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Imuno-fluorescente rotulagem de microtúbulos e proteínas Centrosomal em tecido Intestinal Ex Vivo e 3D em Vitro Intestinal Organoids

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DOI:

10.3791/56662

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13 de dezembro de 2017

 ,  ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, University of East Anglia, 2Norwich Medical School, University of East Anglia

Neste artigo

Resumo

Apresentamos os protocolos para isolamento de estruturas 3D intestinais do tecido em vivo e em vitro matriz de porão embutido organoids e fixação de diferentes detalhes e protocolos otimizados para imuno-rotulagem dos microtúbulos, de coloração proteínas centrosomal e juncionais, bem como célula marcadores incluindo a proteína de células-tronco Lgr5.

Resumo

O advento do 3D em vitro organoids que imitam a arquitetura de tecido na vivo e morfogênese avançou grandemente a capacidade de estudar questões biológicas centrais da biologia celular e do desenvolvimento. Além disso, organoids juntamente com os recentes avanços técnicos no gene edição e entrega do gene viral promete avançar a pesquisa médica e desenvolvimento de novos medicamentos para tratamento de doenças. Organoids crescida em vitro na matriz de porão fornecer sistemas poderoso modelo para estudar o comportamento e a função de várias proteínas e são bem adaptados para viver-imagens de proteínas fluorescentes-etiquetadas. No entanto, estabelecer a expressão e a localização das proteínas endógenas no tecido ex vivo e in vitro organoids é importante para verificar o comportamento das proteínas marcados. Para este fim temos desenvolvido e modificado o isolamento do tecido, fixação e imuno-rotulagem protocolos para localização de microtúbulos, centrosomal e associado as proteínas no tecido intestinal ex vivo e em vitro organoids intestinal. O objetivo foi para o fixador preservar a arquitetura 3D do organoids/tecido ao mesmo tempo preservar a antigenicidade do anticorpo e permitindo boa penetração e apuramento de fixador e anticorpos. Exposição ao frio depolymerizes todos, mas os microtúbulos estáveis e isto foi um fator chave ao modificar os diversos protocolos. Nós achamos que aumentar a ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) concentração do ácido de 3 mM a 30 mM deu descolamento eficiente das vilosidades e criptas no intestino delgado, enquanto 3 mM EDTA foi suficiente para criptas do cólon. O protocolo de fixação de formaldeído/metanol desenvolvidos deu muito boa preservação estrutural, preservando também a antigenicidade para rotulagem eficaz de actina, microtúbulos e proteínas (EB) a fim. Também trabalhou para a proteína centrosomal 8h30 embora o protocolo de metanol mais consistentemente trabalhado. Estabelecemos ainda mais que a fixação e imuno-rotulagem de microtúbulos e proteínas associadas poderiam ser alcançadas com organoids isolado do ou permanecendo dentro da matriz do porão.

Introdução

Formação de epitélios com polaridade ápico-basal é um processo fundamental no desenvolvimento e envolve uma reorganização dramática dos microtúbulos e proteínas centrosomal. Uma matriz radial do microtubule emanando de um localização central microtubule centrosomal organizando o centro (MTOC) é proeminente em muitas células animais e isso é bem adequado para células relativamente planas. Em contraste, as células epiteliais colunares, como as do intestino, montam matrizes de microtubule transcellular não-radial que suportam melhor a forma e funções especializadas dessas células. Esta reorganização dramática dos microtúbulos é conseguida a centrossoma movendo-se para o ápice e apicais MTOCs não-centrosomal (n-MTOCs), formando-se, que se torna responsável pela fixação dos microtúbulos transcellular1,2 , 3 , 4 , 5.

Muito do nosso conhecimento de diferenciação epitelial e a reorganização do microtubule associado vem de investigações de 2D em vitro camadas celulares que não exibem a arquitetura do tecido na vivo . Desenvolvimento de culturas em 3D em vitro organoides, precurssores Clevers e colegas de trabalho6, representa um grande avanço tecnológico, como eles imitam na vivo arquitetura e desenvolvimento. Uma hierarquia de diferenciação epitelial é evidente no intestino; células-tronco na parte inferior da criptas originar trânsito imaturo, amplificando as células que se proliferam e se diferenciam gradualmente como eles migram até a cripta para o pequena vilosidades intestinais ou a superfície do cólon, onde eles se tornam totalmente diferenciados antes de ser galpão para o lúmen,7. Importante, isto é replicado no organoids intestinal, onde as células desde o nicho de células-tronco se proliferam formando cistos que posteriormente geram cripta, como botões com células-tronco na parte inferior e a diferenciação que gradualmente progredindo em relação à região de cisto, que se torna, como vilosidades8. Os organoides intestinal, portanto, representa um poderoso modelo para estudar não só microtubule e reorganização centrosomal durante a diferenciação epitelial, mas inúmeras outras proteínas, bem como fornecendo uma plataforma ideal para a seleção de medicamentos e alimentos compostos de potencial terapêutico beneficia9,10.

Organoids são bem adaptados para viver-imagens de proteínas fluorescentes-etiquetadas ambos TOC- e em organoids de mata-mata pode ser gerado usando CRISPR/Cas9 gene edição11,12. No entanto, estabelecer a expressão e a localização das proteínas endógenas a ser estudado é importante, especialmente para verificar o comportamento das proteínas marcados. Organoids 3D imuno-rotulagem cultivados em matriz de porão ou ex vivo isolado tecido é mais complexo do que as células cultivadas em pratos de cultura em 2D. O protocolo de fixação precisa preservar a arquitetura 3D delicada de organoids, ainda preservando a antigenicidade de anticorpo (ou seja, os epítopos para anticorpos de ligação). Por exemplo, paraformaldeído 4% (PFA) é comumente usado como um fixador mas enquanto é um fixador agindo de forma relativamente rápida e dá boa preservação morfológica, em nossa experiência frequentemente resulta em perda de antigenicidade e não é adequado para muitos anticorpos centrosomal. A capacidade do fixador e anticorpos de penetrar tecidos e estruturas 3D também deve ser considerada. Para este fim, modificamos e protocolos desenvolvidos para isolamento de tecido e indireta imuno-rotulagem de organoids 3D em vitro e ex vivo isolaram tecido intestinal. Descrevemos como isolar pequenas criptas intestinais e villi e tecido do cólon e incluem um protocolo para a isolação de organoids 3D como uma alternativa para fixação e imuno-rotulagem dentro da matriz do porão. Apresentamos três protocolos alternativos de fixação para imuno-rotulagem de microtúbulos e proteínas centrosomal, tais como 8h30 e microtubule proteínas de rastreamento plus-final (+ dicas), como as proteínas do EB e CLIP-170 (Veja também referências8, 13). Também discutimos os prós e contras associados com cada protocolo.

