Este protocolo descreve um método novo para investigar uma forma de neuroestimulação química do wholemount rato as retinas em vitro com o neurotransmissor glutamato. Neuroestimulação química é uma alternativa promissora para a neuroestimulação elétrica convencional de neurônios da retina no tratamento de cegueira irreversível, causada por doenças degenerativas fotoreceptor.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Metodologia para neuromodulação Biomimetic químico de Retinas de ratos com o neurotransmissor glutamato em Vitro
Neste artigo
Resumo
Resumo
Doenças degenerativas fotorreceptoras causam cegueira irreparável através da perda progressiva de células fotorreceptoras na retina. Próteses da retina são um tratamento emergente para fotorreceptoras doenças degenerativas que visam restaurar a visão, artificialmente estimulando os neurônios da retina sobreviventes na esperança de suscitar compreensível percepção visual em pacientes. Atual da retina próteses têm demonstrado sucesso em restaurar a visão limitada aos pacientes usando uma matriz de eletrodos para eletricamente estimular a retina, mas enfrentam barreiras físicas substanciais na restauração de alta acuidade, visão natural aos pacientes. Neuroestimulação química usando neurotransmissores nativos é uma estimulação alternativa elétrica biomimetic e poderia contornar as limitações fundamentais associadas com as próteses da retina usando neuroestimulação elétrica. Especificamente, neuroestimulação química tem o potencial de restaurar a visão mais natural com comparáveis ou melhores acuidades visual aos pacientes através da injeção de quantidades muito pequenas de neurotransmissores, os mesmos agentes naturais de comunicação utilizados pela retina sinapses químicas, a resolução muito melhor do que a corrente elétricas próteses. No entanto, como um paradigma de estimulação relativamente inexplorada, não há nenhum protocolo estabelecido para alcançar a estimulação química da retina em vitro. O objetivo deste trabalho é fornecer um quadro pormenorizado para realizar estimulação química da retina para os investigadores que desejem estudar o potencial de neuromodulação química da retina ou similar de tecidos neurais em vitro. Neste trabalho, descrevemos a instalação experimental e metodologia para suscitar ganglionares da retina célula (RGC) pico respostas para visual luz respostas semelhantes no tipo selvagem e wholemount fotorreceptoras-degenerou as retinas de rato pela injeção controlada de volumes de o glutamato neurotransmissor no espaço subretinal utilizando Micropipetas de vidro e um dispositivo microfluidic multiport personalizado. Esta metodologia e protocolo são gerais o suficiente para ser adaptado para neuromodulação usando outros neurotransmissores ou até mesmo outros tecidos neurais.
Introdução
Fotoreceptor doenças degenerativas, como retinite pigmentosa e degeneração macular relacionada à idade, são principais causas herdáveis da perda da visão e são atualmente incurável1,2. Embora essas doenças surgem de uma variedade de mutações genéticas específicas, doenças degenerativas fotorreceptoras caracterizam-se como um grupo pela perda progressiva das células fotoreceptoras na retina, que eventualmente causa cegueira. A perda de gatilhos de fotorreceptores generalizadas de remodelação em toda a retina, mas sobrevivendo os neurônios da retina, incluindo as células bipolares e RGCs, permanecem intactas e relativamente funcional mesmo em estágios avançados de degeneração de fotorreceptoras3 ,4,5,6,7.
Os mecanismos e patologias destas doenças foram bem caracterizadas3,4,5,6,7 , mas ainda não se alcançou um tratamento eficaz. Nas últimas três décadas, pesquisadores em todo o mundo têm investigado uma variedade de tratamentos terapêuticos para restaurar a visão para as pessoas afectadas com doenças degenerativas fotoreceptor, incluindo gene terapia8, tratamento de células-tronco9, transplante de retina10e estimulação artificial11,12 dos neurônios sobreviventes da retina. Destes, o mais clìnica disponível é próteses da retina, que são dispositivos de neuroestimulação artificial que tradicionalmente têm utilizado uma matriz de eletrodos para estimular eletricamente a células bipolares ou RGCs em padrões específicos, com o objetivo de Criando percepções visuais artificiais em pacientes11. Próteses elétrica da geração atual, como o Argus II13 e dispositivos de14 alfa-IMS, alcançaram aprovação clínica e estudos preliminares indicaram que pode melhorar a qualidade de vida para pacientes restaurando um medida da visão usando epiretinal (frente da retina) e apresentam (parte traseira do retina) implantados dispositivos15,16. Grupos de pesquisa ao redor do mundo estão trabalhando em próteses da retina, além dos sucessos desses dispositivos da primeira geração17,18,19,20 a avançar mas têm enfrentado dificuldades de projetar uma prótese elétrica capaz de restaurar a visão de alta acuidade, abaixo do nível de cegueira legal aos pacientes. Estudos recentes têm mostrado que alcançar maior resolução espacial que isso habilitado pela atual geração elétrica com base em próteses é um desafio por causa do limite de injeção de carga, que exige o uso de grandes eletrodos para estimular com segurança neurônios da retina ao custo de resolução espacial, ou seja, a acuidade visual11,21. Além disso, a estimulação elétrica é mais limitado porque normalmente estimula todas as células vizinhas e portanto provoca percepções antinaturais e confusas em pacientes, em grande parte porque é um paradigma de estimulação inerentemente antinatural21. No entanto, os sucessos iniciais de estimulação elétrica demonstraram que a neuroestimulação artificial pode ser um tratamento eficaz para doenças degenerativas fotoreceptor. Isto leva-na hipótese de que um tratamento mais eficaz pode ser viável, estimulando a retina com produtos químicos de neurotransmissor, os agentes naturais de comunicação em sinapses químicas. O objetivo do método apresentado neste artigo é explorar a viabilidade terapêutica de estimulação química, que procura imitar o sistema natural de comunicação sináptica entre os neurônios da retina, como uma estimulação alternativa elétrica biomimetic para uma prótese de retina.
