Aplicação de medida de eletrofisiologia para estudar a atividade de transportadores de Electro-neutro

Victor Babich; Matthew K. Henry; Francesca Di Sole

doi:10.3791/56630

Artigo de método

Aplicação de medida de eletrofisiologia para estudar a atividade de transportadores de Electro-neutro

DOI:

10.3791/56630

⸱

3 de fevereiro de 2018

Victor Babich¹^,² , Matthew K. Henry¹ , Francesca Di Sole¹

¹Physiology and Pharmacology Department, Des Moines University, ²School of Liberal Arts and Sciences, Mercy College of Health Sciences

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este manuscrito descreve as aplicações dos eletrodos seletivos-próton e patch aperto métodos para medir a atividade dos sistemas de transporte de prótons. Esses métodos de superar algumas limitações das técnicas comumente utilizadas para estudar a actividade de transporte de prótons, como sensibilidade moderada, resolução de tempo e controle do meio intracelular insuficiente.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O transporte de íons através das membranas celulares garante o controle fino de ião dentro e fora da célula que é indispensável para a sobrevivência da pilha. Estes mecanismos de transporte são mediados pela actividade de proteínas de transporte especializado. Especificamente, dinâmica de pH é finamente controlada por sistemas de extrusão de prótons (H⁺) de membrana plasmática, tais como o at⁺/h⁺ família de proteínas de cambista (NHE). Apesar de extensos esforços para estudar os mecanismos subjacentes Regulamento NHE, nossa compreensão atual das propriedades biofísicas e moleculares da família NHE é inadequada, devido à limitada disponibilidade de métodos para medir efetivamente a atividade NHE . Neste manuscrito, usamos H⁺-eletrodos seletivos durante a célula inteira remendo gravação aperto para medir o fluxo induzido por NHE H⁺ . Propusemos que esta abordagem para superar algumas limitações do normalmente usado métodos para medir atividade NHE, como absorção radioativa e fluorescente membrana permeants. Medição de atividade NHE, usando o método descrito permite alta sensibilidade e resolução de tempo e controle mais eficiente das concentrações intracelulares de H⁺ . H⁺-eletrodos seletivos são baseado no fato de que a atividade de transporte cria um gradiente de íon nas proximidades da membrana celular. H⁺-elétrodo seletivo do movimento até e fora da membrana celular, de forma repetitiva, oscilatória registra uma diferença de tensão que é dependente do fluxo de H⁺ . Enquanto H⁺-eletrodos seletivos são usados para detectar o fluxo de H⁺ , movendo-se fora da célula, o método de braçadeira do remendo na configuração da célula inteira é utilizado para controlar a composição iônica intracelular. Além disso, aplicação da técnica da pinça gigante patch permite a modificação da composição intracelular de íons, não só mas também lípidos. A atividade de transportador de NHE isoform 3 (NHE3) foi medida usando esta abordagem técnica para estudar a base molecular do Regulamento NHE3 pelo remodelamento.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transporte de íons e solutos através da membrana de plasma é essencial para a sobrevivência das células e, portanto, de organismos¹. Transporte seletivo de íons e solutos é alcançado por uma matriz de canal especializado e proteínas de transporte. Mutações nestas proteínas geralmente resultam em uma variedade de condições clínicas, canal e transportador proteínas alvos em potencial para o tratamento farmacológico¹de renderização. Infelizmente, compreender os mecanismos subjacentes a função canal e transportador e regulamento é muitas vezes limitada pelas abordagens disponíveis para estudar sua atividade^....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nota: Dois amplificadores são necessárias para gravar a atividade dos transportadores de electroneutral por uma auto-referência ISE em conjunto com o patch de aperto, um amplificador de braçadeira do remendo para manter a célula em uma configuração de células inteiras e um (amplificador de alta impedância eletrômetro) para registrar a atividade de transporte através do ISE (ver tabela de materiais). O amplificador de braçadeira do remendo está directamente ligado ao terminal da placa de aquisição. O eletrômetro é ligado ao amplificador diferencial utilizado para filtrar e amplificar o sinal. O amplificador diferencial é conectado ao terminal da placa de aquisição. Cap....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uma auto-referência ISE durante a gravação de braçadeira do remendo de célula inteira foi aplicado para estudar a regulamentação da atividade de NHE3 pelo remodelamento. PS120 células de fibroblastos,²⁴, que falta a expressão da membrana plasmática endógena laiane, foram usados. NHE3 selvagem-tipo (NHE3-wt) ou NHE3 mutantes que não vincular remodelamento [tirosina 501, 503 de arginina e lisina 505 foram substituídos com alanina, Y501A/R503A/K505A (NHE3-YRK)] estàve.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apesar das funções cruciais de transportadores, os métodos disponíveis para estudar sua atividade são inadequado e ineficaz. Uma limitação é que os métodos disponíveis medem o movimento de iões mediado pela atividade de transporte, sem considerar as flutuações na composição iônica intracelular durante o experimento⁴. O método apresentado garante um controle preciso de composições de íon extracelular e intracelular e oferece uma poderosa ferramenta para modificar intracelular de iões, proteínas e l.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostaria de agradecer Eric Fishback (Universidade de Des Moines, Des Moines, Iowa, EUA) pela ajuda com gravação e edição de vídeo. As células de fibroblastos, como PS120 estàvel expressando NHE3-wt ou NHE3-YRK foram gentilmente cedidas pelo Dr. Mark Donowitz (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, EUA).