Protocolo

Todos os métodos aqui descritos foram realizados de acordo com as diretrizes de licença institucional da Universidade de Anglia do leste.

1. isolamento do tecido Intestinal

  1. Isolamento de criptas do cólon para imuno-rotulagem (consulte a Figura 1, esquemático)
    1. Eutanásia o mouse (usando CO2 asfixia) e remover o cólon (começando o ceco e extraindo caudalmente) com tesoura e pinça14de dissecação.
    2. Liberar o conteúdo do cólon com solução salina tamponada fosfato (PBS) utilizando uma pipeta de vidro com um bulbo de borracha. PBS: (8,0 g/L) de cloreto de sódio, cloreto de potássio (0,2 g/L), hidrogenofosfato dissódico (1,15 g/L) e hidrogenofosfato de potássio (0,2 g/L), em pH 7.3.
    3. Usando uma vara de metal (2,4 mm de diâmetro) ou o fim de uma pipeta de vidro, segure uma extremidade do tubo do cólon enquanto desliza suavemente o tecido sobre a haste/pipeta eversão assim o tecido do cólon para que o epitélio está agora do lado de fora.
      Nota: Se isto não for possível em seguida, abra o cólon com uma tesoura e corte em pedaços de 5 mm.
    4. Transferi o cólon sempre ou peças para um tubo cónico de 50 mL contendo 40 mL de PBS.
    5. Inverter o tubo várias vezes para mais remover conteúdo intestinal, muco, etc.
    6. Transferir as cólon/peças para 40 mL de EDTA em PBS, 3 mM e incubar a temperatura ambiente (RT) por 15 min.
      Nota: Diluir o estoque de pH 8.0 de EDTA 0,5 M com PBS.
    7. Agite para remover o muco e transferir as cólon/peças para um tubo cônico de 50 mL contendo fresco 40 mL de EDTA em PBS de 3 mM. Incubar durante 35 min no RT.
    8. Transferir as cólon/peças a 10 mL de PBS em um tubo cónico de 50 mL e agitar vigorosamente por 30 s para liberar criptas (fração de cripta).
    9. Retire o tubo da cólon/peças e colocar volta em 3 mM EDTA, no caso de ainda mais o isolamento é necessário. Centrifugue a fração restante de cripta a 300 x g por 5 min.
    10. Retirar 5 mL do líquido sobrenadante e ressuspender a cripta do restante volume de 5 mL.
    11. Observe sob um estereomicroscópio com zoom (ampliação de X 50-100) para verificar se há presença de criptas do cólon.
      Nota: Se houver sem criptas presentes então incubam as cólon/peças em 3 mM EDTA em PBS por mais 30 minutos e em seguida, repita as etapas 1.1.8 - 1.1.11.
    12. Centrifugue a fração da cripta a 300 x g por 5 min.
    13. Remova todo o sobrenadante para obter uma pelota de cripta e proceder de imediato à fixação (secção 3).
  2. Isolamento de pequenas criptas intestinais e vilosidades para imuno-rotulagem (Figura 2)
    1. Eutanásia em rato (usando CO2 asfixia) e retire o intestino delgado (duodeno proximal ao íleo terminal) com dissecando a tesoura e pinça14.
      Nota: para ver os diferentes seções do intestino delgado, em seguida, nesta fase, separar e tratar separadamente. Veja a Figura 1 e tabela 1 para um diagrama de fluxo e horários.
    2. Liberar o conteúdo do intestino delgado com PBS usando uma pipeta de vidro com um bulbo de borracha.
    3. Abrir o intestino com uma tesoura de dissecação e coloque em 15 mL de PBS em uma placa de Petri.
    4. Lave delicadamente o intestino em PBS para remover conteúdo luminal ao não danificar a superfície da mucosa. Transferir o tecido para um prato de Petri fresco e repita a lavagem PBS.
    5. Corte o intestino em pedaços de 3 a 5 mm e transferir para uma placa de Petri contendo 15 mL de EDTA em PBS de 30 mM a 100 mm e incubar por 5 min em RT. Alternativamente incubar em 3 mM EDTA em PBS durante 30 min.
    6. Fração 1 (isolamento de vilosidades): transferir as peças intestinais em 10 mL de PBS em um tubo cônico de 50 mL, agitar vigorosamente durante 10 s e despeje em um prato de Petri de 100mm. Verifica a fração de vilosidades isoladas sob um estereomicroscópio. Nesta fase, principalmente vilosidades devem estar presentes, mas isso pode variar entre os isolamentos.
      Nota: Para evitar vilosidades isoladas/criptas aderindo ao plástico, placas de Petri e tubos de colheita deve ser pré-revestida com soro bovino Fetal (FBS). Despeje o FBS pratos e/ou tubos e removê-lo imediatamente. Consulte a tabela 1 para guias de sincronismo para cada fração.
    7. Transferir as peças intestinais volta para 30 mM EDTA em PBS e incubar durante 5 min. Durante esta incubação, colete a fração 1 em um tubo cônico de 15 mL (revestidos com FBS) e centrifugar 300 x g por 5 min.
    8. Fração 2: Transferir intestinais peças para um tubo cónico de 50 mL contendo 10 mL de PBS, agitar vigorosamente durante 20 s e em seguida despeje em um prato de Petri de 100mm. Verifica a fração sob o microscópio. Normalmente, nesta fase, uma cultura mista de vilosidades e criptas estão presentes (Figura 2A).
    9. Transferência de peças intestinais volta para 30 mM EDTA em PBS e incubar por um mais 5 min. Durante esta incubação, pelota fração 2 em um tubo cônico de 15 mL (revestido com FBS) a 300 x g por 5 min. Retire o sobrenadante do frações 1 e 2 sem perturbar o sedimento e proceder de imediato à fixação (etapa 3).
    10. Fração 3 (isolamento de cripta): transferir as peças intestinais em 10 mL de PBS em tubo de 50 mL, agitar durante 20 s e despeje em um prato de Petri de 100mm. Verifica a fração sob o microscópio. Nesta fase, a fração irá conter predominantemente de criptas (Figura 2B).
    11. Fração 4: Transferi as peças intestinais em 10 mL de PBS, agitar durante 20 s e despeje em um prato de Petri de 100mm. Verifica a fração sob o microscópio. Nesta fase, apenas criptas devem estar presentes.
    12. Fração 5: Transferi as peças intestinais em 10 mL de PBS, agitar durante 20 s e despeje em um prato de Petri de 100mm. Verifica a fração sob o microscópio. Normalmente, nesta fase, muito poucas criptas são extraídas. Se mais de algumas criptas são extraídas, continue com uma fração deth 6.
      Nota: Se uma população de cripta puro é desejada (por exemplo, para a geração de organoides), use um coador de célula 70 µm para remover qualquer vilosidades intactas da fracção cripta-enriquecido.
    13. Colete frações 3-5 em separado 15ml cónico tubos e centrifugar 300 x g por 5 min.
    14. Verificar as pelotas de frações 3 - 5 e remover os sobrenadantes sem perturbar as pelotas e proceder de imediato à fixação (secção 3).

