitos e biocompatibilidade.

Resumo

A aterosclerose é dos principais contribuintes para doenças cardiovasculares, a principal causa de morte no mundo, que reivindica a 17,3 milhões de vidas anualmente. A aterosclerose é também a principal causa de morte súbita e infarto do miocárdio, instigada por placas instáveis que se romper e obstruir o vaso sanguíneo sem aviso. Corrente de imagens modalidades não pode diferenciar entre placas estáveis e instáveis que se romper. Micelas de amphiphiles peptídeo (PAMs) podem superar esta desvantagem, como eles podem ser modificados com uma variedade de direcionamento metades que ligam especificamente ao tecido doente. Os monócitos foram mostrados para ser marcadores início da aterosclerose, enquanto grande acúmulo de monócitos é associado com placas propensas a ruptura. Daí, nanopartículas que podem direcionar os monócitos podem ser usadas para discriminar os diferentes estágios da aterosclerose. Para esse fim, descrevemos aqui, um protocolo para a preparação de monócitos-direcionamento PAMs (monócitos quimiotático proteína-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs self são montadas através de síntese em condições suaves a forma nanopartículas de 15 nm de diâmetro, com perto de carga de superfície neutra. In vitro, PAMs foram encontradas para ser biocompatível e tinha uma afinidade de ligação de alta para os monócitos. Os métodos descritos neste documento são promissores para uma ampla gama de aplicações em aterosclerose, bem como outras doenças inflamatórias.

Introdução

As doenças cardiovasculares continuam a ser as principais causas de morte globalmente com aproximadamente 17,3 milhões de mortes em todo o mundo1. Doenças cardiovasculares são contribuídas por aterosclerose, uma condição em que acumulam placas nas artérias, inibindo assim, sangue e fluxo de oxigênio para as células do corpo2,3. A progressão da aterosclerose envolve o espessamento e endurecimento das artérias por uma resposta inflamatória, metabolismo lipídico irregular e acúmulo de placa bacteriana, levando a placa ruptura e infarto do miocárdio,4,5. Células endoteliais expressam moléculas de aderência e citocinas, que incluem MCP-1 que se liga ao receptor chemokine CC (CCR2) encontrado na superfície de monócitos6,7,8. Colesterol oxidado converte os monócitos em macrófagos durante a fase inicial da formação de placa bacteriana, que amplifica a resposta inflamatória na região e leva à lesão tecidual e a formação de placas instáveis ou vulneráveis9, 10.

Tradicionalmente, a aterosclerose é avaliada através da avaliação de estenose luminal por imagens anatômicas usando ultra-som ou angiografia11,12. No entanto, esses métodos somente podem determinar estreitamento grave da parede arterial e não na fase inicial da aterosclerose, como crescimento de placa inicial provoca remodelamento arterial manter o tamanho da artéria e sangue fluxo taxa12,13, 14. Portanto, angiografia sub-representar prevalência de aterosclerose. Além disso, técnicas de imagem não-invasivas, tais como emissão de fóton único computadorizada tomografia computadorizada, ressonância magnética e tomografia por emissão de pósitrons recentemente tem sido usados para caracterizar a morfologia da placa, como eles podem fornecer detalhes iniciais e caracterização de placas. No entanto, estas modalidades são muitas vezes limitadas pela falta de sensibilidade, resolução espacial, ou exigem o uso de radiação ionizante, fazendo a progressão de placa de imagem em diferentes fases muito mais desafiador15,16, 17. Um sistema de entrega de imagens que iria identificar especificamente placas em diferentes estágios da aterosclerose permanece para ser desenvolvido.

As nanopartículas têm demonstrado ser uma plataforma emergente para na vivo placa diagnóstico e direcionamento18,19,20,21. Em particular, PAMs são vantajosas devido a sua diversidade química e capacidade para acomodar uma variedade de partes, composições, tamanhos, formas e superfície functionalization22. Amphiphiles peptídeo (PAs) consistem de um peptídeo hidrofílico, "headgroup" anexado a uma cauda hidrofóbica, que normalmente são lípidos; Essa estrutura anfifílica confere capacidades auto-montagem e permite uma visualização multivalentes dos peptídeos na superfície da partícula22,23,24. O headgroups de peptídeo pode afetar a forma das partículas através de dobramento e hidrogénio entre peptídeos25. Peptídeos que dobra através da interação de β-folha têm sido mostrados para formar micelas alongadas, enquanto confirmação α-hélice pode formar ambos micelas esféricas e alongadas22,23,24, 2526,de,27. Polietileno glicol (PEG) linkers que protegem a carga superficial do peptide podem ser colocados entre o peptídeo hidrofílico e cauda hidrofóbica do PAMs, aumentando a disponibilidade da nanopartículas na circulação sistêmica28, 29 , 30 , 31. PAMs também são vantajosas porque são biocompatíveis e tem sido demonstrados que têm uma ampla gama de aplicações de32,33. A solubilidade em água de micelas oferece uma vantagem sobre outros sistemas baseados em nanopartículas como certas nanopartículas poliméricas que não são solúveis em água e tem que ser suspenso em solubilizers para injeções34. Além disso, a capacidade de criar PAMs que desmontagem em resposta a um estímulo específico torna PAMs um candidato atraente para drogas intracelular controlada entrega35.

