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Artigo de método

Estabelecer um modelo de Mouse de uma neuropatia de pura fibra pequena com o ultrapotente agonista do Receptor transitório potencial Vanilloid tipo 1

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DOI:

10.3791/56651

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13 de fevereiro de 2018

 ,  , 
1Department of Anatomy, School of Medicine, College of Medicine, Kaohsiung Medical University, 2Department of Medical Research, Kaohsiung Medical University Hospital, 3Department of Medical Research, Ultrastructural Laboratory, Kaohsiung Medical University Hospital

Neste artigo

Resumo

Este estudo estabelece um modelo experimental de neuropatia de pura fibra pequena com reductase (RTX). Uma única dose de RTX (50 µ g/kg) é ideal para o desenvolvimento de um modelo de neuropatia de pequenas fibras que imita as características do pacientes e pode ajudar a investigar o significado molecular nociceptivo subjacente a dor neuropática.

Resumo

Pacientes com diabetes mellitus (DM) ou aqueles que experimentam os efeitos neurotóxicos dos agentes quimioterápicos podem desenvolver transtornos sensação devido à degeneração e lesão dos neurônios sensoriais de pequeno diâmetro, referida como neuropatia de pequenas fibras. Modelos animais presentes de neuropatia de pequenas fibras afetam ambas as fibras sensoriais de grande e pequena-diâmetro e assim criar uma neuropatologia demasiado complexo para avaliar correctamente os efeitos do lesionado fibras sensoriais de pequeno diâmetro. Portanto, é necessário desenvolver um modelo experimental de neuropatia de pura fibra pequena adequadamente examinar estas questões. Este protocolo descreve um modelo experimental de neuropatia de pequenas fibras especificamente que afetam os nervos sensoriais de pequeno diâmetro com reductase (RTX), um agonista ultrapotente transitória do receptor potencial da tipo do vanilloid de 1 (TRPV1), através de uma dose única de injeção intraperitoneal, referida como neuropatia RTX. Esta neuropatia RTX mostrou manifestações patológicas e anormalidades comportamentais que imitam as características clínicas dos pacientes com neuropatia de pequenas fibras, incluindo intra-epidérmicas degeneração de fibras nervosas (IENF), especificamente de lesões em neurônios de pequeno diâmetro e indução térmico obtidos e alodinia mecânica. Este protocolo testado três doses de RTX (200, 50 e 10 µ g/kg, respectivamente) e concluiu que uma dose de crítica de RTX (50 µ g/kg) é necessária para o desenvolvimento das manifestações de neuropatia de fibra pequena típica e preparado um procedimento modificado imunocoloração para investiga IENF degeneração e lesão neuronal soma. O procedimento modificado é rápida, sistemática e econômica. Avaliação comportamental de dor neuropática é essencial para revelar a função dos nervos sensoriais de pequeno diâmetro. A avaliação dos limiares de mecânicas em roedores experimentais é particularmente desafiadora e este protocolo descreve uma malha de metal personalizada que é apropriada para este tipo de avaliação em roedores. Em resumo, neuropatia RTX é um modelo experimental de novo e facilmente estabelecido para avaliar a significância molecular e intervenção subjacentes dor neuropática para o desenvolvimento de agentes terapêuticos.

Introdução

Neuropatia de pequenas fibras envolvendo dor neuropática, que é evidente pela degeneração do IENFs, é comum em vários tipos de condições, tais como DM e como resultado os efeitos neurotóxicos da agentes quimioterapêuticos1,2, 3,4,5. IENFs são os terminais periféricos dos neurônios de pequeno diâmetro, localizados no gânglio da raiz dorsal (DRG) e são afetados em paralelo em caso de degeneração de IENF6. Por exemplo, a transcrição genética montante alterada do somata neuronal demonstrou o upregulation de ativação de transcrição fator-3 (ATF3)6,7. Além disso, a avaliação da inervação IENFs com biópsia de pele é útil para o diagnóstico de neuropatia de pequenas fibras5,8,9. Tradicionalmente, os perfis das IENFs sobre a biópsia de pele têm dependia de imuno-histoquímica demonstração do produto do gene da proteína 9,5 (PGP 9.5)1,10,11. Tomados em conjunto, os perfis patológicos de DRG e IENFs refletem a neuropatia de pequenas fibras subjacente condição funcional e podem ser um indicador para as consequências funcionais deste tipo de neuropatia em neurônios de pequeno diâmetro.

