Controle espacial e Temporal da ativação de células T usando um agonista Photoactivatable

Summary

Este protocolo descreve um método baseado em imagem para ativar os linfócitos T usando photoactivatable peptídeo-MHC, permitindo um controle preciso da ativação de células T spatiotemporal.

Abstract

Linfócitos T envolver-se na rápida, polarizado sinalização, ocorrendo dentro de minutos após a ativação do TCR. Isto induz a formação de sinapse imunológica, uma junção de célula-célula estereotipadas que regula a ativação de células T e metas direcionalmente respostas efetoras. Para estudar estes processos efetivamente, é necessária uma abordagem de imagem que é adaptada para a captura de respostas rápidas, polarizadas. Este protocolo descreve um sistema, que é baseado em um photoactivatable do peptide-major formando um complexo (pMHC) que é não-estimulatórios até que ele é exposto à luz ultravioleta. Decaging alvo estes reagentes durante experimentos de tele-microscopia permite controle spatiotemporal preciso da ativação do TCR e monitoramento de alta resolução de respostas celulares subsequentes por reflexão interna total (TIRF) de imagem. Essa abordagem também é compatível com estratégias de perturbação genética e farmacológicas. Isso permite que o conjunto das vias moleculares bem definidos que link TCR sinalização para a formação das estruturas do citoesqueleto polarizadas que fundamentam a sinapse imunológica.

Introduction

Linfócitos T (células T) desempenham um papel central na imunidade celular, reconhecendo peptídeos antigênicos exibidos no contexto da superfície de células MHC. Reconhecimento do antígeno, que é mediado pelo TCR, dirige a diferenciação de células T de ingênuo e promove a entrega de respostas citolíticas e comunicativas por populações efetoras. Noivado de TCR também induz mudanças dramáticas na arquitetura celular. Em poucos minutos, as células T cisma no lado da célula apresentadora de antígeno (APC), formando uma interface polarizada conhecida como sinapse imunológica (IS)^1,2. A IS potencializa respostas de células T efetoras, permitindo o lançamento direcional de citocinas ou, no caso dos linfócitos T citotóxicos (CTLs), proteínas líticas que destruir o APC.

Noivado de TCR por pMHC induz a rápida fosforilação de várias moléculas de adaptador a jusante, incluindo o vinculador para as células de ativação de T (LAT), que, finalmente, promove a remodelação robusto do citoesqueleto sináptica². Actina filamentosa cortical (F-Actina) conduz a célula T, espalhando sobre a superfície da APC e então resolve em uma estrutura anular caracterizada pelo acúmulo de F-Actina na periferia IS e depleção do centro. Formação de anel F-Actina é rigidamente acoplada a reorientação do centro organizador de microtúbulos (MTOC, também chamado a centrossoma em células T) para uma posição abaixo do centro da interface. Ambos os eventos ocorrem em poucos minutos de reconhecimento inicial do antígeno e estabelecer o contexto arquitetônico em que eventos de ativação subsequente e efetoras respostas ocorrem.

Para estudar a formação de IS, vários laboratórios desenvolveram abordagens em que o APC é substituído por uma superfície de vidro que contém ligantes TCR imobilizados ou suporta uma bicapa lipídica que em si contém o ligantes^3,4. Células T formam IS-como contatos nestas superfícies que pode ser fotografada por microscópio de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) ou microscopia confocal, permitindo estudos de alta resolução do início da ativação de células T e formação de IS.

