Artigo de método

Pré-condicionamento das vias aéreas de ratos com bleomicina aumenta a eficiência da enxertia de célula de câncer pulmão ortotópico

DOI:

10.3791/56650

⸱

28 de junho de 2018

 ,  , 
1Department of Pathology, Yale University School of Medicine, 2Department of Medical Oncology, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nós descrevemos um método para melhorar significativamente a enxertia ortotópico de células de câncer de pulmão aos pulmões murino pelo pré-condicionamento das vias aéreas com lesão. Esta abordagem também pode ser aplicada para estudar interações do estroma dentro do microambiente pulmonar, disseminação metastática, co-morbidades do câncer pulmonar, e gerar mais eficiência paciente derivada xenografts.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Câncer de pulmão é uma doença refratária tratamento mortal que é biologicamente heterogênea. Para compreender e tratar eficazmente o espectro completo clínico de malignidade torácica, são necessários modelos animais adicionais que podem recapitular estágios e subtipos de câncer de pulmão humano diverso. Aloenxerto ou enxerto heterólogo modelos são versáteis e permitem a quantificação da capacidade tumorigênico em vivo, usando células malignas de origem humana ou murino. No entanto, métodos anteriormente descritos de enxertia de células de câncer de pulmão foram realizados em locais não-fisiológicas, tais como o flanco dos ratos, devido a ineficiência de transplante ortotópico de células para os pulmões. Neste estudo, descrevemos um método para melhorar a ortotópico enxertia do pulmão câncer célula pré-condicionamento das vias aéreas de ratos com bleomicina de agente induzindo a fibrose. Como um experimento de prova de conceito, nós aplicamos esta abordagem para engraft células tumorais de subtipo de adenocarcinoma do pulmão, obtidos de fontes humanas, ou rato em várias cepas de ratos. Demonstramos que ferir as vias aéreas com bleomicina antes da injeção de células de tumor aumenta a enxertia de células tumorais de 0-17% a 71-100%. Significativamente, esse método aprimorado incidência de tumor de pulmão e consequência subsequente usando modelos e diferentes cepas de rato. Além disso, células de câncer de pulmão engrafted disseminam dos pulmões em órgãos distantes relevantes. Assim, nós fornecemos um protocolo que pode ser usado para estabelecer e manter novos modelos ortotópico de câncer de pulmão com limitação da quantidade de células ou biospecimen e avaliar quantitativamente a oncogenicidade capacidade das células de câncer de pulmão em configurações fisiologicamente relevantes .

Introdução

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Câncer de pulmão é a principal causa de câncer relacionados a mortes em todo o mundo1. Pacientes com câncer de pulmão eventualmente sucumbiram de metástase para órgãos distantes, nomeadamente para o sistema nervoso central, fígado, glândulas supra-renais e os ossos2,3,4. Malignidade torácica foram tradicionalmente classificada como câncer de pulmão de pequenas células (CPPC) ou não-pequenas células lung cancer (NSCLC)5. CPNPC é o mais frequentemente diagnosticado malignidade e podem ser subdividido em diferentes subtipos histológicos, incluindo adenocarcinoma do pulmão (LUAD) e pulmão carcinoma de células escamosas (LUSC)6. Análise genômica dos cancros do pulmão primário humano ressecadas revelou que tumores dentro de um determinado histotype também podem expressar diversas perturbações moleculares, ainda mais, contribuindo para sua progressão clínica divergente e confundindo o prognóstico do paciente. A notável heterogeneidade dos cancros do pulmão representa um desafio significativo para o projeto racional, testes pré-clínicos e implementação de estratégias terapêuticas eficazes. Consequentemente, há uma necessidade de ampliar o repertório de modelos de câncer de pulmão experimental tractable para estudar as diversas origens celulares, subtipos moleculares e fases desta doença.

