Pré-condicionamento das vias aéreas de ratos com bleomicina aumenta a eficiência da enxertia de célula de câncer pulmão ortotópico

Summary

Nós descrevemos um método para melhorar significativamente a enxertia ortotópico de células de câncer de pulmão aos pulmões murino pelo pré-condicionamento das vias aéreas com lesão. Esta abordagem também pode ser aplicada para estudar interações do estroma dentro do microambiente pulmonar, disseminação metastática, co-morbidades do câncer pulmonar, e gerar mais eficiência paciente derivada xenografts.

Abstract

Câncer de pulmão é uma doença refratária tratamento mortal que é biologicamente heterogênea. Para compreender e tratar eficazmente o espectro completo clínico de malignidade torácica, são necessários modelos animais adicionais que podem recapitular estágios e subtipos de câncer de pulmão humano diverso. Aloenxerto ou enxerto heterólogo modelos são versáteis e permitem a quantificação da capacidade tumorigênico em vivo, usando células malignas de origem humana ou murino. No entanto, métodos anteriormente descritos de enxertia de células de câncer de pulmão foram realizados em locais não-fisiológicas, tais como o flanco dos ratos, devido a ineficiência de transplante ortotópico de células para os pulmões. Neste estudo, descrevemos um método para melhorar a ortotópico enxertia do pulmão câncer célula pré-condicionamento das vias aéreas de ratos com bleomicina de agente induzindo a fibrose. Como um experimento de prova de conceito, nós aplicamos esta abordagem para engraft células tumorais de subtipo de adenocarcinoma do pulmão, obtidos de fontes humanas, ou rato em várias cepas de ratos. Demonstramos que ferir as vias aéreas com bleomicina antes da injeção de células de tumor aumenta a enxertia de células tumorais de 0-17% a 71-100%. Significativamente, esse método aprimorado incidência de tumor de pulmão e consequência subsequente usando modelos e diferentes cepas de rato. Além disso, células de câncer de pulmão engrafted disseminam dos pulmões em órgãos distantes relevantes. Assim, nós fornecemos um protocolo que pode ser usado para estabelecer e manter novos modelos ortotópico de câncer de pulmão com limitação da quantidade de células ou biospecimen e avaliar quantitativamente a oncogenicidade capacidade das células de câncer de pulmão em configurações fisiologicamente relevantes .

Introduction

Câncer de pulmão é a principal causa de câncer relacionados a mortes em todo o mundo¹. Pacientes com câncer de pulmão eventualmente sucumbiram de metástase para órgãos distantes, nomeadamente para o sistema nervoso central, fígado, glândulas supra-renais e os ossos^2,3,4. Malignidade torácica foram tradicionalmente classificada como câncer de pulmão de pequenas células (CPPC) ou não-pequenas células lung cancer (NSCLC)⁵. CPNPC é o mais frequentemente diagnosticado malignidade e podem ser subdividido em diferentes subtipos histoló....

Protocol

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com os protocolos aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) na Universidade de Yale.

1. configurar / preparação dos reagentes.

1. Bleomicina
   Atenção: Com base na globalmente harmonizado sistema (GHS) de classificação e rotulagem de produtos químicos, bleomicina é classificada como um perigo para a saúde GHS08.
   1. Prepare a bleomicina em uma capa de química. Resuspenda 15 U em 5 mL de soro fisiológico estéril tamponado de fosfato (PBS).
   2. Alíquota 100-200 µ l da solução em vidro frascos e congelá-los a-20 ° C....

Results

Para aumentar a eficiência da enxertia de célula de câncer LUAD nos pulmões de ratos, desenvolvemos um protocolo que primeiro pre-condições das vias aéreas utilizando a bleomicina seguida por injeção de células de tumor ortotópico (Figura 1). Confirmamos que, mesmo quando administrado em ratos imunodeprimidos modelo, bleomicina induzido fibrose transitória por dia 14, como evidenciado pela perda da arquitetura das vias aéreas e a deposição de colágeno aumenta.......

Discussion

Marcantes clínicos paralelos foram documentados entre câncer de pulmão e outras doenças crônicas do pulmão³⁶. Em particular, pacientes com fibrose pulmonar idiopática (IPF) tem uma predileção maior para desenvolver câncer de pulmão, e esta associação é independente de fumar história^37,38. IPF é caracterizada pela destruição progressiva da arquitetura pulmonar e insuficiência respiratória através da deposição de ECM³⁹