Embora essas abordagens têm permitido para excelente visualização do IS totalmente montado, grande parte da sinalização da seguinte ligadura TCR:pMHC ocorre em segundos, complicando os esforços para determinar a sequência de eventos após a ativação de TCR com precisão . Para contornar esse problema, uma abordagem de fotoativação foi desenvolvida, em que photoactivatable pMHC é usado para obter um controlo spatiotemporal de TCR ativação^5,6,7. Neste sistema, as células T estão conectadas em superfícies de vidro contendo photoactivatable pMHC que é não-estimulatório de TCR até irradiadas com luz ultravioleta (UV). Irradiação UV de uma região de mícron de tamanho da superfície abaixo da célula T remove o photocage criando uma zona estimulatório que pode ser reconhecida pela célula T. Sinalização de eventos subsequentes e remodelação do citoesqueleto são então monitorados usando repórteres fluorescentes geneticamente codificados. Duas versões de photoactivatable de peptídeos antigênicos, traça citocromo c_88-103 (MCC) e no_257-264 ovalbumina (OVA), que são apresentados no contexto da classe II MHC-eu... E^k e classe de MHC H2-K^b, respectivamente, foram desenvolvido (Figura 1). Isto permite a análise de ambos CD4⁺ T células específicas para MCC-l-O^k (expressando o 5 C. C7, 2B4, ou e TCRs) e CD8⁺ T células específicas para óvulos-H2-K^b (expressando o TCR OT1).

Na última década, a abordagem de fotoativação e imagem latente de TCR tem sido utilizada para estabelecer a cinética precisa de TCR primeiros passos de sinalização e também para identificar as vias moleculares que regem a remodelação do citoesqueleto polarizada^{5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10}. por exemplo, o ensaio foi fundamental na determinação que centrossoma reorientação em direção a APC é mediada por um gradiente localizado do lipídios segundo mensageiro diacilglicerol centrado no IS. Prevê-se que esta metodologia continuará a ser valioso para aplicações que exigem análise de imagens de alta resolução da função da célula T.