Vinculando-se ao receptor CCR2 e acumular-se no arco aórtico, PAMs anteriormente foram desenvolvidas para monócitos direcionamento para monitorar diferentes fases de lesões ateroscleróticas na aorta9. Em ApoE- / - ratos, acúmulo de monócitos aumenta proporcionalmente a placa progressão36. Além disso, verificou-se que pacientes com estágio final, sujeitos a ruptura de placas contêm quantidades mais elevadas de monócitos37. Portanto, a modificação do PAMs incorporar MCP-1 é útil porque permite maior especificidade de segmentação e diferenciação entre lesões ateroscleróticas e tarde-estágio inicial. Estes estudos de prova de conceito também verificado que PAMs são seguras o suficiente ser usado em pré-clinicamente e são limpas em38. Desde que os monócitos e inflamação são característicos de outras doenças, MCP-1 PAMs têm o potencial para ser usado para aplicações de diagnósticos e terapêuticas em outras doenças além da aterosclerose8,39,40 , 41.

Neste documento, nós relatamos a fabricação de altamente escalável e self montado MCP-1 PAMs que demonstrou o tamanho ideal da partícula, carga de superfície e seleção de alvos para monócitos para aplicativos de imagem aprimorados em aterosclerose.

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Protocolo

Nota: Leia o MSDS para reagentes e siga todas as medidas de segurança química, conforme exigido pela instituição local.