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bleomicina	Sigma	B5507-15UN	CUIDADO Perigo para a saúde GHS08
Exel Cateter 24G	Fisher	1484121 Remova a	agulha. Para injeção intratraqueal
Cetamina (Ketaset inl 100 mg / mL C3N 10 mL)	Butler Schein	56344	Para anestesiar camundongos
Xylazine	Butler Schein	33198	Para anestesiar camundongos
Cetoprofeno, 5.000 mg	Cayman Chemical	10006661	Analgésico
Puralube Pomada Oftálmica Veterinária	BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC	8897	Para evitar o ressecamento dos olhos sob anestesia
o pó de D-luciferina	Perkin Elmer Health Sciences Inc	122799	Para imagens luminescentes. Reconstitua o pó com PBS para uma concentração de trabalho de 15mg/mL. Proteger da luz
Suporte de intubação de roedores	Braintree Scientific	RIS-100	Suporte recomendado para injeção intratraqueal
MI-150 ILUMINADOR 150W MI-150	DOLAN-JENNER INDUSTRIES	MI-150 / EEG2823M	Para iluminar e visualizar a traqueia
Pinça Graefe, 2,75 (7 cm) de comprimento serrilhado	Roboz	RS-5111	Para injeção intratraqueal
Seringa Luer-Lok Estéril 5ml	BD / Fisher	309646
Satiny Smooth by Conair Barbeador Recarregável Duplo/Seco	Conair-Para		barbear ratos
Tesoura Bonn, 3.5" reta 15 mm afiada/afiada lâminas de corte seguro	Roboz	RS-5840SC
Tubo cônico de 15 mL	BD / Fisher	352097
Tubos de centrífuga de 1.5 mL	EUA SCIENTIFIC INC	1615-5500
Frasco de Cintilação 7 mL de Vidro Borosilicato GPI	Fisher	701350
Pontas de pipeta de filtro (200 μ L)	USA SCIENTIFIC INC	1120-8710
Fosfato Tampolado	Salino Life Technologies	14190-144
0,25% Tripsina-EDTA	Life Technologies	25200-056
DMEM alta glicose	Life Technologies	11965-092
RPMI Medium 1640	Life Technologies	11875-093
Soro bovino fetal USDA	Life Technologies	10437-028
Penicilina-Estreptomicina	Life Technologies	15140-122
Anfotericina B	Sigma	A2942-20ML
Mancha Azul de Tripano 0.4%	Life Technologies	15250-061
Condessa Contador de Células Automatizado	Life	AMQAX1000
Frasco T/C 75cm sq pescoço inclinado, tampa azul	Fisher / Corning	353135
IVIS Spectrum Xenogen Bioluminiscence	Perkin Elmer Health Sciences Inc	124262	Para in vivo imagem de bioluminescência
Software de imagem viva	Perkin Elmer Health Sciences Inc	128113	Para análise de bioluminescência in vivo
Sistema de Anestesia a Gás XGI-8	Perkin Elmer Health Sciences Inc	118918	Para anestesia com isoflurano
Seringa de insulina de agulha curta BD Ultra-Fine II 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 pol)	BD / Fisher	BD328418	Para injeção retro-orbital de luciferina
Seringa 1ml	BD / Fisher	14-823-434	Para injeções intraperitoneais
26 G x 1/2 pol. agulha	BD / Fisher	305111	Para injeções intraperitoneais
4% Paraformaldeído	VWR	43368-9M	CUIDADO Perigo para a saúde GHS07, GHS08. Para fixação de tecidos
Pipeta-Lite Pipeta, Unv. SL-200XLS+	METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL
Hematoxilina de Mayer	CIÊNCIAS DE MICROSCOPIA ELETRÔNICA	517-28-2
Coloração de Eosina Y 0,25% (p/v) em 57%	Fisher	67-63-0
Kit de Coloração Tricrômica Masson	IMEB Inc	K7228	Para coloração tricrômica masson para visualizar
colágeno Superfrost mais lâminas de vidro	Fisher
placa de 6 poços	Corning	C3516
Kit Universal de Detecção de Micoplasma	ATCC	30-1012K
OCT Composto de incorporação	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	62550-12	Para embutir tecido para seções congeladas
Leica CM3050 S Criostato de pesquisa	Leica	CM3050 S	Para seção de tecido para análise
de coloraçãoMicroscópio de Fluorescência Keyence		BZ-X700
ImageJ	US National Institutes of Health	IJ1.46	http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 para Mac OS X	GraphPad Software, Inc.	-
Camundongos atímicos (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu)	Charles River	NIH-553
NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) camundongos	Jackson Laboratories	5557
camundongos B6129SF1/J	Jackson Laboratories	101043
células NIH-H2030	ATCC	CRL-5914
368T1	generosamente fornecidas por Monte Winslow (Standford University)	-
PC9 células	Nguyen DX et al. Cell. 2009; 138:51; Células
BrM3	Nguyen DX et al. Cell. 2009; 138:51; 62	-