....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Amplificador de grampo de remendo Molecular	Devices
Eletrômetro diferencial de canal duplo (HiZ-223)	Amplificador diferencial Warner Instruments	64-1650
(DP-301)	Warner Instruments	64-0044
Software de grampo de remendo baseado em MatLab	MatLab com caixa		O software capmeter é recomendado
Sistema de Controle de Temperatura ThermoClamp-1	Controlador	Aquecedor em Linha	AutoMate Scientific 03-11-LL
(TC-324C)	Warner Instruments	64-2400
Tubo de Vidro Borosilicato Padrão de Barril Único	World Precision Instruments	1B120F-3	Usado para eletrodos seletivos de íons
Frasco de Armazenamento de Micropipetas	World Precision Instruments	E212
Bis(dimetilamino)dimetilsilano	Sigma-Aldrich	14755-100ML
Tetracloreto de carbono	Sigma-Aldrich	319961-500ML
Ionóforo de hidrogênio I - coquetel B	Sigma-Aldrich	95293
	Instrumento Sutter	B200-156-15	Usado para pipeta de patch clamp
Vidro macio (Corning 8161 Patch Glass)	Warner Instruments	64-0815
Tubo Capilar de Sílica (150um OD/75um ID)	Molex (Polymicro Technologies)	106815-0018	Usado para sistema de perfusão intra-pipeta
Cloreto de potássio	Sigma-Aldrich	P9333
Aspartato de potássio	Sigma-Aldrich	A6558
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Cloreto de magnésio	Sigma-Aldrich	M4880
Mg-ATP	Sigma-Aldrich	A9187
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
MES	Sigma-Aldrich	M3671
Cloreto de cálcio	Sigma-Aldrich	C5670
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
Ácido clorídrico	Sigma-Aldrich	H1758
Apirase	Sigma-Aldrich	A6535
Fosfatidilinositol (4,5) bifosfato diC8	Echelon Biosciences	P-4508
Fosfatidilinositol 3,4,5-trisfosfato diC8	Echelon Biosciences	P-3908

de ferramentas de aquisição de Temperatura de Canal Único para Tubo de Borosilicato de Parede Fina

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities. Biochem Pharmacol. , (2017).
Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. Ion fluxes in giant excised cardiac memb....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Microeletrodo Seletivo a Pr tons Patch Clamp de C lula Inteira Trocador S dio Hidrog nio Medi o da Atividade do NHE3 T cnica de Patch Gigante Sistema de Perfus o Intracelular Detec o de Fluxo I nico Regula o de Fosfoinosit deos Medi o do Fluxo de H

Aplicação de medida de eletrofisiologia para estudar a atividade de transportadores de Electro-neutro

Neste artigo

Resumo

Resumo

Introdução

Protocolo

Resultados

Discussão

Divulgações

Agradecimentos

Materiais

Referências

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Artigos relacionados