1. preparação de MCP-1 PAMs

  1. Preparação de peptídeo de MCP-1
    1. Pesar 0,25 mmol de Fmoc-L-Lys (Boc)-Wang em uma embarcação da reação (RV). Enxágue o lado do VD com 5 mL dimethylforamide (DMF) em uma coifa de química.
    2. Carrega o RV em um sintetizador de peptídeo de bancada automatizada. Frascos de aminoácido de carga pré-embalados, N '- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C', do C a N-terminal. Incluem um frasco vazio no final para a etapa final de desproteção.
      Nota: Um peptide mexido com sequência, N '- CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C', pode também ser sintetizada utilizando o mesmo protocolo.
    3. Finalizada a síntese, transferi os peptídeos na resina do RV para o frasco de cintilação com 2-3 mL de metanol até todas as resinas são transferidas. Depois que a resina afundou-se no fundo, remover o sobrenadante de metanol e evaporar o restante até secar. Vácuo seco para um adicional 2 h ou durante a noite em temperatura ambiente.
    4. Fazer 12 mL de solução de clivagem contendo trifluoracetic ácido (TFA):ethanedithiol:water:triisopropylsilane 94:2.5:2.5:1 vol % em uma coifa de química. Agite a solução de clivagem para certificar-se que uniformemente misturado.
      Cuidado: Porque triisopropylsilane e Etanoditiol são sensíveis ao ar, argônio limpar estoque frascos de triisopropylsilane e Etanoditiol por 1 min antes de colocá-los de volta.
    5. Coloque o recipiente de síntese (SV) em um agitador de braço pela metade do SV de aperto na parte inferior. Transferência do peptide-resina para o SV com 2 mL de solução de clivagem até que todos os peptídeo-resinas são transferidos.
    6. Lave os lados do SV com 3 mL de solução de clivagem. Feche a tampa do SV e agitar em 300 oscilações/min durante 4 h.
    7. Pese um tubo de centrifugação de 50 mL vazio. Recorde a massa.
    8. Após 4 h, drene a solução de peptídeo clivada de SV no tubo de centrífuga de 50 mL. Enxágue o SV várias vezes com o restante da solução clivagem.
    9. Evapore a solução de peptídeo clivados com nitrogênio até há menos de 4 mL restantes no tubo de centrífuga.
    10. Adicione 36 mL de éter gelada para a solução de peptídeo-fendida.
    11. Vórtice a solução até que ele é completamente branca ou amarela. Centrifugar a 3.000 x g por 5 min a 4 ° C e decante o sobrenadante.
    12. Adicione éter gelada de 40 mL para o tubo. Vórtice e proceda à sonicação novamente. Repita o processo de centrifugação. Decante o sobrenadante.
    13. Seca o sedimento de PA bruto com purgação com gás nitrogênio até o éter é evaporado visivelmente.
    14. Adicionar 20 mL bidestilada água, vórtice e proceda à sonicação até o peptídeo é completamente dissolvido em solução.
    15. Congelar a solução e lyophilize até secar.
    16. Uma vez seco o peptídeo, pese a massa do tubo de centrífuga contendo o peptídeo bruto. Dissolva o peptídeo bruto em 5 mg/mL de água.
    17. Dissolva 25 mg de bruto do peptide de MCP-1 em 5 mL de água bidestilada para fazer uma concentração total de 5 mg/mL. Purificar o peptídeo de MCP-1 bruto por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) utilizando 0,1% TFA em água (solvente A) e 0,1% TFA em acetonitrila (solvente B) como fases móveis em uma coluna de fase reversa C8. Os 5 mL do peptide injete a HPLC.
      Nota: A fase móvel inicial consistia em 100% solvente A um débito de 9,0 mL/min. diminuir solvente A lentamente para 30% em 27 min e manter esta composição de 3 min. o gradiente de solvente 100% de retorno um 3 min e espera para esta composição para 1 min dar um tempo de execução total de 34 min. manter a temperatura da coluna a 55 ° C. Use o modo de fonte de íon positivo para a análise. Ácido fórmico pode ser usado no lugar do TFA, se TFA é muito ácido para a coluna HPLC. Recomenda-se que a velocidade de subida de composição solvente orgânico não deve exceder 2%/min para melhor separação.
    18. Analise cada fração usando espectrometria de massa do laser assistida por matriz (MALDI) de dessorção/ionização o produto esperado m/z no 2.890.
      Nota: Dissolver ácido α-cyano-4-hidroxicinâmicos a 1 mg/mL em acetonitrila/água (50: 50% de vol) como a solução de matriz. Aviste 0,75 µ l da solução de matriz na chapa de MALDI, seguida de 0,75 µ l de cada fração. Realizar a análise utilizando um modo reflexivo de íon positivo em uma faixa de massa de 500-5.000 Da.
    19. Combine fracções de produto, explodir acetonitrilo, congelar e lyophilize peptídeos purificados até secar.
  2. Preparação de MCP-1 PA
    1. Prepare um excesso molar 1.1 de 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-PEG (2000)-maleimide de peptídeo em frascos separados de cintilação. Dissolver os dois compostos em água bidestilada tornar ~ 15 mg/mL. Proceda à sonicação por 15 min ou até que ambas as soluções são completamente claras.
      Nota: DSPE-PEG (2000)-Cy5 é sintetizado usando o mesmo protocolo com DSPE-PEG-amina (2000) e N-Hidroxisuccinimida (NHS) acrescida de éster Cy5, exceto passo 1.2.3, onde o pH da solução é ajustado para 8,5.
    2. Adicione DSPE-PEG (2000)-maleimide solução para a solução de peptídeo. Vórtice e proceda à sonicação.
    3. Adicionar 1 M NaOH gota a gota (1 µ l) de cada vez até que o pH da solução é 7.
    4. Solução de expurgo de nitrogênio por 5 min. agitar a solução durante a noite.
    5. Congelar a solução e lyophilize até secar.
    6. Uma vez seco o produto bruto, dissolva o sólido em 5 mg/mL de água.
    7. Purifica com HPLC como descrito acima.
      Nota: Na Unconjugated peptídeo e DSPE-PEG(2000) eluir entre 15-30% de concentração orgânica (% vol), enquanto DSPE-PEG (2000)-MCP-1 conjugado deve eluir entre 40-50% de concentração de orgânicos.
    8. Analise cada fração usando espectrometria de massa MALDI para o correspondente m/z DSPE-PEG (2000)-MCP-1 deve ter um pico m/z amplo no 5.760.
      Nota: o ácido benzoico-2,5 é melhor usado como matriz para DSPE-PEG (2000)-MCP-1 com MALDI.
  3. Montagem de MCP-1 PAMs
    1. Dissolver 1,75 mg PAs de MCP-1, com 3 mL de metanol em um frasco de dram com 1. Proceda à sonicação até o MCP-1 PA é completamente dissolvido.
      Nota: Amphiphiles Cy5 podem ser incorporados em uma relação molar de 10:90 MCP-1 PA para aplicativos de imagem.
    2. Evapore o metanol sob nitrogênio em movimentos circulares enquanto enxaguar o restante metanol fora do frasco até um filme uniforme é formado na parte inferior do frasco. Vácuo-seco o filme durante a noite.
    3. Hidrate o filme com 3 mL de tampão de água ou fosfato salino (PBS) para fazer uma solução de 100 µM de MCP-1 PAMs. Suavemente o vórtice e proceda à sonicação a solução até que desobstruído. Incube a 80 ° C por 30 min.
      Nota: A temperatura elevada tem sido mostrada para acelerar o processo auto-montagem e permite que o componente de peptídeo formar a estrutura secundária mais estável, reduzindo a concentração (CMC) de crítica micelle42,43.
    4. Legal a dispersão resultante a temperatura ambiente.