2.Isolamento de Organoids Intestinal do porão Matrix cúpulas em placas de 24 poços

Nota: A formação de organoids dentro de cúpulas de matriz de porão tem sido descrito em outro lugar12.

  1. Revestimento de poços com cúpula de matriz porão de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Lavagem de poços contendo cúpulas de matriz cave com 500 µ l de PBS.
  3. Adicionar frio 250 μL de solução de recuperação de célula (4 ° C) para cada poço (ver Tabela de materiais).
    Nota: A solução de recuperação de cela fria vai depolymerize microtúbulos todos, mas estáveis.
  4. Raspar as cúpulas de matriz de porão usando uma micropipeta P1000 e cuidadosamente Pipetar acima e para baixo ao longo do poço para separação e remover a matriz de porão de plástico.
  5. Recolha o sobrenadante em tubos de microcentrifuga de ligação baixa 1,5 mL.
  6. Inverter o tubo de ligação baixa 1,5 mL várias vezes e verificar sob o microscópio, se o organoids têm sido isolados e estão livres mover-se e não em grupos. Segure o tubo sob um estereomicroscópio e vista sob magnificação de baixo (50 X).
  7. O organoids de pelotas por centrifugação a 1.000 x g durante 5 min à RT
  8. Remover o reagente de recuperação e proceder de imediato à fixação (etapa 3).

3. fixação do tecido Intestinal isolado e Organoids

  1. Fixação de metanol
    1. Resuspenda a fração isolada cripta/vilosidades intestinais em 10 mL e organoids em 1 mL de metanol a-20 ° C.
    2. Incubar as criptas/vilosidades/organoids a-20 ° C em um congelador por 15 min e inverter os tubos a cada 5 min.
    3. Granule as criptas/vilosidades/organoids por centrifugação a 1.000 x g durante 5 min.
    4. Remover o metanol e adicionar a solução de lavagem (1 mL para organoids e 10 mL para frações isoladas cripta/vilosidades). A solução de lavagem pode também consistir em PBS com 1% de soro ou PBS com 0.1% de detergente e 1% de soro.
      Nota: Use soro da mesma espécie que a de anticorpos secundários. Por exemplo, se os anticorpos secundários foram gerados no bode use soro de cabra.
    5. Centrifugar imediatamente, as criptas/vilosidades/organoids a 1.000 x g por 5 min granular.
    6. Remover a solução de lavagem e ressuspender as criptas/vilosidades/organoids na solução de lavagem fresca.
    7. Coloque em um rotador do tubo com a velocidade de 20 rpm. Lave as células para um total de 1 h, granulação as criptas/vilosidades/organoids por centrifugação (1.000 x g por 5 min) a cada 15 min e substituindo a solução de lavagem.
      Nota: Se não houver um rotador tubo então inverta os tubos manualmente cada 5min para Ressuspender as culturas isoladas.
  2. Fixação de formaldeído/metanol
    Nota: Lidar com o fixador e formaldeído em uma coifa.
    1. Resuspenda as criptas/vilosidades isoladas em 10 mL ou organoids em 1 mL de solução de fixador de-20 ° C (9,2 mL de metanol com 800 µ l de solução de formaldeído).
    2. Corrigir as criptas/vilosidades/organoids a-20 ° C em um congelador por 15 min e inverter o tubo a cada 5 min.
    3. Granule as criptas/vilosidades/organoids por centrifugação a 1.000 x g durante 5 min.
    4. Remover o formaldeído/metanol e adicionar a solução de lavagem (1 mL para organoids ou 10 mL para frações isoladas criptas/vilosidades). A solução de lavagem pode também consistir em PBS com 1% de soro de cabra ou PBS com 0.1% de detergente e 1% de soro.
    5. Centrifugar a 1.000 x g por 5 min para as criptas/vilosidades/organoids de Pelotas.
    6. Remover a solução de lavagem e Resuspenda em solução de lavagem fresca.
    7. Coloque em um rotador do tubo com a velocidade de 20 rpm. Lave as células para um total de 1 h, granulação as criptas/vilosidades/organoids por centrifugação (1.000 x g por 5 min) a cada 15 min e substituindo a solução de lavagem.
  3. Fixação de PFA
    Atenção: Soluções e PFA em pó devem ser tratadas em uma coifa.
    Nota: Na maioria dos casos 4% PFA em PBS é usado, mas dependendo da preservação da antigenicidade de anticorpo, concentrações menores podem ser utilizadas.
    1. Resuspenda as criptas/vilosidades peletizadas isoladas em 10 mL 4% PFA e incubar a RT por 1h, e o isolado peletizado organoids em 1 mL 4% PFA e incube por 30 min. Em ambos os casos, inverta os tubos a cada 10 min.
    2. Granule as criptas/vilosidades/organoids por centrifugação a 1.000 x g durante 5 min.
    3. Remover o PFA e adicionar a solução de lavagem (1 mL para organoids e 10 mL de criptas/vilosidades isoladas). A solução de lavagem consiste em PBS com 0.1% de detergente e 1% de soro.
    4. Centrifugar a 1.000 x g por 5 min para criptas/vilosidades/organoids de Pelotas.
    5. Remover a solução de lavagem e Resuspenda em solução de lavagem fresca.
    6. Coloque em um rotador do tubo com velocidade de 20 rpm. Lave as células para um total de 1 h, granulação as criptas/vilosidades/organoids por centrifugação (1.000 x g por 5 min) a cada 15 min e substituindo a solução de lavagem.
      Nota: Se um rotador de tubo não está disponível então inverta os tubos manualmente cada 5min para Ressuspender as culturas isoladas.
    7. Recuperação do antígeno (etapa opcional recomendada para fixação de PFA)
      1. As criptas/vilosidades/organoids de pelotas por centrifugação a 1.000 x g durante 5 min e retirar o sobrenadante.
      2. Adicionar 1-10 mL de pH de citrato de sódio de 10 mM 6.0 (pré aquecido a 80 ° C) e incube a 80 ° C por 20 min.
      3. As criptas/vilosidades/organoids de pelotas por centrifugação a 1.000 x g durante 5 min e retirar o sobrenadante.
      4. Adicionar 1-10 mL de pH de citrato de sódio fresco 10 mM 6.0 (pré aquecido a 80 ° C) e incubar a RT por 20 min.
      5. As criptas/vilosidades/organoids de pelotas por centrifugação a 1.000 x g durante 5 min e retirar o sobrenadante.
      6. Lavar em 1-10 mL de solução Isotónica com 1% de soro e repetir uma ainda mais 3 vezes granulação as criptas/vilosidades/organoids por centrifugação (1.000 x g por 5 min) antes de adicionar a solução de lavagem fresca.