Anteriormente, vários modelos experimentais têm abordou a questão da degeneração IENF em casos de neuropatia induzida por quimioterapia12,13 e nervo lesões causadas por compressão ou transecção de14,15 , 16. estes modelos experimentais também afetou os nervos de grande diâmetro; foi, portanto, não é possível excluir a contribuição dos nervos de grande diâmetro afetados em neuropatia a fibra pequena observados; por exemplo, o exame de desordem de thermosensation pela retirada nociva depende funcional fibras nervosas motoras17,18,19. Assim, estabelecer um modelo de neuropatia de pura fibra pequena e sistematicamente a investigar o estado patológico do somata neuronal e suas fibras de nervo periféricas cutâneas nos neurônios de pequeno diâmetro são necessário e imperativo.

RTX é um análogo da capsaicina e um potente agonista ao receptor transitória potencial vanilloid receptor 1 (TRPV1), que medeia o processamento nociceptivo20,21,22. Recentemente, tratamento de RTX periférico aliviou a dor neurogênica23,24,25 e uma injeção intraganglionic de RTX induzida perda irreversível da DRG neurônios22. O efeito da administração de RTX periférica é dose-dependente20,26,27, que resultou na dessensibilização transitória ou degeneração de IENFs. Curiosamente, tratamento de RTX sistemático do elevado-dose levou a dor neuropática28, um sintoma da neuropatia de pequenas fibras. Estes achados sugerem que o modo de tratamento e dose de RTX produzam efeitos patológicos distintos e respostas neuronais; a saber, administração periférica impediu a transmissão de dor por efeitos locais29 e afetou o somata neuronal que desenvolveu comportamento neuropática6. Coletivamente, esses achados indicam que RTX tem um efeito multipotency e levantou a questão de saber se existe uma dose específica de RTX que sistematicamente poderia afetar os nervos periféricos, tais como o IENFs periféricas e central somata neuronal. Em caso afirmativo, RTX poderia ser um potencial agente especificamente afetar os neurônios de pequeno diâmetro e imitar a neuropatia de pequenas fibras na clínica. Por exemplo, o DM na clínica é uma questão complicada, incluindo distúrbio metabólico e neuropatologia de nervos periféricos, que são as principais características da neuropatia de pequenas fibras. Os mecanismos de neuropatia associada a DM pequena fibra não poderiam excluir a contribuição da desordem metabólica que pode não ser o principal agente que afectam os nervos periféricos. Portanto, a neuropatia associada a DM pequena fibra requer um modelo animal puro que pudesse excluir os efeitos da desordem metabólica sistemática. Este protocolo descreve a dose de trabalho de RTX para desenvolver um modelo de neuropatia de fibra pequena típica, incluindo IENF degeneração e lesão do neurônio de pequeno diâmetro, como demonstrado pela análise de imunocoloração modificados.

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Protocolo

Todos os procedimentos descritos estão em conformidade com as diretrizes éticas para animais de laboratório30, e o protocolo foi aprovado pela Animal Comité de Kaohsiung Medical University, Kaohsiung, Taiwan.

1. estabelecimento de neuropatia RTX

Atenção: RTX é neurotóxico e perigosos. Ao entrar em contato, ele age como um irritante para os olhos, mucosas e trato respiratório superior. Evitar a inalação e vestir casacos e óculos de laboratório durante a preparação de RTX. Enxaguar com água em caso de contacto com a pele ou após o manuseio.