2. caracterização de MCP-1 PAMs

  1. Difusão dinâmica da luz (DLS) e potencial zeta
    1. Lugar de 100 µM de MCP-1 PAM ou mexida PAM em uma cubeta de acordo com as instruções do instrumento potencial DLS ou zeta.
      Nota: DLS e zeta potenciais cubetas podem ser diferentes com base nas instruções do instrumento.
    2. Equilibrar o instrumento à temperatura ambiente. Medir o tamanho e carga superficial do PAM.
  2. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM)
    1. Adicionar 7 µ l de 50 µM MCP-1 PAM ou mexida PAM para um grid TEM suspensos dentro de uma pinça de auto-fechamento 5 min. pavio fora a gota com uma limpeza delicada tarefa.
    2. Adicione 7 µ l de água para lavar a grade. Pavio-embora o droplet.
    3. Adicione 7 µ l de ácido fosfotúngstico 1 wt % por 2 min. pavio fora da gota. Repita a etapa 2.2.2.
    4. Seque a grade TEM antes da análise de temperatura.
  3. Espectroscopia de Dicroísmo circular (CD)
    1. Ligue o nitrogênio por 5-10 min antes da utilização do instrumento.
    2. Coloque 300 µ l de espaço em branco (água ou PBS) na cubeta.
    3. Medir espectros no 190-265 nm, 0.2 mm-comprimento do percurso com um tempo de integração s 1 e uma largura de 1, banda nm na temperatura ambiente. Colete 3 repetições.
    4. Peptídeo de MCP-1 medida de 100 µM, MCP-1 PAM, mexidos do peptide e mexidos PAM sob a mesma condição descrita na etapa 2.3.3. Subtrai o espaço em branco.
    5. Ajuste os dados usando uma interpolação linear dos espectros de base polylysine.
    6. Desligue o instrumento. Espere 10 min antes de desligar o nitrogênio.