4. bloqueio de passo

  1. Fazer a solução de bloqueio: adicionar 10% de soro de espécies anticorpo secundário em PBS (opcional: Adicionar 0,1% de detergente).
  2. As criptas/vilosidades/organoids de pelotas por centrifugação (1.000 x g por 5 min) e remover o sobrenadante.
  3. Adicionar 5-10 mL da solução de bloqueio, dependendo do número de amostras necessárias (ver nota abaixo). Nesta fase, dividi a criptas/vilosidades/organoids solução em tubos individuais (tubos de microcentrifuga de ligação baixa 1,5 mL com cada tubo contendo 0,2 - 1 mL) para a coloração com os anticorpos diferentes.
    Nota: A cada fração de criptas isolado/vilosidades dar-se-á entre 5-10 amostras que podem ser usadas para diferentes combinações de rotulagem dependendo do tamanho da pelota. Idealmente, um tamanho da pelota entre 2 a 4 mm é necessário para cada amostra.
Diferentes frações podem ser combinadas nesta fase como criptas e vilosidades podem ser facilmente identificados (Figura 2).
  • Incube em solução no RT em rotacao tubo para 1 h de bloqueio.

    • 5. incubação do anticorpo primário

    1. Dilua os anticorpos primários (ver Tabela de materiais) em PBS contendo 10% de soro e 0,1% de detergente. Entre 100 a 200 µ l solução de anticorpo primário é necessária pela amostra de tubo de microcentrifugadora.
    2. Remova a solução de bloqueio por centrifugação (1.000 x g por 5 min).
    3. Resuspenda o pellet de criptas/vilosidades/organoides na solução de anticorpo primário e incubar a 4 ° C durante a noite, usando um rotador de tubo (20 RPM) para manter as criptas/vilosidades/organoids em suspensão.
    4. No dia seguinte: trazer as amostras para RT por 1h no rotor tubo (20 rpm).
    5. A amostra de pelotas por centrifugação (1.000 x g por 5 min) e remover a solução de anticorpo primário.
    6. Adicionar 1 mL de solução de lavagem e ressuspender as pelotas da cripta/vilosidades/organoides.
    7. Remova imediatamente a solução por centrifugação (1.000 x g por 5 min).
    8. Adicionar 1 mL de solução de lavagem fresca e girar as células em rotacao tubo (20 rpm) durante 2 horas. Altere a solução de lavagem por centrifugação a cada 30 min como na etapa 5.7.

    6. incubação do anticorpo secundário

    1. Dilua os anticorpos secundários (ver Tabela de materiais) em PBS com 10% de soro e 0,1% de detergente. Cerca de 200 µ l de solução anticorpo secundário é necessário pela amostra de tubo de microcentrifugadora.
      Nota: Anticorpos altamente Cruz-absorvida devem ser utilizados para reduzir a reatividade dos anticorpos secundários no rato cripta/vilosidades/organoides.
    2. Centrifugar a 1.000 x g por 5 min para as criptas/vilosidades/organoids de pelotas e ressuspender as pelotas em 200 µ l de solução anticorpo secundário.
    3. Gire os tubos em um rotador de tubo (20 rpm) a RT por 1h.
    4. Centrifugar a 1.000 x g por 5 min para as criptas/vilosidades/organoids de pelotas e remover os sobrenadantes (não associadas a anticorpos secundários).
    5. Resuspenda o pellet em solução de lavagem e centrifugar imediatamente a 1.000 x g por 5 min para as criptas/vilosidades/organoids de Pelotas.
    6. Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 1 mL de solução de lavagem fresca.
    7. Girar em um rotador de tubo (20 rpm) a RT para 1,5 a 2 h, mudando a solução de lavagem a cada 20-30 min conforme descrito anteriormente em etapas 6,3-6,6.

    7. nuclear mancha

    1. Dilua a mancha nuclear na solução de lavagem (conforme o protocolo do fabricante), tais como DAPI ou Hoechst. Por exemplo: solução DAPI (20 mg/mL) é diluído 01:10, 000. A solução pode ser mantida em alíquotas a-20 ° C.
    2. Centrifugar a 1.000 x g por 5 min para as criptas/vilosidades/organoids de pelotas e remover a solução de lavagem.
    3. Resuspenda o pellet em solução corante de contraste nuclear.
    4. Girar em um rotador de tubo (20 rpm) a RT por 10 min.
    5. Centrifugar a 1.000 x g por 5 min para as criptas/vilosidades/organoids de Pelotas, remover a solução nuclear mancha e resuspenda o pellet em solução de lavagem.
    6. Girar em um rotador de tubo (20 rpm) a RT para 30-60 min, alterando a cada 10 min de solução de lavagem.

    8. montagem isolada Organoids, vilosidades e criptas

    1. Centrifugar a 1.000 x g por 5 min para as criptas/vilosidades/organoids de pelotas e remover toda a solução de lavagem.
      Nota: Se o pellet dispersa, centrifugar novamente.
    2. Adicione 2 gotas de difícil configuração montagem mídia com agente antidesgaste ao pellet.
    3. Corte a extremidade de uma micropipeta P200 e cuidadosamente resuspenda o pellet nos meios de montagem. Evite a geração de bolhas.
      Nota: As culturas isoladas organoides são muito pegajosas; Certifique-se de Resuspenda totalmente.
    4. Use a micropipeta para transferir a mistura de criptas/vilosidades/organoids na solução de mídia de montagem e distribuir em uma linha ao longo do centro de uma lâmina de microscópio.
      Nota: A linha não deve ser maior do que o vidro de cobertura que deve ser usada. Verificar usando um estereomicroscópio se as criptas/vilosidades/organoids são bem espalhados no slide e não pisando forte.
    5. Cuidadosamente, coloque um tampa de vidro por cima; Evite a geração de bolhas.
    6. Coloque a lâmina de vidro em um livro slide e guarde no frigorífico durante a noite para os meios de montagem definir antes de análise em um microscópio confocal.
      Nota: Para o anticorpo do mouse mancha no tecido do mouse, use a imunofluorescência comercial kit (veja a Tabela de materiais). Substitua a etapa de bloqueio (secção 4) com um bloco de 10 min com proteína solução bloqueio seguida de uma incubação de 1 h com o reagente de bloqueio que vem com o kit. Em seguida, no passo 5.8 (no meio da lavagem) adicione uma incubação de 1 h com reagente de potenciador de sinal de fluorescência. Em seguida, use reagentes do kit em fluorescente diluente (outros anticorpos secundários também podem ser usados em combinação com este reagente). Como acima, incubar e prosseguir a partir do passo 6 com o resto do protocolo.