Protocol

1. preparação de superfícies de vidro estimulatórios

1. Casaco oito poços septada lamela com biotinilado poli-L-lisina (Bio-PLL) diluído em água destilada, deionizada (ddH₂O) 1: 500. Incube durante 30 min à temperatura ambiente (RT).
2. Lavar com H₂O.
3. Seco por 2h em RT.
4. Bloco Bio-PLL revestido de superfícies com tampão de bloqueio (HEPES salino [10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl], com 2% de BSA) durante 30 min à RT
   1. Dissolva 5 mg de poli-L-lysine hydrobromide em 1 mL de 10mm NaPO₄, pH 8,5.
   2. Adicionar 125 μmol (0,55 mg) de NHS-biotina (a partir de um estoque de 100 mg/mL em DMSO) e verificar o pH da reação. Se o pH estiver abaixo de 8,5, adicione 2 μL de 4 N NaOH para elevá-lo a entre pH 8,5 e 9,5.
   3. Vórtice por 30 min.
   4. Saciar a reação com 50 μL de 100mm glicina dissolvida em 20 mM Tris de pH 8.0.
   5. Rotação em potência máxima por 10 minutos e transferir o sobrenadante para um tubo novo.
      Nota: Qualidade de Bio-PLL é tipicamente em comparação com anteriores preparações por revestimento dois diluíções do material em uma placa de ELISA de 96 poços e quantificar o conteúdo de biotina, após incubação com fosfatase alcalina acoplado streptavidin.
5. Retire o tampão de bloqueio. Não permita que poços secar. Adicione streptavidin (100 µ g/mL de tampão de bloqueio). Incubar durante 1 h a 4 ° C.
6. Lavar em HBS. Preencher e inverter poços de slide de câmara 4 - 5 vezes, removendo HBS dos poços. Não permita que poços secar.
7. Adicione o biotinilado pMHC ligantes e moléculas de adesão à superfície.
   Nota: MCC e óvulos podem ser photocaged pela adição de orto-nitrobenzil com base proteger grupos (por exemplo, nitrophenylethyl (NPE) ou nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) para o grupo ε-amino da chaves lisinas (K12 em MCC, K7 em óvulos). Photocaged MCC e óvulos podem ser obtidos de fornecedores comerciais. Após a reconstituição em tampão aquosa, eles são novamente em modo expressa-eu... E^k e H2-K^b utilizando abordagens estabelecida^11,12.
8. Validação de peptídeo MCC ou óvulos de photoactivatable
   1. Decage peptídeos NVOC protegido por irradiação de UV com uma lâmpada UV portátil (ver Tabela de materiais) por 20 min no RT
   2. Pulso de 1,0 x 10⁵ APCs com 1 µM de peptídeo nonstimulatory (controlo negativo, por exemplo, Hb), não irradiados photoactivatable peptídeo, irradiados photoactivatable peptídeo e peptídeo agonista (controle positivo, por exemplo, MCC) por 1h para durante a noite a 37 ° C.
   3. Para estimular células T expressam a C. 5 C7/2B4/e TCR, usar células CH12 ou CH27 B. Para estimular as células T OT1, use RMA-s ou células de timoma EL4.
   4. Misture as APCs pulsados com igual número de células T em 96 poços redondo fundo placas em um volume final de 200 µ l. Incubar a 37 ° C, durante 12-24 h.
   5. Recuperar os sobrenadantes de cada poço e analisar IL-2 por ELISA com Detecção colorimétrica de peroxidase de rábano-estreptavidina.
      Nota: A confirmação do status de todos os peptídeos por espectrometria de massa electrospray antes de dobrar em complexos MHC, enjaulamento é altamente recomendável.
9. Execute o dobramento e purificação de MHC, a fim de minimizar a exposição à luz. Por exemplo, envolver reações de dobradura em papel de alumínio e realizar a cromatografia de gel filtração com a lâmpada UV.
   Nota: Tem sido encontrado que photoactivatable MCC-l-O^k e óvulos - H2-K^b induzem a ativação de célula independente de T UV em alta densidade, em decorrência de enjaulamento funcional incompleta. Portanto, o pMHC photoactivatable é diluída em um excesso de x de 10-30 de nonstimulatory pMHC (por exemplo, eu-E^k contendo o peptídeo de_64-76 de hemoglobina (Hb)) durante a etapa de imobilização. Isso melhora a relação sinal / ruído do experimento de imagens subsequente.
10. Para Fotoativar CD4⁺ T células, coletivamente, usar uma mistura de biotinilado Hb-l-O^k (3 µ g/mL), biotinilado photoactivatable MCC-l-O^k (0,1 µ g/mL) e anticorpo biotinilado contra a classe eu MHC H2-K^k (0,5 µ g / mL). O anticorpo anti-H2-K^k incentiva 5 C. Células C7/2B4/e T, que expressam o H2-K^k, para espalhar sobre a superfície de vidro sem sofrer ativação.
11. Para CD8⁺ T células, usar uma mistura de biotinilado H2-D^b o peptídeo KAVYDFATL do rolamento (1 µ g/mL), photoactivatable biotinilado óvulos-H2-K^b (0,1 µ g/mL) e o domínio extracelular da molécula de adesão ICAM-1 (2 µ g/mL produzido por cultura de células de inseto¹³). O ICAM-1 incentiva formação próxima contato acoplando a integrina LFA1 na superfície das células T.
12. Aplicar todas as misturas de proteínas em tampão de bloqueio, seguido de incubação por 1h no RT ou pelo menos 2 h a 4 ° C.
    Nota: A densidade molecular em superfícies desse tipo para ser ~ 8000 por µm² tem sido previamente determinado⁶. Dado que photoactivatable pMHC representa ~1/30^th da proteína biotinilado na superfície, sua densidade será ~ 267 moléculas por µm², antes da decaging.
13. Lave como na etapa 1.6 e deixar na HBS até estar pronto para usar.
14. Adicionar 200.000 CD4⁺ ou CD8⁺ T células expressando o TCR apropriado em cada poço e permitir que as células a aderir a 37 ° C por 15 min. Uma vez que as células têm anexados e espalhar sobre a superfície, eles estão prontos para fotoativação e de imagem.
    Nota: Retroviral transdução de células efetoras T com fluorescentes sondas de imagem é descrita em detalhe elswhere^6,7. Sinalização de cálcio pode também ser estudada usando pilhas de T untransduced carregadas com o corante de cálcio sensíveis Fluo-4,⁶. O corante ratiometric Fura-2 não é recomendado porque requer excitação na faixa de UV, que também induz decaging de pMHC a photoactivatable.