3. análise in Vitro de MCP-1 PAMs

  1. Biocompatibilidade in vitro
    1. Cultura e expandir WEHI 274.1 murino monócitos em modificado Eagle suplementado de Dulbecco com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% penicilina-estreptomicina e 0,05 mM 2-Mercaptoetanol em 37 ° C abaixo de 5% de CO2 para passagem 5.
      Nota: WEHI 274.1 são células de suspensão. Quando o cultivo, a mídia deve ser alimentada a cada 2-3 dias.
    2. Monócitos de pipeta nos meios de comunicação em um tubo de centrífuga de 50ml estéril. Centrifugação a 300 x g por 5 min a 4 ° C.
    3. Aspirar a velha mídia e ressuspender em mídia fresco 10 mL no tubo de centrífuga. Misture lentamente até que as células são distribuídas uniformemente na mídia. Conte as células com coloração azul trypan e um hemocytometer.
    4. Dilua as células que existem 4.000 monócitos por 90 µ l de mídia por bem. Adicione 90 µ l de células em poços de uma placa de 96 poços. Incube durante 24 h.
      Nota: Evite usar os poços na borda exterior da placa para evitar diferenças de evaporação e mudanças térmicas na placa. Encha os poços exteriores com 100 µ l PBS.
    5. Dissolva 0,15 µmol de peptídeo MCP-1, PAM de MCP-1, peptídeo mexido ou ovos mexidos-PAM em 150 µ l PBS, em separado, esterilizado microcentrifuga tubos. Realize uma diluição serial para fazer 65 µ l de 1, 10 e 100 µ m de cada amostra.
    6. Adicionar 10 µ l PBS de cada concentração em poços contendo WEHI 274.1 (total volume: 100 µ l por bem, 6 linhas, 96 poços totais). Incube durante 72 h.
    7. Adicionar 10 µ l (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS) em cada poço. Incube durante 1 h.
    8. Analisar a absorvância usando um leitor de placas em 490 nm ou com base nas instruções do fabricante.
  2. Vinculação de micela em vitro
    1. Monócitos de semente 500.000 em cada poço de uma placa de 6 em 2 mL de mídia contendo 100 µM Cy5-rotulado PAM de MCP-1 (10:90 razão molar de DSPE-PEG (2000)-Cy5 e MCP-1 PA). Incube durante 1 h.
    2. Coletar WEHI 274.1 por centrifugação a 300 x g por 5 min a 4 ° C. Aspire os meios de comunicação.
    3. Resuspenda e lavar as células em 2 mL de PBS. Centrifugação a 300 x g por 5 min a 4 ° C. Aspire a PBS. Repita o processo de lavagem com 2 mL de PBS. Aspire a PBS.
    4. Adicione 2 mL de frio paraformaldeído 4% para consertar as células. Incube a temperatura ambiente por 10 min.
    5. Pipetar as células fixas sobre uma lamela de vidro estéril dentro poços de uma placa de 6. Centrifugar a 400 x g durante 5 min.
    6. Remova o paraformaldeído. Lave e enxágue com 2 mL de PBS uma vez. Resuspenda com 1 mL de PB
      Nota: Quando enxaguar, evite perturbar as células no sentido da lamela.
    7. Colocar 10 µ l de 90% de glicerol em PBS para um slide. Use uma agulha e uma pinça para pegar a lamela. Seque a extremidade da lamela. Coloque delicadamente a lamela numa lâmina voltada para baixo.
    8. Selo gentilmente a extremidade da lamela com esmaltes claros. Coloque na geladeira até que esteja pronto para a imagem latente.
    9. Usar um laser confocal microscópio (CLSM) instalado com lasers para Cy5 em λexcitação = 650 nm.

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Resultados

Preparação de MCP-1 PAM
O CCR2-motivo (resíduos 13-35) da proteína de MCP-1 [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] ou mexido peptídeo [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] foi modificado com a adição de um resíduo de cisteína na N-terminal. O peptídeo de MCP-1 foi sintetizado por um método de fase sólida Fmoc-negociada usando um sintetizador de peptídeo automatizado. O peptídeo bruto foi purificado por HPLC de fase reversa em uma coluna de C8 a 50 ° C, utilizando 0,1% TFA em misturas acetonitri...