    9. fixação e imuno-rotulagem de Organoids dentro da matriz de porão

    Nota: Organoids destinado para fixação e imuno-rotulagem, permanecendo dentro da matriz do porão foram gerados nas cúpulas de matriz cave em cima as lamelas de vidro redonda em uma placa de 24 (uma cúpula por alvéolo). As cúpulas de matriz de porão organoides foram processadas dentro da placa de 24 pela adição e a remoção das várias soluções.

    1. Remover o meio de poços e adicione o fixador; Deixe por 1h.
    2. Retire o fixador e lavagem em PBS contendo 1% de soro e 0,1% detergente para 2 h, mudando a cada 30 min.
    3. Remover a solução de lavagem e bloquear em PBS com 10% de soro e 0,1% de detergente por 1h.
    4. Dilua os anticorpos em PBS com 1% de soro ou PBS com 1% de soro e 0,1% de detergente.
    5. Remover a solução de bloqueio e adicionar o anticorpo primário de 100-200 μL (ver Tabela de materiais) solução para cada poço.
      Nota: é importante retirar toda a solução de bloqueio para não diluir ainda mais anticorpos.
    6. Coloque o prato na geladeira e incubar durante uma noite a 4 ° C
    7. Então deixe em RT por 1-2 h.
    8. Remova a solução de anticorpo e lavagem por 2-3 h, alterando a cada 20 min de solução de lavagem.
    9. Remover toda solução de lavagem e adicionar 100-200 μL anticorpos secundários diluídos (ver Tabela de materiais) em PBS com 1% de soro; Incubar durante 1 h em RT
    10. Remova a solução de anticorpo secundário e lavagem por 2 h, alterando a cada 20 min.
    11. Remover a solução de lavagem e adicionar solução DAPI; Deixe por 10 min em solução-mãe de RT. uso DAPI (20 mg/mL) diluído em 01:10, 000.
    A solução pode ser mantida em alíquotas a-20 ° C.
  • Remova a solução DAPI e lavagem por 40 min, alterando a cada 10 min.
  • Usando a pinça, retire a lamela de vidro com a cúpula de matriz de porão e colocar em um slide com a cúpula de matriz de porão virada para cima; adicionar algumas gotas de mídia de montagem e em seguida, colocar uma lamela de vidro na parte superior.
  • Coloque a lâmina de vidro em um livro de slide e deixe na geladeira durante a noite para os meios de montagem definir.

    • Resultados

    Isolamento do tecido intestinal por imuno-rotulagem
    Os protocolos de isolamento de tecido descrito para cólon e intestino delgado foram otimizados para preservação e imuno-rotulagem de microtúbulos e proteínas associadas, mas não para a viabilidade de células-tronco e geração de organoides (Figura 1 e tabela 1 ). O objetivo foi gerar cripta e facções de vilosidades que eram como limpar (desprovido de muco e outros tecidos) possível, minimizando a exposição a EDTA e frio para preservar a estrutura e evitar a despolimerização dos microtúbulos com soluções de frio gelo, que induzem despolimerização dos microtúbulos todos, mas estáveis. A Figura 2 mostra exemplos de imagens de frações 2 e 3 do tecido intestinal pequeno isolado, com 2 fração contendo uma mistura de vilosidades e criptas (Figura 2A, B), enquanto a fração 3 contém principalmente de criptas (Figura 2 D).

    Fixação e imuno-rotulagem de tecido intestinal isolado
    Imuno-rotulado através de uma série de etapas, incluindo fixação, detergente, bloqueio, anticorpo e lavagem soluções, antes de re-suspender as vilosidades finais/criptas pelota em meios de montagem, e as frações individuais ou combinadas em seguida foram processadas para fixação transferência de slides e cobrindo com as lamelas de vidro. As criptas e vilosidades foram então fotografadas em um microscópio confocal.

    Boa conservação e rotulagem de microtúbulos e actina em vilosidades e criptas foi alcançado pelo seguinte: uma combinação de fixação de formaldeído/metanol a-20 ° C, repetida lavagem em PBS contendo 0,1% de detergente e 1% de soro e bloqueio em PBS com 0,1% soro de detergente e 10%, seguido de incubação overnight a 4 ° C em anticorpos primários e, em seguida, 2 h em anticorpos secundários à temperatura ambiente (Figura 3). Fixação de formaldeído/metanol também trabalhou bem para etiquetar + dicas como o EBs e o CLIP-170 em criptas isoladas e vilosidades (Figura 4). EB3 acumulações no plus-final de microtúbulos (conhecidos como cometas) eram evidentes em criptas (Figura 4A), enquanto associação ao longo da estrutura dos microtúbulos estáveis poderia ser vista em amostras de vilosidades (Figura 4). Localização distinta de CLIP-170 e p150colada (subunidade de DCTN1) foi claramente evidente nas n-MTOCs apicais em vilosidades isoladas (Figura 4B). Fixação com o protocolo de formaldeído/metanol consistentemente não funcionou para localização de 8h30 no tecido intestinal isolado usando nosso Pep3 anticorpo contra rato 8h30. No entanto, fixação de metanol a-20 ° C, seguido pela mesma lavagem e bloquear soluções quanto ao formaldeído/metanol deu muito boa localização das 8h30 dentro criptas isoladas e vilosidades (Figura 5; referência8). Curiosamente, enquanto 8h30 está concentrada nas centrossomas apicais algum acúmulo na base celular era evidente em algumas células dentro criptas isoladas (Figura 5). Se isto é devido a rotulagem específico ou uma consequência de atrasar o procedimento de isolamento fixação (e, portanto, que afetam a preservação) vão precisar de mais investigação. No entanto, seções de criostato metanol-corrigido (-20 ° C) de vilosidades (ver Figura 3bi em8) também revelaram 8h30 na célula base em algumas células, sugerindo que 8h30 também pode associar uma população basal de microtúbulos.