2. aquisição de imagem

1. Use um microscópio invertido de TIRF equipado com uma lente objetiva de UV compatível 150 X para aquisição de imagens. UV irradiar regiões definidas pelo usuário, usando um sistema de diafragma digital ligado a uma lâmpada de mercúrio 100 W (HBO). Luz desta lâmpada para a amostra, usando um espelho de passe longo 400 nm direta UV.
2. Use o software de análise de imagem para photoactivation localizada e aquisição de lapso de tempo. Na maioria dos experimentos, monitorar sondas em ambos os canais vermelhos e verdes usando 488 nm e 561 lasers de excitação de nm, respectivamente. Luz laser é dirigido para a amostra utilizando um espelho dicroico dual-bandpass que também transmite na faixa de UV (para habilitar decaging). Consulte a Tabela de materiais e a Figura 6 para obter informações adicionais sobre configuração de microscópio.
3. Depois de montar o slide de câmara que contém as células T, ajuste as configurações para obter iluminação TIRF ou epifluorescência, conforme necessário. No modo de viver, selecione um campo de células que expressam a fluorescente ição de interesse. Estabelece regiões mícron-escala para photoactivation abaixo usando o software de controle de células individuais.
4. Começa a aquisição de lapso de tempo. Normalmente, 80 momentos são adquiridos, com um intervalo de 5 s entre cada ponto de tempo. Isso deixa o tempo mais que suficiente para sequencial 488 nm e 563 exposições nm, no caso de experimentos de cor dupla.
5. Após 10 momentos, Fotoativar as regiões selecionadas pela abertura do diafragma digital do obturador para 1-1.5 s.
6. Após o lapso de tempo completo, selecione um novo campo de células e repita o processo.

3. análise de dados

Nota: Photoactivation localizada de ligantes imobilizados cria um bem definido, estacionário estimulatórios que pode ser usado para análise quantitativa de sinalização respostas e eventos de remodelação do citoesqueleto. Análise de protocolos normalmente envolvem ou quantificar a intensidade de fluorescência na região irradiada ou usando a região irradiada como um ponto de extremidade posicional para medições de distância (por exemplo. para avaliar a polarização da centrossoma para o região irradiada). Ambos os protocolos de análise são descritos abaixo. Vários programas de análise de imagem interativo podem ser usados para fazer a intensidade e medições de distância, que podem então ser saída para processamento adicional e análise.