Várias abordagens usando modelos animais têm sido empregadas para estudar pulmão câncer na vivo, cada um com suas próprias vantagens e desvantagens dependendo as questà µ es biológicas de interesse. Modelos do rato geneticamente modificados (GEMMs) podem direcionar alterações genéticas específicas em um tipo de células progenitoras determinado, resultando em tumores que o progresso dentro de um hospedeiro imunocompetentes7. Embora extremamente poderoso e clinicamente relevantes, a morbidade de latência, variabilidade e/ou pulmão tumor associada com GEMMs pode ser proibitiva para certas medidas quantitativas e a detecção de metástases de fase final em órgãos distantes8. Uma abordagem complementar é o uso de modelos de aloenxerto, segundo o qual as células de câncer de pulmão, obtidos diretamente a partir de um tumor de rato ou derivado primeiro como linhagens celulares estabelecidas na cultura, são re-introduzidas em syngeneic anfitriões. De forma análoga, xenografts de câncer de pulmão são estabelecidos de amostras de paciente tumor derivado ou linhas de células humanas. Xenografts de linha celular humana ou pacientes derivadas xenografts (PDXs) são geralmente mantidos em ratos imunodeprimidos e, portanto, impedem a completa vigilância imune9. Apesar desta desvantagem, eles fornecem uma avenida para propagar a limitar as quantidades de humano biospecimens e estudo fundamental na vivo Propriedades de células cancerosas humanas, que codificam as aberrações genômicas mais complexas que os tumores GEMM.

Uma propriedade útil de aloenxertos e xenografts é que eles são receptivos a tradicional ensaios limitante de diluição de célula, empregados para quantificar a frequência de tumor iniciando células (TICs) dentro de uma população de células malignas10. Nesses experimentos, um número definido de células é injetado por via subcutânea o flanco dos animais e a frequência de tiques pode ser estimada com base na taxa de tomada de tumor. Tumores subcutâneos, entretanto, podem ser mais hipóxico11 e não podem modelo chaves restrições fisiológicas do microambiente do tumor de pulmão. Entrega de intratraqueal de tronco epitelial ou progenitoras para os pulmões de ratos é um método para estudar a regeneração pulmonar e das vias respiratórias de biologia de células-tronco12. No entanto, a taxa de enxertia desta técnica pode ser relativamente baixa, a menos que os pulmões são primeiro sujeitas a formas fisiológicas de lesão, tais como infecção viral13,14. Suporte de células estromais inflamatórias e/ou a ruptura da membrana de porão pulmão pode melhorar a retenção das células transplantadas em nichos de células-tronco relevantes na vias aéreas distais15. Fibrose, induzindo agentes também pode pre-condição os pulmões para melhorar a enxertia de células pluripotentes induzidas16 e células-tronco mesenquimais17. Se formas semelhantes de lesão das vias respiratórias podem afetar a taxa de enxertia, capacidade inicial de tumor e a consequência natural de células de câncer de pulmão deve ainda ser sistematicamente avaliada.

Neste estudo, descrevemos um método para aumentar a eficiência de ortotópico enxertia de células de câncer pulmonar, por pré-condicionamento nos pulmões de ratos com lesão. LUAD surge nas vias aéreas distais com um subconjunto significativo desses cânceres desenvolvendo um estroma fibrótico18 que muitas vezes se correlaciona com o prognóstico pobre19. Bleomicina, um peptídeo de híbrido natural nonribosomal-policetídeo, tem sido amplamente utilizada para induzir fibrose pulmonar em ratos20. Instilação de vias aéreas de bleomicina promove primeiro atrito epitelial nos alvéolos e recrutamento de células inflamatórias, incluindo macrófagos, neutrófilos e monócitos21. Isto é seguido por tecido remodelação nas vias aéreas distais, membrana basal reorganização22,23 e deposição de matriz extracelular (ECM)24. Os efeitos de uma injeção de bleomicina único são transitórios, com fibrose resolvendo após 30 dias na maioria dos estudos25. Usando modelos tanto aloenxertos e xenoenxertos, testamos se pré-condicionamento das vias aéreas de ratos com bleomicina poderia aumentar significativamente a taxa de tomada de células LUAD nos pulmões.

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Protocolo

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Todos os experimentos foram realizados em conformidade com os protocolos aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) na Universidade de Yale.

1. configurar / preparação dos reagentes.