    Fixação e imuno-rotulagem de organoids isoladas de matriz de porão
    Pequenos organoids intestinais foram gerados e crescidos na matriz porão durante três semanas ou mais (figura 6A;6,de referência15). Um frio (4 ° C) solução de recuperação celular foi usada para isolar organoids da matriz de porão. A solução de matriz de porão pescavore com organoids foi transferida para tubos e centrifugada antes da fixação e imuno-rotulagem. Isto produziu preparações muito limpas e permitido bons acessos para o organoids para as várias soluções. As células diferenciadas dentro dos domínios de vilosidades organoides contêm microtúbulos ápico-basal estáveis; Estas rotulado bem na maioria dos casos (Figura 6B, C) e EB1 também pode ser visto ao longo do retículo de microtúbulos (Figura 6E; referência13). No entanto, a solução de recuperação de cela fria pode resultar em despolimerização dos microtúbulos a dinâmica, que ficou evidente em algumas amostras pela falta de EB1 cometas (que se ligam à extremidade mais do crescimento dos microtúbulos) dentro dos domínios da cripta basal (Figura 6F ). Em outras amostras, astrais microtúbulos (dinâmicos) foram preservados (Figura 6). Isolamento de organoides antes da fixação e imuno-rotulagem também trabalhou para proteínas juncionais, 8h30, CLIP-170 e marcadores de célula, tais como mucina para células do cálice e cromogranina A para células enteroendócrina.

    Fixação e imuno-rotulagem de organoids dentro da matriz de porão
    Figura 7     mostra um organoides na fase de cisto (A–C) e na fase inicial de desenvolvimento de cripta (D), fixa em formol/metanol e imuno-rotulado por microtúbulos e 8h30. Preservação de bom microtubule e rotulagem, bem como rotulagem para 8h30 na n-MTOCs apicais eram evidente. Figura 8A, B mostra um domínio cripta dentro de um dia 6 organoides fixo com o protocolo de metanol e rotulado por microtúbulos e EB1. Boa preservação dos microtúbulos e EB1 cometas era evidente, sugerindo que a preservação da dinâmica dos microtúbulos.

    Organoids também foram fixos e imuno-etiquetadas, permanecendo dentro da matriz do porão. As desvantagens deste procedimento podem ser pobre penetração do fixador e captura de anticorpos dentro da matriz do porão (Figura 8B), embora em ambos os casos menos frequentemente quando detergente 0,1% foi incluído no fixador e/ou soluções de lavar. Além disso, 4% PFA fez não preservar a matriz de porão bem mas causou a dissolver, embora este fosse menos assim com 1% PFA.Fixação de metanol, por outro lado, às vezes induzida organoides colapso.

    Rotulagem com alguns anticorpos como contra células estaminais marcador Lgr5 e Paneth célula marcador CD24 provou ser um fracasso com os protocolos PFA, metanol ou formaldeído/metanol de 4%. No entanto, fixar o organoids dentro da matriz do porão com 1% PFA em PBS com 0.1% de detergente na temperatura de quarto deu origem a rotulagem para ambos Lgr5 e CD24 (Figura 9).