1. Intensidade de fluorescência
   1. Determine a intensidade de fluorescência (FI) de uma região de fundo fora da célula (FI_b). Isto será usado para a correção de fundo.
      1. Desenhe uma região quadrada micro-empresas fora da célula e fazer uma máscara. Para determinar a intensidade da fluorescência, clique no Analyze | Mascarar as estatísticas. Selecione Significa intensidade de fluorescência e os valores de exportação.
         Nota: Detalhes processuais (por exemplo, 3.1.1.1) referem-se ao software Slidebook (ver Tabela de materiais). Implementação do presente protocolo usando outros pacotes de software (ex., FIJI) será ligeiramente diferente.
   2. Determine o FI dentro da região de fotoativados por cada ponto de tempo.
      1. Selecione máscara para destacar a região que foi fotoativados. Para determinar a intensidade da fluorescência, clique no Analyze | Mascarar as estatísticas. Selecione Significa intensidade de fluorescência e os valores de exportação.
   3. Subtrai o fundo FI a partir dos valores medidos de FI dentro da região. Então, normalizar as medições FI corrigidas dividindo pela média, fundo corrigida FI dos primeiros 9 quadros antes de fotoativação. ΔF/F = ((FI-FI_b)/mean(FI_1-9)-FI_b)).
      Nota: Gráfico ΔF/F como uma função do tempo.
2. Distância
   1. Obter o x e y coordenadas do centro da região fotoativados.
      1. Para determinar o x e y coordenadas do centro da região fotoativados, selecione máscara para destacar a região que foi fotoativados. Uma vez que a região de fotoativação é realçada, selecione Analyze | Mascarar as estatísticas | Centro de área e exportar os valores.
   2. Determinar o x e y coordenadas para a sonda fluorescente de interesse para cada ponto de tempo. Isto geralmente é conseguido através de partícula manual ou automatizada de rastreamento.
      1. Para determinar o x e y coordenadas da sonda fluorescente de interesse, selecione Manual de controle de partículas e clique sobre a sonda fluorescente de interesse ao longo do tempo. Uma vez que todos os pontos de tempo foram controlados, selecione Analyze | Mascarar as estatísticas | Centro de área e exportar os valores.
   3. Calcular a distância entre a proteína fluorescente de interesse e o centro da região fotoativados por cada ponto de tempo usando a equação: distância = √ ((x₂x -₁)²+ (y₂y -₁)²), em que X2_{e y 2} são as coordenadas da proteína fluorescente de interesse e x₁ e y₁ são as coordenadas do centro da região fotoativados.
   4. Gráfico da distância em função do tempo.

Results

A abordagem de fotoativação e de imagem permite a observação e facile quantificação das respostas de sinalização rápidas, polarizadas. Para ilustrar suas capacidades, reproduzidas aqui, é um experimento examinando a spatiotemporal correlação entre acumulação de DAG TCR-induzida e de reorientação centrossoma. 5 C. Explosões de célula C7 T retrovirally foram transfectadas com dois repórteres fluorescentes: um biossensor DAG que contém os domínios de C1 em tandem da proteína quinase C-θ liga...

Discussion

Nos últimos anos, a luz tem emergido como uma excelente ferramenta para activação spatiotemporally controlada dos processos celulares. Várias metodologias têm sido desenvolvidos, cada um com as desvantagens e vantagens associadas. O sistema descrito aqui, que se baseia o decaging de ligantes extracelulares, imobilizados, é ideal para a análise das respostas de sinalização rápidas, subcellular, polarizadas. Esta abordagem tem sido aplicada para examinar a formação é em células T conforme descrito acima. Adicionalmente, en...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	Thermofischer Scientific	155361
bromidrato de poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P2636	Precisará fazer Biotinilated Poly-L-Lysine
EZ-Link NHS-Biotin	Thermofischer Scientific	20217	Precisará fazer Biotinilated Poly-L-Lysine
Streptavidin	Thermofischer Scientific	434301
BirA-500: Kit de reação padrão de biotina-proteína ligase	BirA Avidity	BirA500	Será usado para biotinilar proteínas
Hb biotinilada I-EK			proteínas, consulte a referência 6. Para biotinilação, use o kit BirA
Biotinilated NPE-MCC I-EK	Anaspec		Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) pode ser adquirido na Anaspec
Biotinylated α Anticorpo H2-Kk	BD Biosciences	553591
NPE-OVA biotinilado H2-Kb	Anaspec		Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) pode ser adquirido na Anaspec
Biotinylated KAVY H2-Db	A	proteína sintetizada personalizada Anaspec (KAVYDFATL) pode ser adquirida na Anaspec
			Para dobramento de proteínas, consulte a referência no protocolo. Para biotinilação, use o kit BirA
Lâmpada UV portátil	UVP	UVGL-25	A lâmpada é mantida a < 1 cm da amostra.  30 s de luz 365 é suficiente para decaging detectável, 20 min para decaging quantitativo.
Sistema Olympus IX-81 OMAC TIRF.	Olympus		Informações adicionais sobre o sistema de imagem podem ser encontradas em Figura 6
Mosaic diafragma digital	Andor
Slidebook software	Intelligent Imaging Innovations