Tradução do conceito de estimulação química terapêutica para uma prótese de retina química baseia-se quimicamente, ativando os neurônios da retina do alvo com pequenas quantidades de neurotransmissores nativos, como o glutamato, lançado através de um microfluídicos dispositivo composto por uma grande variedade de microports em resposta a estímulos visuais. Desta forma, uma prótese retiniana química seria essencialmente uma camada de fotorreceptoras artificial biomimético que traduz fótons naturalmente atingindo a retina para sinais químicos. Uma vez que estes sinais químicos usam os mesmos neurotransmissores utilizados na sinalização da retina normal e estimulam os neurônios da retina sobreviventes de um degenerado retina através da vias sinápticas mesmas usado por caminhos de visão normal, o visual resultante percepção conseguida através de uma prótese de retina química poderia ser mais natural e compreensível em relação a um evocado através de uma prótese elétrica. Além disso, desde que o microports através do qual os neurotransmissores são liberados podem ser feitas extremamente pequeno e matriz de alta densidade, ao contrário dos eléctrodos, um potencial químico protético pode ser capaz de atingir mais estímulo focal e maior espacial resolução de uma prótese elétrica. Assim, baseando-se estas vantagens potenciais, uma prótese de retina química oferece uma alternativa altamente promissora para próteses elétricas.
Estimulação química da retina, no entanto, tem sido relativamente pouco explorada até recentemente. Enquanto a estimulação elétrica da retina foi bem caracterizada ao longo de décadas de trabalho através de de22, em vitro23, na vivo23,24e estudos clínicos13 ,14, estudos sobre estimulação química têm sido limitados exclusivamente para alguns em vitro obras25,26,,27,28. Iezzi e Finlayson26 e Andre et al 27 demonstrou epiretinal estimulação química da retina em vitro usando um único eletrodo e uma matriz multielectrode (MEA), respectivamente, para gravar as respostas de glutamato evocado dos neurônios da retina. Mais recentemente, Rountree et al 28 demonstraram a estimulação diferencial das vias e desligar da retina usando glutamato de lado subretinal e um MEA para gravar as respostas neuronais de diversos sites na retina.Embora essas obras estabeleceram preliminarmente a viabilidade da estimulação química, mais estudos são essenciais para investigar muitos aspectos dessa abordagem além daqueles abordados até agora25,26,27 , 28e ajustar os parâmetros de estimulação terapêutica em modelos animais, tanto in vitro e in vivo antes de traduzir este conceito para uma prótese de retina química, como discutido acima. No entanto, atualmente não há nenhuma metodologia estabelecida para realizar estimulação química da retina na literatura e os métodos utilizados em obras anteriores não foram descritos em detalhes como seria essencial para estudos replicative. Portanto, a justificativa para este papel de métodos é fornecer uma estrutura bem definida para a realização em vitro química estimulação da retina para os investigadores interessados ou replicar nossos estudos anteriores27, 28 ou avançando ainda mais este conceito emergente de neuroestimulação química.
Aqui vamos demonstrar um método para a condução em vitro química estimulação dos neurônios da retina em wholemount retinas de ratos do selvagem-tipo e um modelo de rato degenerado fotorreceptoras que imita pròxima a progressão do fotoreceptor degenerativa doenças em seres humanos. A lógica por trás do desenvolvimento deste método de estimulação em modelos em vitro é avaliar a terapêutica varia de vários parâmetros de estimulação e estudar as características de resposta neural que seriam impossível ou difícil de observar no em vivo modelos, especialmente durante os estudos iniciais focado em avaliar a viabilidade desta abordagem. Neste procedimento, mostramos o único site e simultâneos multissite estímulos químicos da retina entregando pequenas quantidades de glutamato 1 mM perto de neurônios da retina de destino via Micropipetas de vidro de porta única comercialmente disponível e um costume dispositivo de multi-porta microfluidic microusinado, respectivamente. Enquanto estímulos tanto sites multi e single-site realizar o objectivo básico de investigar a viabilidade terapêutica de neuromodulação química, cada um serve a um propósito distinto com uma vantagem única. A estimulação de site único, que pode ser realizada com Micropipetas de vidro pré-puxada comercialmente disponível, pode ser usada para injetar produtos químicos diretamente no subsolo da retina em um único local e serve para investigar se observável RGC spike taxa respostas que são semelhantes às respostas luz visualmente evocadas podem ser eliciadas focally sob o local da injeção. Por outro lado, estimulação de vários local, que requer um dispositivo microfluidic multiport especialmente fabricados, pode ser usada para injetar produtos químicos espacialmente em vários sites sobre a superfície da retina e serve para investigar como glutamato-evocada RCG padrões de resposta correspondem os padrões de injeção de glutamato em estudos de estimulação padrão.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os animais de experimentos foram conduzidos em conformidade com as directrizes delineadas pelo guia do Conselho Nacional de pesquisa para o cuidado e o uso de animais de laboratório. Protocolos de tratamento e eutanásia animais foram revistos e aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Illinois em Chicago e institucional Cuidado Animal.
1. animais modelos
- Ratos de Long-Evans do selvagem-tipo
- Adquirir um rato de longa Evans Hooded selvagem-tipo 24-32 dias de idade de ambos os sexos gerado com um ritmo dia/noite do padrão 12 h.
- Escuro adaptar o rato, colocando-o em uma sala completamente escura durante 1 h antes de começar o experimento.