  1. Adicione 1 mg de pó RTX para um 200 µ l de mistura de volumes iguais de Tween 80 e etanol absoluto (100 µ l de cada solvente).
  2. Alíquota da solução RTX (12 µ l/frasco) e armazenar a-20 ° C, por até 3 meses. Isto constitui o estoque RTX; Descarte o restante da solução RTX na expiração.
  3. Dilua o estoque RTX com solução salina normal para um volume final de 600 µ l. A concentração final da solução RTX deve ser 0,01%, o que equivale a 1 µ g/ml RTX solução de veículo 10 µ l.
  4. Use 8 semanas masculino ICR ratos adultos (35-40 g) como animais experimentais e administrar uma dose única de solução RTX (dose: 200, 50 e 10 µ g/kg, respectivamente) intraperitonealmente (i.p.) com uma seringa de microinjeção para os ratos. Ratos foi anestesiado pelo inalador com 5% de isoflurano para anestesia profunda. Se os ratos mostraram ação de retirada das extremidades durante a injeção de RTX, ratos devem tomar inalação mais longa da anestesia.
    Exemplo: Se o rato pesa 40 g, então ele receberá 20 µ l da solução de RTX, representando a dose de 50 µ g/kg.
  5. Dar a um grupo de ratos um volume igual de veículo (10% Tween 80 e 10% etanol absoluto em solução salina), como um controle.
  6. Após a injeção de RTX, retorne os ratos de uma gaiola de plástico em um 12-h luz/12 h-escuro ciclo e fornecem comida e água ad libitum.

2. avaliação do comportamento neuropática

Nota: Manter os animais em um ambiente confortável (passo 1.6) para permitir a recuperação após a injeção. No dia 7 post RTX da injeção (D7), cada animal realiza os testes de filamento placa quente e von Frey cabelo no mesmo dia para reduzir o viés de tempo e promover a eficiência dos testes comportamentais. Trazer os animais para um quarto silencioso é mantido a uma umidade estável (40%) e temperatura (27 ° C) para a otimização de aclimatação animal e reduzir os efeitos ambientais durante os testes comportamentais. Não perturbe os animais durante os períodos de teste; os testes comportamentais estão agendados semanalmente.

  1. Medição de latências térmicas com o teste de placa quente
    1. Coloque o animal delicadamente sobre uma placa de metal quente (27 cm x 29 cm) com uma gaiola de acrílico transparente (comprimento × largura × altura: 22 cm x 22 cm × 25 cm; Figura 1A). Regule a temperatura da placa de metal quente a 52 ° C.
    2. Começa a medir a duração da latência de térmica do animal sobre a chapa com o temporizador passo-na, built-in da placa quente, uma vez que o composto do animal toca na placa quente e observa as respostas do composto do animal. Se o animal mostra a tremer, lambendo de composto, ou saltar enquanto na chapa quente, removê-lo e gravar a duração que o animal permaneceu na chapa quente. Esta duração de tempo define a latência térmica de um animal individual. Gravar a latência térmica ao mais próximo 0.1 s.
    3. Para cada sessão de teste, realizar três ensaios com intervalos de 30 min para normalização de resposta após o último teste da placa quente. Se o animal não mostra nenhuma resposta sobre a chapa, interromper a sessão após 25 s para evitar possíveis danos nos tecidos.
  2. Teste de medição do limiar mecânico com o filamento de cabelo de von Frey
    1. Colocar o animal sobre a malha de metal personalizada (tamanho de engranzamento: 5 × 5mm) com uma gaiola de Plexiglas cilindro semi transparente (diâmetro: 13 cm; altura: 12cm) (figura 1B) para aclimatação pelo menos 2 h.
    2. Aplica os diferentes calibres dos filamentos von Frey cabelo à região plantar do hindpaw com o método de altos e baixos31. Inicie o aplicativo inicial da força média de um conjunto de filamentos de von Frey cabelo para uma duração de aplicação de filamento de 5-8 s.
    3. Use um intervalo de 2 min entre aplicativos de filamento para otimizar a normalização de animais. Altere a força do filamento aplicada com base na última resposta do animal.
      Nota: Um conjunto de filamentos de von Frey cabelo consiste de 0,064, 0,085, 0.145, 0.32, 0,39, 1.1 e aplicação de força de 1,7 g. Por exemplo, se hindpaw retirada ocorreu com uma força inicial de 0,32 g, em seguida, aplica 0,145 g. Na ausência de retirada de pata, uma força de 0,39 g é então aplicada. Então quatro filamentos adicionais das diferentes forças são aplicados com base nas respostas anteriores e o mecânico limiar é calculado de acordo com uma fórmula publicado31.
    4. Para cada sessão de teste, inclua o composto bilateral. Realize três ensaios para cada hindpaw. Expressa a média desses limiares seis mecânicos como o limiar de mecânico médio (mg) de cada animal.

