Controle espacial e Temporal da ativação de células T usando um agonista Photoactivatable

Resumo

Este protocolo descreve um método baseado em imagem para ativar os linfócitos T usando photoactivatable peptídeo-MHC, permitindo um controle preciso da ativação de células T spatiotemporal.

Resumo

Linfócitos T envolver-se na rápida, polarizado sinalização, ocorrendo dentro de minutos após a ativação do TCR. Isto induz a formação de sinapse imunológica, uma junção de célula-célula estereotipadas que regula a ativação de células T e metas direcionalmente respostas efetoras. Para estudar estes processos efetivamente, é necessária uma abordagem de imagem que é adaptada para a captura de respostas rápidas, polarizadas. Este protocolo descreve um sistema, que é baseado em um photoactivatable do peptide-major formando um complexo (pMHC) que é não-estimulatórios até que ele é exposto à luz ultravioleta. Decaging alvo estes reagentes durante experimentos de tele-microscopia permite controle spatiotemporal preciso da ativação do TCR e monitoramento de alta resolução de respostas celulares subsequentes por reflexão interna total (TIRF) de imagem. Essa abordagem também é compatível com estratégias de perturbação genética e farmacológicas. Isso permite que o conjunto das vias moleculares bem definidos que link TCR sinalização para a formação das estruturas do citoesqueleto polarizadas que fundamentam a sinapse imunológica.

Introdução

Linfócitos T (células T) desempenham um papel central na imunidade celular, reconhecendo peptídeos antigênicos exibidos no contexto da superfície de células MHC. Reconhecimento do antígeno, que é mediado pelo TCR, dirige a diferenciação de células T de ingênuo e promove a entrega de respostas citolíticas e comunicativas por populações efetoras. Noivado de TCR também induz mudanças dramáticas na arquitetura celular. Em poucos minutos, as células T cisma no lado da célula apresentadora de antígeno (APC), formando uma interface polarizada conhecida como sinapse imunológica (IS)^1,2. A IS potencializa respostas de ....

Protocolo

1. preparação de superfícies de vidro estimulatórios

1. Casaco oito poços septada lamela com biotinilado poli-L-lisina (Bio-PLL) diluído em água destilada, deionizada (ddH₂O) 1: 500. Incube durante 30 min à temperatura ambiente (RT).
2. Lavar com H₂O.
3. Seco por 2h em RT.
4. Bloco Bio-PLL revestido de superfícies com tampão de bloqueio (HEPES salino [10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl], com 2% de BSA) durante 30 min à RT
   1. Dissolva 5 mg de poli-L-lysine hydrobromide em 1 mL de 10mm NaPO₄, pH 8,5.
   2. Adicionar 125 μmol (0,55 mg) de NHS-biotina (a partir de um estoque de 100 mg/mL em DMSO) e verifi....

Resultados

A abordagem de fotoativação e de imagem permite a observação e facile quantificação das respostas de sinalização rápidas, polarizadas. Para ilustrar suas capacidades, reproduzidas aqui, é um experimento examinando a spatiotemporal correlação entre acumulação de DAG TCR-induzida e de reorientação centrossoma. 5 C. Explosões de célula C7 T retrovirally foram transfectadas com dois repórteres fluorescentes: um biossensor DAG que contém os domínios de C1 em tandem da proteína quinase C-θ liga.......

Discussão

Nos últimos anos, a luz tem emergido como uma excelente ferramenta para activação spatiotemporally controlada dos processos celulares. Várias metodologias têm sido desenvolvidos, cada um com as desvantagens e vantagens associadas. O sistema descrito aqui, que se baseia o decaging de ligantes extracelulares, imobilizados, é ideal para a análise das respostas de sinalização rápidas, subcellular, polarizadas. Esta abordagem tem sido aplicada para examinar a formação é em células T conforme descrito acima. Adicionalmente, en.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	Thermofischer Scientific	155361
bromidrato de poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P2636	Precisará fazer Biotinilated Poly-L-Lysine
EZ-Link NHS-Biotin	Thermofischer Scientific	20217	Precisará fazer Biotinilated Poly-L-Lysine
Streptavidin	Thermofischer Scientific	434301
BirA-500: Kit de reação padrão de biotina-proteína ligase	BirA Avidity	BirA500	Será usado para biotinilar proteínas
Hb biotinilada I-EK			proteínas, consulte a referência 6. Para biotinilação, use o kit BirA
Biotinilated NPE-MCC I-EK	Anaspec		Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) pode ser adquirido na Anaspec
Biotinylated α Anticorpo H2-Kk	BD Biosciences	553591
NPE-OVA biotinilado H2-Kb	Anaspec		Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) pode ser adquirido na Anaspec
Biotinylated KAVY H2-Db	A	proteína sintetizada personalizada Anaspec (KAVYDFATL) pode ser adquirida na Anaspec
			Para dobramento de proteínas, consulte a referência no protocolo. Para biotinilação, use o kit BirA
Lâmpada UV portátil	UVP	UVGL-25	A lâmpada é mantida a < 1 cm da amostra.  30 s de luz 365 é suficiente para decaging detectável, 20 min para decaging quantitativo.
Sistema Olympus IX-81 OMAC TIRF.	Olympus		Informações adicionais sobre o sistema de imagem podem ser encontradas em Figura 6
Mosaic diafragma digital	Andor
Slidebook software	Intelligent Imaging Innovations

Para dobramento de Biotinylated ICAM1