  1. Bleomicina
    Atenção: Com base na globalmente harmonizado sistema (GHS) de classificação e rotulagem de produtos químicos, bleomicina é classificada como um perigo para a saúde GHS08.
    1. Prepare a bleomicina em uma capa de química. Resuspenda 15 U em 5 mL de soro fisiológico estéril tamponado de fosfato (PBS).
    2. Alíquota 100-200 µ l da solução em vidro frascos e congelá-los a-20 ° C para uso futuro. Rotule corretamente os tubos com a data de ressuspensão. Use no prazo de 6 meses a partir desta data.
      Nota: Cada cepa de rato tem uma sensibilidade diferente a bleomicina26. Testar diferentes doses de bleomicina para cada cepa de rato é recomendado. As estirpes de rato e as doses correspondentes de bleomicina utilizados em experiências representativas estão listadas na tabela 1.
  2. Ratos
    1. Ratos que precisava para a experiência de compra e permitir que ratos 7 dias se adaptar antes da injeção. Realize infusões em uma capa de biossegurança. Transferência de animais alojados em uma sala de compatível com não-BSL2 de um BSL2 usando padrão procedimentos institucionais antes da infusão de bleomicina. Injete camundongos em 6-8 semanas de idade.
      Cuidado: Injete ratos seguindo as orientações institucionais para agentes perigosos, nível de biossegurança 2 (BSL2) e IACUC aprovação.
      Nota: Ratos comprados para os experimentos representativos estão listados na Tabela de materiais. Só os ratos masculinos têm sido utilizados.
  3. Linhas de células de câncer de pulmão
    1. Linhas de células de cultura desejada em seus respectivos meios. Antes de injeções, realizar curta perfis de ADN de repetição em tandem ou testes genéticos para garantir a identificação da linha chamadora célula apropriada. Para facilitar in vivo e ex vivo da imagem latente, infectar linhas celulares com um lentivirus expressando a timidina quinase, a proteína verde fluorescente (GFP) e a luciferase fusão repórter27e classificar células positivas repórter por fluorescência ativada a célula de triagem (FACS) antes da enxertia. Testar linhas para o micoplasma cada 6 meses.
      1. Cultura H2030 linhagem de células cancerosas humanas como recomendado pelo fabricante usando meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) com 10% de soro Fetal bovino (FBS), penicilina-estreptomicina e anfotericina b.
      2. Cultura 368T1 a linha de celular murino (derivada de um rato KrasG12D; p53- / - ) usando médio modificado águia de Dulbecco (DMEM) com 10% FBS, penicilina-estreptomicina e anfotericina b.
      3. Linhagem de células cancerosas humanas PC9 usando RPMI com 10% de cultura FBS, penicilina-estreptomicina e anfotericina b.

2. bleomicina tratamento

  1. Plano para injetar camundongos intratraquealmente com bleomicina 14 dias antes da enxertia de células do tumor.
  2. Descongele o estoque de bleomicina no gelo 2 h antes da injeção.
  3. Uma vez descongelado, diluir bleomicina para a concentração desejada de trabalho (0,02 µ l de U/50 ou 0,005 µ l de U/50) e mantê-lo no gelo.
    Nota: Concentração da bleomicina varia de acordo com a cepa de rato usada para as experiências (tabela 1). Titulação da bleomicina em ratos deve ser realizada para determinar a dose ideal.
  4. Prepare-se anestesia diluindo ketamina e xilazina para uma concentração final de 10 mg/mL e 1 mg/mL, respectivamente, usando uma agulha de seringa e 27 G de 1 mL, anestesiamos a cada rato injetando solução intraperitonealmente cetamina/xilazina em 100/10 mg/kg respectivamente.
  5. Monitorar a respiração dos ratos e empregar uma pitada de dedo do pé. Confirme anesthetization adequada quando o mouse não responde aos pés pitada. Aplica o vet pomada nos olhos para evitar ressecamento enquanto sob anestesia.
  6. Coloque 1 rato por vez em uma plataforma de intubação por seus dentes da frente com as costas contra a plataforma de enforcamento.
  7. Ilumine a parte superior do peito usando um iluminador de fibra ótica para ajudar com a visualização da traqueia. Abra a boca do rato e puxar a língua para fora delicadamente com pinça estéril plana.
  8. Use um cateter intravenoso sem agulha para evitar o bloqueio de respiração. Posição do cateter sobre a luz branca emitida a partir da abertura da traqueia.
  9. Inserir o cateter na traqueia até o topo do cateter atinja os dentes da frente. Confirme o posicionamento adequado do cateter na traqueia através da visualização da luz branca brilhando através da abertura do cateter na boca.
  10. Utilizando uma pipeta, dispense 50 µ l de bleomicina ou veículo (PBS) diretamente dentro do cateter para garantir que todo o volume é inalado. Execute esta etapa sob condições estéreis.
  11. Se o cateter está inserido corretamente, o mouse irá inalar imediatamente o conteúdo do cateter. Aguarde alguns segundos até que todo o volume percorre o cateter. Em seguida retire o cateter da traqueia e descarte em solução 10%.
    Nota: O tempo médio por rato de passos 2.7-2.11 é em torno de 5 min.
  12. Se o mouse não é inalar o líquido, cuidadosamente, monitorar a respiração e ajustar a posição do cateter. Se o mouse parar de respirar, remova o cateter imediatamente e permitir que o mouse retomar a respiração normalmente antes de re-introduzir o cateter.
  13. Coloque o mouse injetado em uma almofada de aquecimento aprovados IACUC nas costas sobre uma superfície plana para a recuperação. Todo o processo vai demorar 10 min por rato. Não retornam um animal que passou por injeção para a companhia de outros animais até que se recuperou totalmente.
  14. Coloque um cartão de "Perigosos químicos em uso" da gaiola por 24 h.