    Diagrama do processo de isolamento da cripta do intestino delgado; Lavagem de PBS, tratamento com EDTA, análise de frações.
    Figura 1: isolamento de pequenas vilosidades intestinais e criptas. Diagrama de fluxo das principais etapas na cripta isolamento antes da fixação e imuno-rotulagem e pequenas vilosidades intestinais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Imagens microscópicas de vilosidades e criptas intestinais em experimento de fracionamento; detalhe da estrutura do tecido.
    Figura 2: isolados de vilosidades e criptas do intestino delgado do rato. Imagens de microscópio brightfield de frações intestinais apresentando vilosidades (grandes setas) e criptas (setas pequenas). (A, B) Fração 2 contém uma mistura de vilosidades e criptas, e preservação da morfologia nas vilosidades e cripta é evidente em B. (C, D) Fração 3 mostra o isolamento de criptas e ausência de vilosidades e criptas intactas, incluindo uma cripta bifurcada em C. Escala de barras = 500 μm (A, C); 100 μm (B, D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Diagrama do intestino delgado mostrando vilosidades, diferenciação de criptas e células epiteliais; resultados da microscopia.
    Figura 3: isolado de pequenas vilosidades intestinais e cripta fixa em formaldeído/metanol e imuno-rotulado por microtúbulos e actin. (A) diagrama esquemático do epitélio das vilosidades e cripta com diferentes tipos de células indicado. As destaque caixas indicam as regiões representativas fotografadas em B e C. (B, C) Seções de ópticas confocal até parte das vilosidades (B) e a cripta basal (C) isolados de intestino delgado com 30 mM de EDTA e fixadas em formol/metanol, lavado em PBS contendo 1% cabra soro e 0,1% de detergente, bloqueados em PBS contendo 10% de soro de cabra e 0,1% de detergente e rotulado de microtúbulos com anticorpo antitubulina monoclonal de rato (verde) e de actina com Anticorpos policlonais de anti-β-actina coelho (vermelho). Bem preservado ápico-basal feixes de microtúbulos são evidentes nas células tanto das vilosidades e cripta, e actina pode ser vista concentrada na região apical, enfrentando o lúmen (seta). Escala de barras = 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Microscopia confocal de cripta intestinal e vilosidades com microtúbulos, coloração CLIP-170, EB3 e DAPI.
    Figura 4: Isolado pequena cripta intestinal e vilosidades fixas em formaldeído/metanol e imuno-rotulado por microtúbulos, EB3, p150coladae CLIP-170. Confocal seções óticas da cripta e vilosidades regiões isoladas do intestino com 30 mM de EDTA e fixadas em formol/metanol, lavado em PBS contendo 10% de soro de cabra e 0,1% de detergente, bloqueados em PBS contendo 10% de soro de cabra e 0,1% de detergente, e imuno-rotulados. (A) cripta rotulado com anticorpo policlonal de α-tubulina (vermelho) e anticorpo EB3KT36 monoclonal de rato (verde) e manchado por DNA com DAPI (azul) mostrando os microtúbulos ápico-basal e EB3 cometas. A imagem de canal único invertido mostra claramente EB3 cometas em toda as células basais da cripta sugerindo boa preservação da dinâmica bem como microtubules estáveis. (B) vilosidades células epiteliais rotuladas com anticorpo policlonal CLIP-170 (ver vermelho, também referência16) e mouse monoclonal p150colada localização de co (verde) de anticorpo mostrando apical. Imagens de canal único invertido são mostradas abaixo. (C) as células das vilosidades rotulado com anticorpo policlonal de α-tubulina (vermelho) e anticorpo monoclonal de EB3-KT36 rato (verde) e manchado por DNA com DAPI (azul) mostrando microtúbulos ápico-basal com EB3 ao longo da malha. A associação de treliça EB3 é realçada na imagem ampliada enquanto a imagem invertida único canal sugere tanto EB3 cometas e Associação de treliça. Escala de barras = 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Imagem celular de imunofluorescência, marcadores Ninein/E-caderina/DAPI, análise de localização de proteínas.
    Figura 5: cripta isolada do cólon fixados em metanol, imuno-marcado para 8h30 e E-caderina e manchado com DAPI. Secção de óptica confocal do basal e trânsito-amplificando a região de uma cripta isolada do cólon usando 3 mM EDTA e fixadas em metanol, lavado em PBS contendo soro de cabra de 1% e 0,1% de detergente e bloqueados em PBS contendo 10% cabra soro e 0,1% de detergente. A cripta foi rotulada com Anticorpos policlonais 8h30 de coelho (Pep3, veja também referência8, vermelho) e mouse monoclonal anticorpo E-caderina (verde) e corados com DAPI (azul). A imagem invertida único canal mostra apenas 8h30. A imagem mostra uma cripta bem preservada com E-caderina revelando o contorno das células individuais e 8h30 concentrada-se nas centrossomas apicais. Sugere boa penetração do fixador e anticorpos e preservação da antigenicidade. Barra de escala = 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Diagrama de desenvolvimento de organoides; as imagens de microscopia mostram estágios de crescimento, coloração de B-catenina e estruturas.
    Figura 6: organoides desenvolvimento, fixação e imuno-rotulagem de isolaram organoids. (A) fase contraste imagens mostrando diferentes estágios de desenvolvimento de organoides de agregados de células cisto com iniciação de bud e totalmente formada organoids com domínios cripta e vilosidades.(B–F) Confocal seções óticas através de organoids isoladas de matriz de porão usando a solução de recuperação de célula a 4 ° C (10 min), seguido de fixação de formaldeído/metanol, lavagem em PBS contendo 10% de soro de cabra e 0,1% de detergente, bloqueando em PBS contendo 10% cabra soro e 0,1% de detergente e imuno-rotulação de microtúbulos, β-catenina e EB1. (B) Cisto de organoides rotulado por microtúbulos (azuis) e β-catenina (vermelho), revelando a preservação do microtubule bom e rotulagem na maioria das células. (C) distintas ápico-basal microtúbulos são evidentes nestas células epiteliais alargada de um cisto de organoides. (D) dividindo pilhas rotuladas por microtúbulos mostrando eixos incluindo astrais microtúbulos (dinâmicos) (seta). (E, F) Domínio das vilosidades (E) e cripta domínio (F) organoides regiões mostrando alguns EB1 rotulagem ao longo de um retículo dos microtúbulos estáveis, especialmente nas vilosidades, enquanto poucos cometas EB1 são vistos mesmo dentro da cripta basal, sugerindo que essa dinâmica os microtúbulos não foram preservados. Escala de barras = 20 μm (A); 2 μm (D); 5 μm (B, C, E e F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Microscopia de cisto organoide; corado com Ninein, MT, DAPI; desenvolvimento da estrutura do cisto; análise de fluorescência.
    Figura 7: Organoids fixo dentro da matriz do porão em formaldeído/metanol e imuno-rotulado por microtúbulos e 8h30. Confocal optical seções de organoids fixadas em formol/metanol, lavagem e bloquearam em PBS contendo 10% de soro de cabra e 0,1% de detergente e rotulado, permanecendo na matriz do porão. (–C) Cisto de organoides rotulado por microtúbulos (verde) e 8h30 (Pep3; referência8, vermelho) e manchado com DAPI (azul), mostrando a imagem mesclada na e invertido imagens de canal único para os microtúbulos (B) e (C) de 8h30. As imagens mostram microtúbulos ápico-basal e apical 8h30 localização, sugerindo muito boa preservação estrutural os organoides e penetração de anticorpos, bem como a compensação de anticorpos não acoplados. (D, E) Organoides com desenvolvimento cripta fixo e rotulado como acima e novamente apresentando excelente preservação estrutural, rotulagem e limpando de anticorpos. Distintos dos microtúbulos ápico-basal e apical n-MTOC 8h30 localização é evidente e realçado na imagem ampliada (E) da região de box em D. Barras de escala = 10 μm (A-D); 5 μm (E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Diagrama de cripta organoide; microscopia de fluorescência; coloração EB1, MT, DAPI; detalhe estrutural.
    Figura 8: Organoids fixo dentro da matriz do porão em metanol e imuno-rotulado por microtúbulos e EB1. Confocal optical seções de organoids fixadas em metanol, lavagem e bloquearam em PBS contendo soro de cabra de 10% e 0,1% de detergente e rotulado, mantendo-se na matriz do porão. (A) cisto rotulado de domínio de um organoides totalmente desenvolvido com coelho polyclonal α-tubulina (vermelho) e mouse monoclonais anticorpos EB1 (verde), mostrando os microtúbulos ápico-basal, eixos (seta) em duas células de divisórias e distintas EB1 de cometas. Algumas armadilhas de anticorpos de EB1 desacoplados é evidente. No entanto, observa-se boa preservação estrutural e rotulagem dos microtúbulos e EB1. A presença de cometas EB1 sugere que os microtúbulos dinâmicos foram preservados (um, invertido). (B) imagem invertida da região de cisto de organoides mostrando a α-tubulina anticorpo etiquetando com consideráveis anticorpos presos dentro da matriz circundante do porão (seta). Escala de barras = 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Coloração organoide; marcadores CD24, Lgr5; imagem microscópica; análise de diferenciação celular.
    Figura 9: Organoids fixada dentro da matriz do porão em 1% PFA e imuno-rotulada para Lgr5 e CD24. Seções de ópticas confocal de organoids fixo dentro da matriz do porão em 1% PFA em PBS contendo 0,1% de detergente, lavado em PBS com detergente de 0,1% e 1% de soro de cabra e rotulados com anticorpos contra Lgr5 e CD24. (A, B) Nicho de células-tronco dentro de um domínio de cripta mostrando a células de Paneth positivo para CD24 (vermelho). As imagens de contraste confocal e fase foram fundidas na . B mostra o único canal de CD24 rotulagem. (C) região de células-tronco dentro de um domínio de cripta mostrando uma célula-tronco Lrg5 positiva. Barras de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Gráfico do processo de fracionamento celular; cronograma para tratamentos com EDTA, PBS, etapas de centrifugação.
    Tabela 1: cronograma de isolamento pequeno de cripta e vilosidades intestinal e fixação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Discussão