- S334ter-3 ratos
- Abusa albino transgénicos homozigotos S334ter-3 rato (ambos os sexos), expressando a duas cópias do gene mutante rodopsina, com um rato de Long-Evans pigmentado do selvagem-tipo para produzir ratos de S334ter-3 heterozigotos pigmentados que apresentam degeneração fotorreceptoras semelhantes na progressão para humano retinite pigmentosa29,30.
- Criar descendentes heterozigotos com ritmo dia/noite de 12h padrão e usar ratos de ambos os sexos para experiências das seguintes idades correspondentes às seguintes etapas de degeneração fotoreceptoras: degenerescência precoce: 14-20 dias de idade; Degenerescência do meio: 21-27 dias de idade; Degenerescência tarde: 28-35 dias de idade; Completamente cego: > 50 dias de idade.
- Escuro adaptar o rato, colocando-o em uma sala completamente escura durante 1 h antes de começar o experimento.
2. preparação da solução média Ames e sistema de perfusão
Figura 1: esquema de instalação experimental. Esquema da instalação experimental para a estimulação química utilizando uma micropipeta de vidro (A) e um dispositivo personalizado microfluidic multiport (B). A retina é colocada em um pMEA e continuamente perfundida com solução de médio de Ames do fresca, oxigenada da parte superior e inferior através da pMEA perfurações. Sinais de resposta neural captados pelos eléctrodos do pMEA são alimentados através do amplificador MEA em um computador de aquisição de dados. Estimulação visual e química são realizadas usando um LED verde e o injetor de pressão de 8 canais, respectivamente, e ambos os estímulos são acionados por um computador dedicado estímulo, que também é usado para posicionar a pipeta através de uma precisão de 3 eixos micromanipulador. Um microscópio invertido é usado para observar a retina durante um experimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: configuração Experimental. (A) fotografia da instalação experimental completa mostrando as posições relativas de todos os componentes. O sistema de amplificador MEA é colocado em cima de um microscópio invertido, que é usado para inspecionar visualmente a retina e a imagem digitalmente a interface de dispositivo-retina através da câmera de alta velocidade conectada durante o experimento. Perfusão de superior e inferior são controlados independentemente através de um sistema de perfusão de solenoide controlada. Injeção, controle de posição e medidas de impedância são realizadas usando um injetor de pressão, micromanipulador e amplificador de braçadeira do remendo (laranja caixa; mostrado em mais detalhes em B), respectivamente. A micropipeta ou o dispositivo é inserido em um headstage de braçadeira do remendo para medições de impedância e montado sobre um pórtico (indicado pela caixa verde; mostrado em mais detalhes em C) para facilitar o posicionamento usando um micromanipulador. (B) um close-up dos instrumentos de medição e controle utilizado no experimento: o injetor de pressão de 8 canais, sistema de controle de micromanipulador, amplificador de braçadeira do remendo para medição de impedância e o navio de sucção para eliminação de perfusão. (C) um close-up do pórtico do sistema de injeção mostrando um dispositivo multiporta interfaceado com o titular da pipeta, headstage de braçadeira do remendo e micromanipulador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: configuração de perfusão. (A) fotografia do topo do amplificador MEA mostrando a localização da perfusão superior e sucção, bem como o LED verde usado para estimulação visual de luz. (B) um close-up da câmara de perfusão pMEA ilustrando as localizações precisas da perfusão superior e sucção, o pMEA e o eletrodo de referência utilizado para a medição de impedância. (C) uma Fotomicrografia da perfusão da placa de base. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Nota: Ver Figura 1e Figura 2 Figura 3
- Meça 900 mL de água desionizada, à temperatura ambiente (~ 21 ° C) e coloque no recipiente de 1 L.
- Perfundir a água com 100% de CO2 usando um mecanismo de propagação.
- Adicione 8,8 g de médio e Ames em pó no recipiente de 1 L de água.
- Lave o recipiente médio de Ames com alguns mL de água desionizada para remover todos os vestígios do meio em pó Ames e adicionar ao recipiente de 1 L.
- Adicione 25,3 mL de solução de bicarbonato de sódio (7,5% w/v.31) a recipiente de 1 L.
- Adicione a água adicional para trazer a solução para um volume final de 1 L.
- Continue perfusing a água com CO2 por aproximadamente 5 min.
- Pare de perfusão de CO2 e começar perfusing solução com uma mistura de gás de grau médico de 95% O2 e 5% de CO2 pelo menos 30 min ou até que o pH estabiliza em 7,4.
Nota: Para efeitos do presente protocolo, o meio de Ames é mantido à temperatura ambiente (~ 21 ° C) durante todo o experimento para impedir CO2 ou O2 de gases, que pode obstruir as linhas de perfusão com bolhas de ar. - Limpar os tubos de perfusão inferior e superior de enchimento com etanol a 70% e em seguida, lave as duas linhas 3 vezes com água desionizada. Preencha a linha de fundo com água deionizada e o top de linha com ar.
3. Wholemount da retina preparação
Figura 4: preparação de dissecção e wholemount da retina. (A) fotografia de uma ocular intacta tirada de um animal fotorreceptoras-degenerou. (B) Fotomicrografia da retina com cortes longitudinais para achatar-se. (C) após o achatamento da retina, é colocada uma grade de malha com o lado de fotoreceptor, entrar em contato com a malha e achatado no ar (fora do meio de perfusão) para garantir que estão sem dobras ou bordas onduladas. (D) a malha e a retina são rapidamente transferidos para o pMEA com o lado de células ganglionares contatando os eléctrodos e imediatamente perfundidos com meio de Ames oxigenado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: matriz perfurada de multielectrode. (A) fotografia da matriz perfurada multielectrode usada no protocolo. A retina é colocada na matriz de eletrodo (indicada pelo retângulo vermelho, que é mostrado em maior detalhe em B) dentro da câmara de pMEA para permitir que a perfusão contínua com média de Ames oxigenada. (B) uma Fotomicrografia da matriz eletrodo próprio ilustrando o arranjo de perfurações entre eletrodos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Nota: Ver Figura 4 e Figura 5
- Usando uma lanterna de LED vermelha portátil para fornecer a iluminação vermelha ofuscante, eutanásia animal através de asfixia de dióxido de carbono, seguida por deslocamento cervical ou outro método de escolha, de acordo com protocolos IACUC.