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Discussão

MCP-1 PAMs são uma promissora plataforma de imagem molecular, consistindo de um peptídeo alvo hidrofílico e cauda hidrofóbica que impulsiona a natureza Self montada das nanopartículas. Este micelle monócito-direcionamento pode ser preparado por síntese simples e etapas de purificação de peptídeo de MCP-1 e DSPE-PEG (2000)-MCP-1. PAMs têm muitas características benéficas na vivo imagem molecular tais como seus auto-montagem sob condições suaves, biodegradabilidade intrínseca e diversidade estrutural e química, pe...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostaria de agradecer o apoio financeiro da University of Southern California, o coração nacional, pulmão e Instituto de sangue (NHLBI), R00HL124279, Eli e Edythe amplo Innovation Award e o L.K. Whittier Fundação Non-câncer Prêmio de pesquisa translacional concedida a EJC. Os autores agradecer o centro de microscopia eletrônica e microanálise, centro de excelência em NanoBiophysics, centro de excelência para a caracterização Molecular e Translational Imaging Center na Universidade de Southern California para assistência em configurações de instrumentais.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1,2-etanoditalVWRE0032para síntese de peptídeos
10 mL pipetas serológicas descartáveisVWR89130-898para cultura de células
tubos de centrífuga de 15 mL, polipropilenoVWR89401-566para várias aplicações
Ácido 2,5-di-hidroxibenzóico, 99%Fisher ScientificAC165200050para MALDI
25 mL descartável pipetas serológicasVWR89130-900para cultura de células
2-mercaptoetanol, 50 mMThermoFisher Scientific31350010para cultura de células
5 mL pipetas serológicas descartáveisVWR89130-896para cultura de células
tubos de centrífuga de 50 mLVWR89039-658para várias aplicações
Balão de cultura de 75 cm2Fisher Scientific13-680-65para cultura de células
75 mL de vaso de reaçãoProtein Technologies3000005para síntese de peptídeos
Placa de cultura de células de 96 poçosVWR40101-346para ensaio MTS
Acetonitrila, grau HPLCFisher ScientificA998SK-4para purificação por HPLC
Vidro de borossilicato, 1 dramVWR66011-041para síntese de PAM
Pipeta de vidro borosicado, pontas compridasVWR14673-043para várias aplicações
Lamínula, 0,16-0,19 mm, 22 x 22 mmFisher Scientific12-542Bpara microscopia
confocal Cy5 aminaAbcamab146463para conjugação peptídica
Éter dietílico, grau ACSFisher ScientificE138-1para precipitação peptídica
Descartável seringas, 20 mLFisher Scientific14-817-54para purificação de HPLC
Duplo hemocitômetro neubauer governadoVWR63510-13para contagem
de células DSPE-PEG (2000) aminaAvanti880128Ppara conjugação de peptídeos
DSPE-PEG (2000) maleimidaAvanti880126Ppara conjugação de peptídeos
DSPE-PEG (2000) -NHS éster NanocsPG2-DSNS-10Kpara conjugação com Cy5
Dulbecco's modified eagle médio-alto glicoseSigma AldrichD5796-500MLpara cultura de células
Soro fetal bovino, qualificado, inativado por calorThermoFisher Scientific10438026para cultura de células
Fmoc-L-Ala-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Apara síntese de peptídeos
Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-RBFpara síntese de peptídeos
Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-NTpara síntese de peptídeos
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-CTpara síntese de peptídeos
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-QTpara síntese de peptídeos
Fmoc-L-Ile-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Ipara síntese de peptídeos
Fmoc-L-Leu-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Lpara síntese de peptídeos
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-KBCpara síntese de peptídeos
Fmoc-L-Phe-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Fpara síntese de peptídeos
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-SBpara síntese de peptídeos
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-TBpara síntese de peptídeos
Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-YBpara síntese de peptídeos
Fmoc-L-Val-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Vpara síntese de peptídeos
Resina Fmoc-Lys(Boc)-wang, malha 100-200856013 Novabiochempara síntese de peptídeos
Ácido fórmico, ótimo grau LC/MSFisher ScientificA117-50para purificação por HPLC
GlicerolVWRM152-1Lpara microscopia confocal
Contador de contagem manualFisher ScientificS90189para contagem de células
Barras de agitação magnéticas, VWR58949-006ovo para conjugação de peptídeos
Metanol, certificado ACSFisher ScientificA412-4para síntese de PAM
Kit de ensaio colorimétrico de proliferação celular MTSVWR10191-104para ensaio MTS
N,N-Dimetilformamida, grau de sequenciamentoFisher ScientificBP1160-4para síntese de peptídeos
N-metilmorfolinaProtein TechnologiesS-1L-NMMpara síntese de peptídeos
ParaformaldeídoFisher ScientificAC416780250para fixação de células
PBS, pH 7.4ThermoFisher Scientific10010049para várias aplicações
Penicilina/estreptomicina, 10.000 U/mLThermoFisher Scientific15140122para cultura de células
Vaso de síntese de peptídeos, 25 mL& nbsp;Fisher ScientificCG186011para síntese de peptídeos
Ácido fosfotúngstico Fisher ScientificA248-25para TEM
Espectro de PiperidinaP1146-2.5LTGLpara síntese de peptídeos
Lâmina de microscópio de vidro simples 75 x 25 mmFisher Scientific12-550-A3para microscopia confocal
Reservatórios de reagentes, estéreis VWR95128093para cultura de células
Pinça de fechamento automáticoTedPella515para TEM
Filme de suporte TEMTedPella01814Fpara TEM
Ácido trifluoroacético Fisher ScientificBP618-500para clivagem de peptídeos e purificação por HPLC
TriisopropilsilanoVWRTCT1533-5mlpara clivagem de peptídeos
Solução de azul de tripano, 0,4%ThermoFisher Scientific15250061para contagem de células
Pinça, serrilhada de uso geralVWR231-SA-SEpara microscopia confocal
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automatizado sintetizador de peptídeos de bancadaProtein TechnologiesPS3 Sintetizador de peptídeos de bancada
&alfa; - ciano- 4- ácido hidroxicinâmico, 99%Sigma Aldrich476870-2Gpara MALDI
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