3. monitoramento de ratos pós-intubação

  1. Monitore os ratos para insuficiência respiratória imediatamente após a intubação e depois a cada 15 min até ratos acordam da anestesia. Não abandone os ratos até eles recuperaram a consciência suficiente para manter a prostração esternal.
  2. Injete o cetoprofeno (5 mg/kg) intraperitonealmente para aliviar a dor.
  3. Examine a intubação de post de 24 h de ratos e 3 vezes por semana para quaisquer sinais de morbidade.
  4. Manter um registro da data do procedimento de identificação dos animais, tipo de procedimento, tipo de observações de monitoração anestésicas e pós-operatória com vezes.
  5. Monitorar os ratos para perda de peso, dificuldade respiratória, anormalidades comportamentais e um escore de condição corporal < 2 (segmentação da coluna vertebral dorsal/evidente ossos pélvicos são palpáveis) bi-semanal após injeção de bleomicina.
  6. Eutanásia em ratos com insuficiência respiratória ou ratos que experimentaram a perda de 15% da massa corporal por CO2 ou cetamina/xilazina seguido por deslocamento cervical. Confirme a eutanásia através da realização de palpação para a atividade respiratória.

4. enxertia de linhas de células de Adenocarcinoma de pulmão.

Nota: Realize a enxertia das células 14 dias após a injeção de bleomicina (passo 2.1).