- Enucleate ambos os olhos usando fórceps de um joalheiro #5 e coloque os olhos sem núcleo em um prato de petri 60 mm de diâmetro com cerca de 3-4 mL de solução média Ames fresca e oxigenada.
- Enquanto observar o olho através de um estereomicroscópio dissecação com iluminadores superior e inferior coberto com tela de filtro vermelho, faça uma pequena incisão na córnea cara usando um bisturi ou tesoura afiada.
- Corte desta pequena incisão a borda da córnea, em seguida, estender o corte em uma seção circunferencial ao redor da borda inteira da córnea. Remova a córnea agora destacada junto com a lente, translúcidos humores aquosos e vítreos.
- Enquanto segura suavemente a viseira com um par de pinças, cuidadosamente fazer duas pequenas incisões em lados opostos da viseira. Em seguida, use dois pares de pinças suavemente separe a viseira em cada uma das incisões e separar a retina da esclera. Lentamente, levante a retina inteira da esclera e viseira. Corte o nervo óptico, se continua preso.
- Fazer cortes longitudinais na retina para obter metade ou trimestre seções usando a tesoura e em seguida, espalhar suavemente uma seção da retina em uma malha de nylon (100 µm rosca de diâmetro com 350 µm abertura) com o revestimento de (lado côncavo da retina) de células ganglionares longe da malha.
- Coloque a malha e a retina para uma matriz de multielectrode perfurada (pMEA) com as células ganglionares em contacto com a superfície do pMEA. Em seguida, coloque delicadamente uma grade ponderada fatia em cima da malha para manter a retina no lugar.
4. MEA e instalação de aquisição de dados
Figura 6: ruído níveis de pMEA. (A) gravação representativa de um subconjunto dos eletrodos pMEA exibindo alto ruído persistente. Este ruído é geralmente devido à falta de contato adequado entre as almofadas de contato pMEA e os pinos do amplificador como resultado do desgaste normal da camada fina perfurada poliimida MEA sobre o pMEA, especialmente para as almofadas de contato. A outra possível fonte de ruído é tipicamente solução vazada para as almofadas de contato pMEA amplificador. Ruído persistente devido à pobre pin contato e/ou vazou solução no contato de almofadas geralmente podem ser corrigidas por mudando a posição do pMEA dentro do amplificador para obter melhor contato e limpeza e secagem as almofadas, respectivamente. Se o ruído não pode ser eliminado por limpeza ou mudando a posição do pMEA, o pMEA pode precisar ser substituído inteiramente. (B) gravação representativa dos níveis de ruído de um subconjunto de pMEA eletrodos de uma pMEA limpo com bom contacto entre o pMEA e o amplificador. Normalmente, o nível médio de ruído está dentro ±16 µV. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Nota: Consulte a Figura 6
- Sob a fraca iluminação vermelha, coloque pMEA no amplificador MEA e feche as travas do amplificador.
- Se marcas de referência já não estão presentes no anel de câmara pMEA, etch dois 'X'-marcas em forma de espaçados aproximadamente 5mm separado numa área facilmente visível de cima com o microscópio de bum-estande montado.
- A saída de perfusão superior dentro da câmara de pMEA e rode-a na válvula de perfusão superior para atingir uma taxa de perfusão de aproximadamente 3 mL por minuto. Posicione a topo de aspiração no nível desejado de perfusato (~ 5 mm de profundidade) e certifique-se de que está funcionando.
- Abra o software de aquisição de dados no computador de aquisição de dados e clique no botão 'play' para começar a receber dados. Certifique-se de que todos os canais do pMEA são livre de ruído e gravação de sinais neurais.
- Olhando para uma imagem digital ao vivo do campo de visão do microscópio invertido em um monitor, observe a superfície inferior do pMEA para provas de que a solução está fluindo através da placa de perfusão de fundo.
5. preparação de estimulação de glutamato
Figura 7: vidro micropipeta e dispositivo microfluidic multiporta. (A) um titular de pipeta antes de inserir uma micropipeta ou dispositivo. O eletrodo de prata/cloreto de prata (50 µm de diâmetro) é eletricamente acoplado ao adaptador na extremidade para interface com o headstage de braçadeira do remendo. (B) uma fotografia a micropipeta de vidro interfaceado com o titular da pipeta mostrando a localização da porta de pressão utilizada para iniciar injeções pneumáticas. (C) um dispositivo personalizado microfluidic multiport (1 cm 1 cm cm 0,134) anexado a um elemento de fixação 3D-impresso personalizado e interagi com o titular da pipeta através de um tubo de aço inoxidável. O dispositivo, que foi fabricado em duas camadas, tem oito microports (µm de diâmetro 14) na camada inferior (340 µm de espessura) e oito reservatórios em-microplaqueta (diâmetro 1,6 mm) para armazenar o glutamato na camada superior (1 mm de espessura). Cada um dos oito microports na camada inferior do dispositivo independente está ligado a um reservatório no chip na camada superior através de um microchannel no plano, e cada reservatório no chip por sua vez é conectado a uma porta de pressão do injector pressão de 8 canais através de um tubo flexível para permitir a atuação independente do microports para estampados injeções em vários locais. (D) um close-up do dispositivo multiporta realizado por uma pinça antes de anexar a fixação de interface tubo mostrando o arranjo das oito reservatórios de endereçamento independente em-microplaqueta e entradas de tubulação. (E) uma Fotomicrografia da superfície inferior do dispositivo mostrando o microports de 8 a 14 µm de diâmetro dispostos em uma configuração de 3 x 3 com espaçamento de 200 µm para alinhar com os eléctrodos do pMEA. Os oito fora microports são utilizados para injeções em vários locais, enquanto o porto central foi usado estritamente para o alinhamento durante a fabricação do dispositivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Nota: Consulte a Figura 7.