figure-protocol-1
Figura 1. Feito por gaiola de acrílico e metal engranzamento para a avaliação da dor neuropática no modelo do rato do reductase (RTX)-induzido neuropatia de pequenas fibras. (, B) Estes gráficos mostram o equipamento utilizado para medir o (A) as latências térmicas por uma placa de metal quente (27 cm x 29 cm) com uma gaiola de acrílico transparente (comprimento × largura × altura: 22 cm x 22 cm × 25 cm) e (B) o limite mecânico por uma meta personalizado de avaliar malha de l (tamanho de engranzamento: 5 × 5mm) com uma gaiola de Plexiglas cilindro semi transparente (diâmetro: 13 cm; altura: 12cm) nos ratos com neuropatia induzida por RTX pequena fibra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. preparação de biópsia e avaliação da inervação IENFs de pele

  1. Após testes de comportamento, anestesiar os animais com 5% de isoflurano e sacrificar os animais por perfusão intracardíaca com tampão de fosfato 0,1 M (PB) (pH 7,4), seguidos por paraformaldeído 4% (4P) em PB de 0,1 M.
  2. Corte dos footpads primeiros do composto de dois após a perfusão e pós-se fixam-lhes em 4P para h. 6 outra transferência o tecido Whitney para PB 0,1 M a 4 ° C para armazenamento a longo prazo.
  3. Footpads crioproteção com 30% de sacarose em PB durante a noite e o corte na vertical de forma de superfície plantar em fatias grossas de 30 µm. Rotular o Whitney seções sequencialmente e em seguida, armazenar em anticongelantes a-20 ° C.
    Nota: A composição de anticongelante é a seguinte: água destilada, glicerol de etileno, glicerol e 2 x PB em uma relação de 3:3:3:1.
  4. Para garantir a amostragem adequada, selecione cada terceira seção da Whitney.
    1. Colocar as seções escolhidas Whitney em lâminas de vidro revestido e secá-los.
    2. Cobrir com uma tampa de plástico no slide e processo com procedimentos padrão immunostaining.
      1. Saciar as seções de Whitney com 1% H2O2 em metanol por 30 min e bloquear com leite seco desnatado 0,5% e 0,1% Triton X-100 no buffer de 0,5 M Tris (Tris) por 1h.
      2. Incubar a seções de Whitney com anti-soros contra pan marcador axonal, PGP 9.5 (criado em coelho; 1:1, 000), durante a noite a 4 ° C.
      3. Incubar as secções de Whitney com uma cabra anti-coelho IgG secundário biotinilado à temperatura ambiente (RT) por 1h e então incubar com o complexo avidina-biotina na RT por 45 min.
      4. Visualizar o produto da reação com 0,05% 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) solução para 45 s. Em seguida, lave as seções de pata com água destilada e secar ao ar livre para a montagem.
        Nota: Os anti-soros primários e secundários são diluídos com 0,5% de leite seco desnatado em 0,5 M Tris.