  1. Permitir que as células a crescer em frascos de2 75cm imperturbado por 3 dias anteriores ao dia da injeção com mídia correspondente tal como indicado no passo 1.3.
    Nota: Devem estar 80% confluente no dia da injeção (que corresponde a 2-3 x 106 em cada balão dependendo da linhagem celular).
  2. Lave as células crescem em frascos de2 75cm com 5 mL de PBS em temperatura ambiente.
  3. Aspire PBS e adicione 1,5 mL de tripsina às células e incube as celulas a 37 ° C, até que as células desanexar (geralmente 2-5 min).
    Nota: Recomendamos que verifique a cada 2 min para o destacamento de célula do plástico pelo simples visualização da parte inferior do frasco ou sob um microscópio de luz. Não exceda 5 min. de incubação com tripsina.
  4. Neutralizar a tripsina adicionando 4 mL de mídia contendo 10% FBS (mesma mídia como passo 4.1). Coletar as células em um tubo de 15 mL e centrifugá-lo a 200 x g, durante 3 min à temperatura ambiente.
  5. Aspirar a mídia e ressuspender as células em 5 mL de PBS para lavar as células. Centrifugar as células a 200 x g, durante 3 min à temperatura ambiente para células de Pelotas. Repita esta 1 vez.
  6. Aspirar a PBS e resuspenda o pellet em 1,5 mL de PBS por balão.
  7. Misture 50 µ l de mistura de celular com 50 µ l de trypan azul e contar as células usando um contador de células/Hemocytometer câmara28.
  8. Prepare a suspensão de células diluindo as células em PBS para injetar 1 x 105 células (ou outro montante indicado) em 50 µ l por rato. Manter as células no gelo antes da injeção.
    Nota: Prepare pelo menos duas vezes mais células para injeção evitar a falta de suspensão de células.
  9. Prepare-se anestesia diluindo ketamina e xilazina para uma concentração final de 10 mg/mL e 1 mg/mL, respectivamente, usando uma agulha de seringa e 27 G de 1 mL, anestesiamos a cada rato injetando solução intraperitonealmente cetamina/xilazina em 100/10 mg/kg respectivamente.
  10. Monitorar a respiração dos ratos e empregar uma pitada de dedo do pé. Confirme anesthetization adequada quando o mouse não responde aos pés pitada. Aplica o vet pomada nos olhos para evitar ressecamento enquanto sob anestesia.
  11. Coloque 1 rato por vez em uma plataforma de intubação por seus dentes da frente com as costas contra a plataforma de enforcamento.
  12. Ilumine a parte superior do peito usando um iluminador de fibra ótica para ajudar com a visualização da traqueia.
  13. Ressuspender as células suavemente utilizando uma pipeta de p200 para certificar-se de que não formem grumos. Abra a boca do rato e puxar a língua para fora delicadamente com pinça estéril plana.
  14. Uso de um cateter intravenoso com a agulha removido para evitar o bloqueio de respiração. Posição do cateter sobre a luz branca emitida a partir da abertura da traqueia.
  15. Inserir o cateter na traqueia até o topo do cateter atinja os dentes da frente. Confirme o posicionamento adequado do cateter na traqueia através da visualização da luz branca brilhando através da abertura do cateter na boca.
  16. Utilizando uma pipeta, dispense 50 μL de células diretamente dentro do cateter para garantir que todo o volume é inalado. Execute esta etapa sob condições estéreis.
    Nota: Se o cateter está inserido corretamente, o mouse imediatamente irá inalar o conteúdo do cateter.
  17. Aguarde alguns segundos até que todo o volume percorre o cateter e em seguida remova o cateter da traqueia e dispor em solução 10%.
  18. Se o mouse não é inalar o líquido, cuidadosamente, monitorar a respiração e ajustar a posição do cateter. Se o mouse parar de respirar, remova o cateter imediatamente e permitir que o mouse retomar a respiração normalmente antes de re-introduzir o cateter.
    Nota: O tempo médio por rato de passos 4.11-4.18 é em torno de 5 min.
  19. Coloque o mouse injetado em uma almofada de aquecimento aprovados IACUC nas costas sobre uma superfície plana para a recuperação.
    Nota: Todo o processo levará 10 min por rato. Não retornam um animal que passou por injeção para a companhia de outros animais até que se recuperou totalmente.
  20. Raspar a região de costela inteira ambos ventralmente e dorsalmente, de B6129SF1/J e outras estirpes de rato com cabelo escuro usando um barbeador elétrico antes da imagem latente.
  21. 2-3 min após a injeção de célula, injetar 100 µ l de luciferina retrô-orbitally (15 mg/mL) usando uma agulha de insulina. Alternam o olho usado para injeção cada sessão de imagens.
  22. Depois de pelo menos 2 min, colocar até 5 ratos em um gerador de imagens de bioluminescência animal na posição de prostração dorsal e adquirir uma imagem ventral usando configurações de luminescência29.
  23. Sob o painel de controle, ajuste as configurações de resolução e sensibilidade para medir a luminescência de uma linha determinada célula. A maioria dos aplicativos, comece com 3 min (ou "Auto" se saturado), binning = médio (4), F/Stop = 1, o campo de visão = D, assunto altura = 1,50.
    Nota: Se a injeção for bem-sucedida, o sinal de luminescência é detectado na área superior do tórax, em um pulmão ou ambos os pulmões.
  24. Virar os ratos sobre posição de prostração esternal e adquirir uma imagem dorsal como acima.
    Nota: Se a injeção de célula não é executada corretamente, as células podem cluster na entrada da traqueia ou no pescoço.
  25. Injetar o cetoprofeno 5mg/kg intraperitonealmente para aliviar a dor.
  26. Mover os ratos de volta para sua gaiola e colocar um cartão de "agente de BSL-2 em uso" na gaiola.
  27. Monitorar os ratos para insuficiência respiratória imediatamente após a intubação e depois a cada 15 min até ratos acordam da anestesia. Não abandone os ratos até eles recuperaram a consciência suficiente para manter a prostração esternal.
  28. Examine a intubação de post de 24 h de camundongos e três vezes por semana para quaisquer sinais de morbidade.
  29. Manter o registro no diário de bordo da data do procedimento, identificação animal, tipo de procedimento, o tipo de observações de monitoração anestésicas e pós-operatória e vezes.
  30. Monitorar os ratos para perda de peso, dificuldade respiratória, anormalidades comportamentais e um escore de condição corporal < 2 (segmentação da coluna vertebral dorsal/evidente ossos pélvicos são palpáveis) bi-semanal após inoculação de bleomicina.
    Nota: Os ratos com tumores de pulmão podem apresentar irritação respiratória, perda de peso, caquexia, e/ou morte.
  31. Eutanásia em ratos com insuficiência respiratória ou ratos que experimentaram a perda de 15% da massa corporal por CO2 ou cetamina/xilazina seguido por deslocamento cervical se recolha de tecidos. Confirme a eutanásia através da realização de palpação para a atividade respiratória.