- Prepare a solução de glutamato misturando estoque glutamato solutionwith oxigenado Ames média solução para obter uma amostra de 0,5 mL em uma concentração de trabalho de glutamato de 1 mM.
- Insira cuidadosamente uma micropipeta pre-puxado 10 µm de diâmetro ou a haste de aço inoxidável ligado ao dispositivo microfluidic multiport em um suporte padrão pipeta contendo um eletrodo de fio de prata/cloreto de prata de 50 µm de diâmetro.
Nota: Se a detecção de impedância não é disponível, o eletrodo de fio de prata/cloreto de prata pode ser omitido. - O titular de uma pipeta com o remendo-braçadeira headstage da interface e conexão a conexão de luer do porto de pressão do titular da pipeta para o canal 1 do sistema de injeção de pressão, se utilizando uma micropipeta de vidro ou as conexões de luer do porto de pressão de cada um dos os portos de 8 injeção com canais 1-8 do sistema de injeção de pressão, se usando o dispositivo multiporta.
- Manualmente, ligue o sistema de injeção de pressão e ligue o canal 1 (ou canais 1-8, conforme o caso). Certifique-se que o sistema é exalado para a atmosfera e ajustar a pressão de injeção para 0,1 libras por polegada quadrada.
- Ligue o micromanipulador e calibrá-lo pressionando o botão 'Calibrar' no controlador de manipulador. Posicione o micromanipulador de modo que a ponta da micropipeta (ou parte inferior do dispositivo, conforme o caso) é de aproximadamente 30 mm acima do amplificador MEA.
- Encher um pequeno prato de petri com solução de glutamato (glutamato de 1 mM no padrão médio de Ames) e coloque-o debaixo do micromanipulador. Baixar micropipeta dica (ou dispositivo) para a solução e o preenchimento, pressionando o botão 'Preenchimento' no sistema de injeção de pressão (pressão de sucção de-13 em H2O) até há cerca de 20 mm de solução visível na micropipeta de vidro ou o tubulação do dispositivo multiporta.
- Se utilizar o dispositivo multiporta, mude o canal 1 do injector pressão fora e repita o protocolo para canais 2-8. Levante a ponta da micropipeta ou dispositivo fora da solução, retire a placa de Petri e posicionar o micromanipulador acima da câmara de pMEA.
- Usando um estereomicroscópio bum-fixado, alinhe a ponta da micropipeta ou os cantos do dispositivo com as marcas de referência gravadas no anel de câmara do pMEA. Armazenar as posições de manipulador para o software de controle usando os botões 'Loja referência A' e 'Loja referência B' (ou simplesmente observe as coordenadas manipulator manualmente) para mapear o sistema de coordenadas do manipulator com os eletrodos pMEA.
- Usando o software de controle de manipulador, selecione um eletrodo de pMEA alvo com atividade espontânea robusta e clique no botão 'Mover para o canal' para alinhar o micropipettewith de vidro do eletrodo de alvo.
6. interface com Retina
- Se a medição da impedância está disponível, ligue o amplificador de braçadeira do remendo e iniciar o software de visualização de impedância, clicando no botão 'Iniciar' para visualizar a impedância do eléctrodo prata/cloreto de prata dentro o titular de uma pipeta. Enquanto observa os sinais em tempo real de impedância, abaixe lentamente a micropipeta ou dispositivo até que entra em contato com a superfície da retina conforme indicado por um rápido aumento da impedância do sinal (ver Figura 8). Salvar ou anote a posição da superfície da retina.
- Se a medição de impedância é indisponível, detecta contato com a superfície da retina através da observação visual, embora este será menos preciso. Baixe o dispositivo ou pipeta até ele visivelmente entra em contato com a superfície superior da solução Ames média na câmara de MEA.
- Então, enquanto observa o topo da retina com um microscópio invertido, abaixe lentamente a pipeta ou dispositivo até que a superfície superior da retina é visivelmente distorcida, que indica que foi feito contato com a superfície da retina. Salvar ou anote a posição da superfície da retina.
- Para a estimulação de subsuperfície, abaixar a pipeta mais 40 µm (para as retinas S334ter-3) ou 70 µm (para as retinas do selvagem-tipo).
- Executar algumas injeções de curta duração (10-30 ms) usando o sistema de injeção (0,1 psi) de pressão para determinar se as células perto da ponta da micropipeta ou microports de dispositivo são receptivos à estimulação de glutamato, observando os sinais neurais com aquisição de dados software.
Nota: Injeções bem sucedidas irão provocar uma inibição de estourar ou pico de taxa do pico claramente visível (ver Figura 9). Se nenhuma resposta é observada, reposicione a micropipeta ou dispositivo em um eletrodo diferente.