4. DRG seção de preparação e avaliação de neurônios de pequeno diâmetro feridos

  1. Dissecar o 4th e 5th lombar DRG e pós correção para outro 2 h.
  2. Tecidos Cryoprotect DRG com 30% de sacarose em PB durante a noite e cortar a uma espessura de 8 µm sequencialmente, coloque em corrediças do microscópio e etiqueta. Armazenar as seções DRG em um freezer-80 ° C.
  3. Seções Immunostain DRG em 80 µm-intervalos para garantir a amostragem adequada.
    1. Execute procedimentos de imunocoloração DRG como aqueles das seções Whitney, exceto para os procedimentos de imunofluorescência dobro-rotulagem. Alternativamente, incluem o ATF3 (criado em coelho; 1: 100), um marcador de lesão e peripherin (criado em rato; 1:800), um marcador neuronal de pequeno diâmetro nos anti-soros primários.
    2. Incubar as seções DRG com a mistura de anti-soros primários durante a noite a 4 ° C.
  4. Incubar as seções DRG com qualquer isotiocianato Texas vermelho ou fluoresceína (FITC)-conjugados anti-soros secundários (1: 200), correspondendo aos anti-soros primários apropriados no RT por 1h e em seguida montar para quantificação.

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Resultados

Este protocolo descreve um modelo de romance do rato de neuropatia RTX, que especificamente afeta os neurônios de pequeno diâmetro, incluindo degeneração IENF, associada com distúrbios sensoriais (Figura 2). Seguindo o protocolo descrito neste documento, animais exibiram térmico obtidos e alodinia mecânica em injeção de RTX D7 post. Para estabelecer este modelo de neuropatia de pequenas fibras, três doses de RTX: 200, 50 e 10 µ g/kg foram administradas por vi...

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Discussão

Terapia eficaz de neuropatia de pequenas fibras na clínica é necessária para promover a recuperação funcional e qualidade de vida dos pacientes. Atualmente, não há falta de um guia terapêutico visando a desordem sensorial associada com a neuropatia de pequenas fibras devido à falta de compreensão abrangente dos mecanismos moleculares subjacentes a lesão neuronal de pequeno diâmetro. Modelos anteriores de neuropatia geralmente afetado ambos os nervos sensoriais de grande e pequena-diâmetro; por exemplo, os modelos de neur...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por concessões do Ministério da ciência e tecnologia (106-2320-B-037-024), Kaohsiung Medical University (KMU-M106028, KMU-S105034) e objetivo para a concessão de universidades de topo (TP105PR15), universidade médica de Kaohsiung, Taiwan.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagente químico
ResiniferatoxinaSigmaR8756
Tween 80SigmaP1754
3,3'-diaminobenzidinaSigmaD8001
complexo avidina-biotinaVetorPK-6100
NomeCompanyNúmero de catálogoComentários
Primary Anti-soros
PeriferinaChemiconMAB-1527
ATF3Santa CruzSC-188
PGP9.5UltraCloneRA95101
< strong>NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Secundário Anti-soros
Biotinilado cabra anti-coelhoIgG VectorBA-1000
Texas Red-conjugado cabra anti-ratoJackson ImmunoResearch115-075-146
Isotiocianato (FITC) - burro conjugado anti-coelhoJackson ImmunoResearch711-095-152
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Equipamento
Placa quenteIITC Modelo 39
von Frey filamentoSomedic Sales AB10-600-0001
NomeEmpresaNúmero de CatálogoComentários
Material
Shandon Placa de coberturaThermo scientific72110017
Rack deslizanteThermo scientific73310017

Referências

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Reimpressões e permissões

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Estabelecer um modelo de Mouse de uma neuropatia de pura fibra pequena com o ultrapotente agonista do Receptor transitório potencial Vanilloid tipo 1
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