5. acompanhamento do crescimento do Tumor por imagens de bioluminescência

  1. Repita a imagem dos ratos em pós-enxertia dia 3 e semanal posteriormente.
  2. ANESTHETIZE ratos injetando xilazina/cetamina (conforme descrito nas etapas 2.4-2.5) ou por inalado isoflurano (2%). Monitorar a respiração dos ratos e empregar uma pitada de dedo do pé para confirmar anesthetization adequada. Aplica o vet pomada nos olhos para evitar ressecamento enquanto sob anestesia.
  3. Raspar a região de costela inteira ambos ventralmente e dorsalmente, de B6129SF1/J e outras estirpes de rato com cabelo escuro usando um barbeador elétrico antes da imagem latente.
  4. Uma vez que os ratos estão sob anestesia, injetar 100 µ l de luciferina retrô-orbitally (15 mg/mL) usando uma agulha de insulina. Espere 2 min. suplente o olho usado para injeção cada sessão de imagens.
  5. Coloque os ratos no tonalizador e adquirir imagens dorsais e ventrais, conforme descrito nas etapas 4.22-4,24.
  6. Coloque os ratos volta para a jaula após imagem, nas suas costas sobre uma superfície plana para a recuperação.
    Nota: Todo o processo levará 5 min por grupo de 5 ratos. Não abandone os ratos até eles recuperaram a consciência suficiente para manter a prostração esternal.
  7. Analise as imagens usando o software de análise de tonalizador/bioluminescência.
    1. Selecione as imagens adequadas e carregá-los como um grupo do software de análise de bioluminescência.
    2. Clique ferramenta ROI | Praça para adicionar uma região quadrada de interesse (ROI). Coloque o ROI sobre a área da parte superior do tórax, cobrindo a imagem do pulmão inteiro. Repita isto para cada imagem do mouse.
    3. Botão direito do mouse e selecione copiar todas ROI função para aplicar o mesmo ROI para todas as imagens no grupo e posicioná-los na parte superior do tórax dos camundongos, vista ventral e dorsal.
    4. No canto superior esquerdo da janela de imagem, selecione a função de fótons . Clique na função de painel de controle de medida para medir o ROIs. Copie e cole a tabela de saída que contém o fluxo total (fótons/s) em um software de escolha para analisar os dados ainda mais.
    5. Normalize o valor diário de ROI de cada rato para seu ROI valor medido no dia 0.

6. tecido isolamento e processamento.