Figura 8: medição de impedância. (A) um esquema da técnica de medição da impedância. Usando o amplificador de braçadeira do remendo, a impedância da micropipeta é continuamente monitorada como é levada lentamente em direção à superfície da retina. Quando a micropipeta é acima da retina, a relativamente alta condutividade iônica do meio de Ames resulta em uma leitura de baixa impedância. Como a micropipeta faz contato com a superfície da retina, a condutividade iônica através do fio de prata/cloreto de prata é reduzida, causando um aumento rápido na impedância medida. (B) uma parcela exibindo a mudança de impedância gravado antes e após o contato da ponta da pipeta com a superfície da retina. A impedância medida é relativamente baixa quando a ponta da micropipeta é na solução apenas antes do contato com (indicado pela região laranja à esquerda). Uma vez que o contato é feito (indicado pela seta vermelha e região verde à direita), a impedância aumenta rapidamente devido à reduzida condutividade iônica em caso de contacto com o tecido da retina. Na prática, a superfície da retina é registrada como a altura correspondente ao aparecimento da subida íngreme da impedância medida (a localização da ponta de seta vermelha). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: gravações de eletrodo de atividade neural durante visual, espontânea e gravações de injeção de glutamato. (A) gravações representativas de nove eletrodos pMEA, mostrando a passa-alta filtrado dados do eletrodo durante a estimulação visual de luz com um LED verde onde cada retângulo mostra os dados neurais de um único eletrodo. Cada gravação de eletrodo ilustra dados coletados no primeiro segundo depois de ligar o LED verde (mostrado com setas laranja em cada parcela de tempo) com uma escala comum de tensão mostrada em y a esquerda. Espigões foram identificados utilizando uma tensão de limiar de-18 µV (linha vermelha horizontal em cada parcela de eletrodo) e são representados por traços negros sobre os dados do eléctrodo verde. Estimulação visual causou uma explosão de picos (excitação) em todos os eletrodos exceto centro superior um, que possuía uma resposta inibitória à luz. (B) um enredo semelhante para os eletrodos mesmos mostrando espontânea atividade neural sem estimulação visual ou injeção. Apesar de explosões menores estavam presentes, os padrões de picos foram muito diferentes daqueles registrados em resposta a estímulos visuais. (C) gravações representativas do mesmo subconjunto de eletrodos gravada imediatamente após uma injeção de glutamato no eléctrodo central (indicado por setas laranja em cada parcela de tempo). O glutamato injetado provocou uma explosão de picos no eléctrodo central que era muito parecido com as descargas de pico visualmente evocados. Todos os outros eletrodos foram afetados através da injeção de glutamato, o que demonstra a resolução espacial bem a técnica de estimulação química. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
7. Inicie a gravação da retina e do programa de estímulo
- Oriente o LED verde em direção a superfície superior da retina. Começa a gravação usando o software de aquisição de dados no computador dedicado gravação digitando o nome do arquivo e clicar no botão "gravar".
- Uma vez que a gravação foi iniciado, abra o programa de controle de estímulo e carregar o arquivo de estímulo padrão clicando no botão "Arquivo de estímulo de leitura". Em seguida, clique no botão "Executar arquivo de estímulo" para iniciar o arquivo padrão de estímulo, consistindo do protocolo de aquisição de dados e estímulos descrito na nota abaixo.
Nota: (i) 30 ensaios de 2 ON s e 2 s OFF campo completo flash (5 intensidade lm/m2 ) usando o LED verde. (ii) 120 s de dados sem usar o LED verde para registrar a atividade espontânea da retina ao longo de uma escala de tempo similar. (iii) 1 ou mais conjuntos de injeções de glutamato consistindo de 30 ensaios de injeções de glutamato em 0,1 psi com injeção de ms 10-30 vezes (cerca de 100-300 pL por injecção) e 3 s interpulse durações. No caso de injeções de vários locais, selecione 2 ou mais portas para injetar simultaneamente.
Figura 10: Peristimulus histogramas de visual, espontânea e glutamato respostas. (A) representante peristimulus histogramas (30 ms binwidth) os dados de pico do subconjunto de eletrodos na Figura 9A, média de 20 ensaios de estimulação visual de luz. Uma escala comum de taxa de pico foi aplicada a todos os eletrodos e é mostrada as esquerda y-Axes. A linha preta em cada parcela de eletrodo representa a taxa média de pico para todas as pontas, gravado durante o primeiro segundo depois de ligar o LED verde. Como pode ser visto, estimulação visual causado uma resposta da taxa de pico excitatórios transiente em todos os eletrodos exceto o elétrodo de centro superior, que teve uma resposta inibitória transitória à luz. (B) as respostas de taxa média de aumento espontâneo gravam nos eletrodos mesmos sem qualquer estímulo visual ou químico. Sem estimulação, as taxas de pico para cada eletrodo são relativamente constantes. (C) as respostas de taxa de pico média gravam no mesmos eletrodos em resposta a uma injeção de glutamato num local acima do eletrodo central. A resposta só transitória evidente é a resposta excitatória no eléctrodo directamente sob o local da injeção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Este protocolo pode ser usado para estimular quimicamente retina normal, tipo selvagem, bem como fotorreceptoras degenerou as retinas, apesar da substancial celular remodelação causada pela perda dos FOTORRECEPTORES. Antes de iniciar experimentos com qualquer fotorreceptoras degenerou ou as retinas do selvagem-tipo, a necessidade de equipamento (Figura 1 e Figura 2) gravação e estimulação para ser preparado e o pMEA (
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O método apresentado aqui demonstra um paradigma único de estimulação neural, onde os neurônios da retina são quimicamente estimulados injetando produtos químicos neurotransmissor nativo no subsolo da retina em vitro. Esta técnica de estimulação química oferece várias vantagens sobre a técnica de estimulação elétrica convencional, incluindo alta especificidade focal de neurônios alvo e seletividade. O protocolo acima detalhes como pequenos injeções pneumático de volume de glutamato o neurotransmissor entregues p...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
O trabalho apresentado no livro foi apoiado pela Fundação Nacional de ciência, fronteiras emergentes na pesquisa e programa de inovação (NSF-EFRI) conceder o número 0938072. O conteúdo deste artigo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não necessariamente representam a opinião oficial da NSF. Os autores também desejam agradecer Dr. Samsoon Inayat o trabalho de projetar e testar a configuração inicial e experimental para a estimulação química e Sr. Ashwin Raghunathan pelo seu trabalho, projetar, fabricar e avaliar o dispositivo microfluidic multiport usado em Este estudo.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Matriz de microeletrodos, layout perfurado | Multi Channel Systems, GmbH | 60pMEA200/30iR-Ti-pr | http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti |
| Amplificador MEA | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv |
| Placa de aterramento de perfusão inferior para sistemas multicanal pMEA | , GmbH | MEA1060-Inv-(BC)-PGP | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp |
| Micromanipulador Motorizado de 3 eixos | Sutter Instruments, Novato, CA | MP-285 | Sistema |
| de Controle de Micromanipulador | Sutter Instruments, Novato, CA | MPC-200 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html |
| Estilo pórtico suporte para micromanipulador com corrediça linear | Sutter Instruments, Novato, CA | MT-75/LS | https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html |
| Injetor de pressão multicanal programável de 8 canais | OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Fornecedor: Harvard Apparatus UK | PM-8000 ou PM-8 | OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Fornecedor: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1 _HAUK_ProductDetail |
| Axopatch 200A Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200A | Axopatch 200A foi substituído por um modelo mais recente Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier |
| Patch clamp headstage | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV 201A http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage | |
| Kit de resíduos a vácuo | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VMK | http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/ |
| Porta-pipetas | Warner Instruments, Hamden, CT | QSW-A10P | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915 |
| Pré-puxado 10 μ micropipetas de vidro de diâmetro de ponta m | World Precision Instruments, Sarasota, FL | TIP10TW1 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/ |
| Zoom estereomicroscópio | Nikon, Tóquio, Japão | SMZ-745T | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745 |
| Suporte de lança de microscópio com bola linear dupla braço de rolamento | Old School Industries, Inc., Dacono, CO | OS1010H-16BB | http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm |
| Zoom Microscópio Estéreo com Suporte LED Híbrido C-LEDS | Nikon, Tóquio, Japão | SMZ-445 | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445 |
| Sistema de microscópio invertido | Nikon, Tóquio, Japão | Eclipse Ti-E | https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E |
| Ames medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1420 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420 |
| Ácido L-glutâmico (glutamato) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291 |
| Bicarbonato de sódio | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S8761 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761 |
| placa de Petri de 60 mm (10 mm de altura) | Fischer Scientific, Waltham, MA | FB0875713A | placa de Petri transparente de 60 mm; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a |
| Jewelers #5 Forceps | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 555227F | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/ |
| Bisturi Padrão #24 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500247 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/ |
| Cabo de bisturi #4 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500237 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/ |
| Tesoura de dissecação Vannas Tubingen | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 503378 https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/ | |
| de malha de nylon | Warner Instruments, Hamden, CT | NYL / MESH | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173 |
| Grelha de fatia de harpa | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | HSG-5AD | http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/ |
| AgCl pellet de eléctrodo de referência | multicanal, GmbH | P1060 | http://www.multichannelsystems.com/products/p1060 |
| Sistema de perfusão por gravidade controlada por válvula de 4 canais | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VC3-4xG | http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/ |
| Zyla 5.5 sCMOS câmera de microscópio | Andor Technology, Belfast, Reino Unido | Zyla 5.5 sCMOS | http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos |
| Fio de prata (50 μ m de diâmetro) | Fischer Scientific, Waltham, MA | AA44461G5 | https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5 |
| Tubulação microbore Tygon (1,6 mm de diâmetro) | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | EW-06419-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 |
| Suporte de ferramenta basculante com cânula de | açoALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | TILTPORT | Um de cada um deles foi utilizado para perfusão e sucção superiores; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/ |
| Roscolux #26 Folha de Filtro Vermelho Claro | Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT | R2611 | Fabricante: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux Fornecedor: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html |
| Smith & Lanterna Wesson Galaxy Red | Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA | 4588 | Fabricante: https://www.smith-wesson.com/ Fornecedor: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588 |
| MC_Rack Software | Multi Channel Systems, GmbH | MC_Rack | |
| http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack Labview Software | National Instruments, Austin, TX | LabVIEW | http://www.ni.com/labview/ |
| NIS-Elements: Software de Pesquisa Básica | Nikon, Tóquio, Japão | NIS-Elements BR | https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research |
Referências
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. , (2011).
- Fritsche, L. G., Fariss, R. N., Stambolian, D., Abecasis, G. R., Curcio, C. A., Swaroop, A. Age-Related Macular Degeneration: Genetics and Biology Coming Together. Annu Rev Genomics Hum Genet. 15, 151-171 (2014).
- Marc, R. E., et al. Neural reprogramming in retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 3364-3371 (2007).
- Jones, B. W., Kondo, M., Terasaki, H., Lin, Y., McCall, M., Marc, R. E. Retinal remodeling. Jpn J Ophthalmol. 56, 289-306 (2012).
- Soto, F., Kerschensteiner, D. Synaptic remodeling of neuronal circuits in early retinal degeneration. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
- Trenholm, S., Awatramani, G. B. Origins of spontaneous activity in the degenerating retina. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
- Euler, T., Schubert, T. Multiple Independent Oscillatory Networks in the Degenerating Retina. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
- Boye, S. E., Boye, S. L., Lewin, A. S., Hauswirth, W. W. A Comprehensive Review of Retinal Gene Therapy. Mol Ther. 21, 509-519 (2013).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. The Lancet. 385, 509-516 (2015).