  1. ANESTHETIZE ratos injetando xilazina/cetamina (conforme descrito nas etapas 2.4-2.5 ou por inalado isoflurano (2%). Monitorar a respiração dos ratos e empregar uma pitada de dedo do pé. Confirme anesthetization adequada quando o mouse não responde aos pés pitada. Aplica o vet pomada nos olhos para evitar ressecamento enquanto sob anestesia.
  2. Injetar 100 µ l de luciferina retrô-orbitally (15 mg/mL) usando uma agulha de insulina. Espere 2 min.
  3. Ratos de imagem seguindo passos 4.22-4.24 do presente protocolo.
  4. Injete o outro olho da etapa 6.2 outro 100 µ l de luciferina retrô-orbitally usando uma agulha de insulina antes da eutanásia.
  5. Eutanásia em ratos por injeção intraperitoneal de xilazina/cetamina (consulte a etapa 2.4 para mais detalhes) seguido por deslocamento cervical se ratos estão sob anestesia profunda em conformidade com as orientações fornecidas pela IACUC. Confirme a eutanásia através da realização de palpação para a atividade respiratória.
  6. Usando uma tesoura cirúrgica estéril faça uma incisão de pele abaixo do esterno. Abra a camada muscular ao longo do diafragma usando fórceps e a tesoura cirúrgica e expor a cavidade torácica cortando através da caixa torácica para nenhum dos lados laterais evitando as artérias torácicas internas.
  7. Perfundir o mouse, fazendo uma pequena incisão no átrio direito do coração e injetar 5 mL de PBS através do ventrículo esquerdo. A cor do tecido do pulmão vai de vermelho para rosa pálido-branco se a perfusão sanguínea é feito corretamente.
  8. Impostos especiais de consumo os pulmões da cavidade torácica cuidadosamente, agarrando o esôfago ou coração com fórceps. Suavemente, puxe o tecido e use tesoura cirúrgica para corte cuidadosamente o tecido conexão evitando perfuração do tecido pulmonar. A traqueia preserve o máximo possível para a inflação das vias aéreas pulmonares em uma etapa posterior.
  9. Lave o pulmão submergindo e agitando o tecido 3 vezes em um 6 prato bem cheio de 3 mL de PBS para remover o excesso de sangue.
  10. Coloque o pulmão para a tampa de uma placa bem 6 e coloque a tampa que contém o tecido no tonalizador bioluminescente e adquirir uma imagem luminescentes30.
    Nota: Recomendamos selecionar as seguintes configurações no painel de controle"aquisição" de "campo de visão = A" e "assunto altura = 0,75 cm" e então "exposição automática" para evitar imagens saturadas.
  11. Impostos especiais de consumo e outros órgãos, de imagem, como feito na etapa 6,9-6,10, onde foram identificados metástase por luminescência, tais como cérebro, fígado, supra-renais, osso, gânglios linfáticos, rim ou baço31.
  12. Perfundir o pulmão com 1 mL de paraformaldeído 4%, inserindo a agulha na traqueia do mouse. Os pulmões inflará se bem perfundidos.
    Cuidado: paraformaldeído 4% é um tóxico, uma saúde de risco GHS07 e GHS08.
  13. Transferi os pulmões em um 15ml cónico com 5 mL de paraformaldeído 4%.
  14. Corrigi os pulmões ou outros tecidos incubando o tecido com paraformaldeído 4% durante a noite a 4 ° C, em um dispositivo de agitação a 30-50 rpm.
  15. Incorpore os pulmões (ou outros tecidos) em parafina ou temperatura ideal corte composta dependendo do aplicativo de32.
    Nota: A parafina é o método preferido para preservar a estrutura pulmonar e para Masson Trichrome e coloração de hematoxilina-eosina.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para aumentar a eficiência da enxertia de célula de câncer LUAD nos pulmões de ratos, desenvolvemos um protocolo que primeiro pre-condições das vias aéreas utilizando a bleomicina seguida por injeção de células de tumor ortotópico (Figura 1). Confirmamos que, mesmo quando administrado em ratos imunodeprimidos modelo, bleomicina induzido fibrose transitória por dia 14, como evidenciado pela perda da arquitetura das vias aéreas e a deposição de colágeno aumenta...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Marcantes clínicos paralelos foram documentados entre câncer de pulmão e outras doenças crônicas do pulmão36. Em particular, pacientes com fibrose pulmonar idiopática (IPF) tem uma predileção maior para desenvolver câncer de pulmão, e esta associação é independente de fumar história37,38. IPF é caracterizada pela destruição progressiva da arquitetura pulmonar e insuficiência respiratória através da deposição de ECM39

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo foi financiado por concessões do Instituto Nacional de câncer (R01CA166376 e R01CA191489 para D.X. Nguyen) e o departamento de defesa (W81XWH-16-1-0227 para D.X. Nguyen).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
BleomicinaSigmaB5507-15UNCUIDADO Perigo para a saúde GHS08
Exel Cateter 24GFisher1484121 Remova aagulha. Para injeção intratraqueal
Cetamina (Ketaset inl 100 mg / mL C3N 10 mL)Butler Schein56344Para anestesiar camundongos
XylazineButler Schein33198Para anestesiar camundongos
Cetoprofeno, 5.000 mgCayman Chemical10006661Analgésico
Puralube Pomada Oftálmica VeterináriaBUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC8897Para evitar o ressecamento dos olhos sob anestesia
o pó de D-luciferinaPerkin Elmer Health Sciences Inc122799Para imagens luminescentes. Reconstitua o pó com PBS para uma concentração de trabalho de 15mg/mL. Proteger da luz
Suporte de intubação de roedoresBraintree ScientificRIS-100Suporte recomendado para injeção intratraqueal
MI-150 ILUMINADOR 150W MI-150DOLAN-JENNER INDUSTRIESMI-150 / EEG2823MPara iluminar e visualizar a traqueia
Pinça Graefe, 2,75 (7 cm) de comprimento serrilhadoRobozRS-5111Para injeção intratraqueal
Seringa Luer-Lok Estéril 5mlBD / Fisher309646
Satiny Smooth by Conair Barbeador Recarregável Duplo/SecoConair-Parabarbear ratos
Tesoura Bonn, 3.5" reta 15 mm afiada/afiada lâminas de corte seguroRobozRS-5840SC
Tubo cônico de 15 mLBD / Fisher352097
Tubos de centrífuga de 1.5 mLEUA SCIENTIFIC INC1615-5500
Frasco de Cintilação 7 mL de Vidro Borosilicato GPIFisher701350
Pontas de pipeta de filtro (200 μ L)USA SCIENTIFIC INC1120-8710
Fosfato TampoladoSalino Life Technologies14190-144
0,25% Tripsina-EDTALife Technologies25200-056
DMEM alta glicoseLife Technologies11965-092
RPMI Medium 1640Life Technologies11875-093
Soro bovino fetal USDALife Technologies10437-028
Penicilina-EstreptomicinaLife Technologies15140-122
Anfotericina BSigmaA2942-20ML
Mancha Azul de Tripano 0.4%Life Technologies15250-061
Condessa Contador de Células AutomatizadoLifeAMQAX1000
Frasco T/C 75cm sq pescoço inclinado, tampa azulFisher / Corning353135
IVIS Spectrum Xenogen BioluminiscencePerkin Elmer Health Sciences Inc124262Para in vivo imagem de bioluminescência
Software de imagem vivaPerkin Elmer Health Sciences Inc128113Para análise de bioluminescência in vivo
Sistema de Anestesia a Gás XGI-8Perkin Elmer Health Sciences Inc118918Para anestesia com isoflurano
Seringa de insulina de agulha curta BD Ultra-Fine II 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 pol)BD / FisherBD328418Para injeção retro-orbital de luciferina
Seringa 1mlBD / Fisher14-823-434Para injeções intraperitoneais
26 G x 1/2 pol. agulhaBD / Fisher305111Para injeções intraperitoneais
4% ParaformaldeídoVWR43368-9MCUIDADO Perigo para a saúde GHS07, GHS08. Para fixação de tecidos
Pipeta-Lite Pipeta, Unv. SL-200XLS+METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL
Hematoxilina de MayerCIÊNCIAS DE MICROSCOPIA ELETRÔNICA517-28-2
Coloração de Eosina Y 0,25% (p/v) em 57%Fisher67-63-0
Kit de Coloração Tricrômica MassonIMEB IncK7228Para coloração tricrômica masson para visualizar
colágeno Superfrost mais lâminas de vidroFisher
placa de 6 poçosCorningC3516
Kit Universal de Detecção de MicoplasmaATCC30-1012K
OCT Composto de incorporaçãoELECTRON MICROSCOPY SCIENCES62550-12Para embutir tecido para seções congeladas
Leica CM3050 S Criostato de pesquisaLeicaCM3050 SPara seção de tecido para análise
de coloraçãoMicroscópio de Fluorescência KeyenceBZ-X700
ImageJUS National Institutes of HealthIJ1.46http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 para Mac OS XGraphPad Software, Inc.-
Camundongos atímicos (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu)Charles RiverNIH-553
NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) camundongosJackson Laboratories5557
camundongos B6129SF1/JJackson Laboratories101043
células NIH-H2030ATCCCRL-5914
368T1generosamente fornecidas por Monte Winslow (Standford University)-
PC9 célulasNguyen DX et al. Cell. 2009; 138:51; Células
BrM3Nguyen DX et al. Cell. 2009; 138:51; 62-
, Technologies 17014411 1255015 62-H2030

Referências

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Bleomycin Pre ConditioningTumor Cell EngraftmentLung Adenocarcinoma ModelIntratracheal InjectionBioluminescence ImagingMouse Strain VariabilityMetastasis DetectionFibrosis InductionXenograft Tumor Models

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