- Reh, T. A. Photoreceptor Transplantation in Late Stage Retinal Degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57, (2016).
- Zrenner, E. Fighting blindness with microelectronics. Sci Transl Med. 5, (2013).
- Humayun, M. S., de Juan, E. Jr, Dagnelie, G. The Bionic Eye: A Quarter Century of Retinal Prosthesis Research and Development. Ophthalmol. 123, S89-S97 (2016).
- Cruz, L., et al. The Argus II epiretinal prosthesis system allows letter and word reading and long-term function in patients with profound vision loss. Br J Ophthalmol. 97, 632-636 (2013).
- Zrenner, E., et al. Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words. P R Soc B. 278, 1489-1497 (2011).
- Stronks, H. C., Dagnelie, G. The functional performance of the Argus II retinal prosthesis. Expert Rev Med Devices. 11, 23-30 (2014).
- Stingl, K., et al. Artificial vision with wirelessly powered subretinal electronic implant alpha-IMS. P R Soc B. 280, (2013).
- Rizzo, J. F. Update on retinal prosthetic research: the Boston Retinal Implant Project. J Neuroophthalmol. 31, 160-168 (2011).
- Ayton, L. N., et al. First-in-Human Trial of a Novel Suprachoroidal Retinal Prosthesis. PLoS ONE. 9, e115239(2014).
- Chuang, A. T., Margo, C. E., Greenberg, P. B. Retinal implants: a systematic review. Br J Ophthalmol. 98, 852-856 (2014).
- Cai, C., Twyford, P., Fried, S. The response of retinal neurons to high-frequency stimulation. J Neural Eng. 10, 036009(2013).
- Eiber, C. D., Lovell, N. H., Suaning, G. J. Attaining higher resolution visual prosthetics: a review of the factors and limitations. J Neural Eng. 10, 011002(2013).
- Humayun, M., Propst, R., de Juan, E., McCormick, K., Hickingbotham, D. Bipolar surface electrical stimulation of the vertebrate retina. Arch Ophthalmol. 112, 110-116 (1994).
- Zrenner, E., et al. Can subretinal microphotodiodes successfully replace degenerated photoreceptors? Vision Res. 39, 2555-2567 (1999).
- Majji, A. B., Humayun, M. S., Weiland, J. D., Suzuki, S., D'Anna, S. A., de Juan, E. Long-Term Histological and Electrophysiological Results of an Inactive Epiretinal Electrode Array Implantation in Dogs. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2073-2081 (1999).
- Peterman, M. C., Noolandi, J., Blumenkranz, M. S., Fishman, H. A. Localized chemical release from an artificial synapse chip. PNAS. 101, 9951-9954 (2004).
- Finlayson, P. G., Iezzi, R. Glutamate stimulation of retinal ganglion cells in normal and s334ter-4 rat retinas: a candidate for a neurotransmitter-based retinal prosthesis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 3619-3628 (2010).
- Inayat, S., Rountree, C. M., Troy, J. B., Saggere, L. Chemical stimulation of rat retinal neurons: feasibility of an epiretinal neurotransmitter-based prosthesis. J Neural Eng. 12, 016010(2015).
- Rountree, C. M., Inayat, S., Troy, J. B., Saggere, L. Differential stimulation of the retina with subretinally injected exogenous neurotransmitter: A biomimetic alternative to electrical stimulation. Sci Rep. 6, 38505(2016).
- Ray, A., Sun, G. J., Chan, L., Grzywacz, N. M., Weiland, J., Lee, E. -J. Morphological alterations in retinal neurons in the S334ter-line3 transgenic rat. Cell Tissue Res. 339, 481-491 (2010).
- Martinez-Navarrete, G., Seiler, M. J., Aramant, R. B., Fernandez-Sanchez, L., Pinilla, I., Cuenca, N. Retinal degeneration in two lines of transgenic S334ter rats. Exp Eye Res. 92, 227-237 (2011).
- Sigma Aldrich. Sigma Aldrich Ames Medium Product Information Sheet. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/1/a1420pis.pdf (2017).
- Reinhard, K., et al. Step-By-Step instructions for retina recordings with perforated multi electrode arrays. PLoS ONE. 9, e106148(2014).
- Izumi, Y., Kirby, C. O., Benz, A. M., Olney, J. W., Zorumski, C. F. Müller cell swelling, glutamate uptake, and excitotoxic neurodegeneration in the isolated rat retina. Glia. 25, 379-389 (1999).
- Tunnicliff, G. Glutamate uptake by chick retina. Biochem J. 150, 297-299 (1975).
- Schwartz, E. A., Tachibana, M. Electrophysiology of glutamate and sodium co-transport in a glial cell of the salamander retina. J Physiol (Lond). 426, 43-80 (1990).
- Muller, A., Maurin, L., Bonne, C. Free radicals and glutamate uptake in the retina. Gen Pharmacol- Vasc S. 30, 315-318 (1998).
- Dhingra, N. K., Kao, Y. -H., Sterling, P., Smith, R. G. Contrast threshold of a brisk-transient ganglion cell in vitro. J of Neurophysiol. 89, 2360-2369 (2003).
- Ahlers, M. T., Ammermüller, J. A system for precise temperature control of isolated nervous tissue under optical access: Application to multi-electrode recordings. J of Neurosci Methods. 219, 83-91 (2013).
- Feke, G. T., Tagawa, H., Deupree, D. M., Goger, D. G., Sebag, J., Weiter, J. J. Blood flow in the normal human retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30, 58-65 (1989).
- The Retina. Neuroscience. Purves, D., et al. , 2nd edition, Sinauer Associates. (2001).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