    Isolamento do tecido intestinal
    Isolamento de pequenas criptas intestinais e vilosidades e criptas do cólon envolve expor a superfície da mucosa, o tratamento com solução de EDTA para afrouxar a centrifugação, fracionamento (agitação) e contatos do celular. O protocolo de isolamento apresentado vilosidades intestinais/cripta foi modificado de Belshaw et al e Whitehead et al. 17 , 18

    Expondo a superfície da mucosa
    Nós já experimentou uma série de abordagens para expor a superfície da mucosa do tracto intestinal no desenvolvimento deste procedimento. É uma abordagem clássica para evert (volta de dentro para fora) o tubo, geralmente em segmentos de cerca de 100 mm de comprimento, usar uma haste de metal que é pego em uma dobra do tecido em uma extremidade e, em seguida, o tubo restante deslizou sobre o tubo19. Para o tecido do mouse, uma haste de metal (2,4 mm de diâmetro) com extremidades arredondadas é ideal. Esta abordagem tem a vantagem de expandir a superfície da mucosa, permitindo melhor acesso a PBS e EDTA. Nós inicialmente usado esta abordagem, mas mudou-se para cortar o tubo em comprimentos curtos (cerca de 5 cm) e abertura de cada seção com tesoura de dissecação, como isto revelou-se mais fácil. Esta abordagem é apropriada, se apenas alguns intestinos são necessários; Mas se fossem mais animais para ser usado em um experimento então um dispositivo desenvolvido especificamente para cortar o tubo no sentido longitudinal, como descrito por Yoneda et al 14 seria mais eficiente.

    Destacamento de vilosidades e criptas da camada muscular
    Inicialmente usamos 3 mM EDTA em PBS e tempos de incubação relativamente longo de até 60 min. para soltar a superfície da mucosa do tecido subjacente17,18. Nessa concentração de EDTA, encontramos que um tempo de incubação de 30 minutos foi suficiente para soltar as criptas do cólon de rato. No entanto, para o isolamento de cripta/das vilosidades do intestino delgado, tentámos usando EDTA mais concentrado para um tempo mais curto, o que provou para ser uma abordagem eficiente. Todo o trabalho posterior foi realizado com tecido extraído usando a técnica de 30 mM EDTA gerando fracções relevantes para vilosidades ou criptas. Para criptas, normalmente juntássemos frações 3-5 antes da fixação, mas é importante verificar se estas são as frações apropriadas como os timings vão depender de uma série de fatores tais como a posição ao longo do trato intestinal, idade do rato, a inflamação, a dieta anterior , etc. da mesma forma, o comprimento de tempo que o tecido precisa ser abalada após o tratamento de EDTA para ser eficaz pode variar em diferentes condições. O resultado é frações isoladas de tecido contendo uma mistura de vilosidades e criptas ou principalmente vilosidades ou criptas (Figura 2). Como não há nenhum vilosidades no cólon, a extração de cripta pode ser realizável em uma única etapa agitando o tecido no tubo por 30 s. Estas frações podem ser fixadas e processadas para imuno-rotulagem.

    Isolamento de organoids intestinal de matriz de porão
    Isolamento de organoids de porão cúpulas de matriz pode ser conseguido usando solução de recuperação celular. A solução funciona por depolymerizing a matriz de porão gelificada, mas a temperatura deve ser de 2-8 ° C. Uma nota de cautela é que microtúbulos dinâmicos não podem ser preservados. Assim, por imuno-rotulagem dos microtubules dinâmicos e + dicas de como a célula de EBs, recuperação de matrix porão antes da fixação não é recomendada. No entanto, a maioria dos microtúbulos nas células de diferenciação organoides é relativamente estável e estes foram preservados (Figura 6). Também funcionou bem para imuno-rotulagem de proteínas centrosomal e juncionais, bem como marcadores de célula.

    Protocolos de fixação
    Formaldeído (acabado de PFA) é um fixador de ação relativamente rápida que forma reversível ligações cruzadas e 4% PFA funciona bem, por exemplo, em microtúbulos imuno-rotulagem e gama-tubulina e coloração filamentos de actina com faloidina. Mais diluir soluções PFA como 1% trabalhado bem para imuno-rotulagem, por exemplo, com o marcador de célula de marcadores Lgr5 e Paneth células estaminais CD24 dentro do nicho de células-tronco da cripta, enquanto altas concentrações de PFA não funcionou.

    A adição de glutaraldeído dá melhor preservação de microtúbulos e a fixação de PHEMO chamada, que consiste de uma mistura de 3,7% PFA, glutaraldeído 0,05% e 0,5% de detergente na PHEMO buffer (tubos de 68 mM, 25mm HEPES, 15mm EGTA e 3 milímetros de MgCl2)2 Dá excelente preservação dos microtúbulos sem comprometer a antigenicidade. Também funciona bem para imuno-rotulagem gama-tubulina, β-catenina e E-caderina e coloração filamentos de actina com faloidina. No entanto, em tecido 3D e organoides culturas, a fixação de PHEMO produzido resultados inconsistentes e, portanto, não foi usada.

    O metanol é um coagulante fixador que dá relativamente boa penetração e tende a preservar a antigenicidade. Fixação com metanol 100% (-20 ° C) introduz um encolhimento, dá a preservação da morfologia moderada e trabalha para os microtúbulos, + dicas e muitos anticorpos centrosomal incluindo 8h30 em culturas de células 2D. No entanto, alguns organoids entrou em colapso quando usando este método de fixação. Além disso, penetração de anticorpos através de toda criptas, vilosidades ou organoids inicialmente era um problema, mas a adição de 0,1% de detergente para a solução de lavagem e lavagem prolongada alcançado resultados melhores.

    Uma combinação de formol e metanol anteriormente tinha sido usada por Rogers et al . 20 a EB1 imuno-rótulo em drosófila. Um protocolo de fixação com base em uma mistura de formol e metanol, portanto, foi desenvolvida para tecido intestinal e organoids com base em 3% formol e 97% de metanol refrigerados a-20 ° C, mas omitindo o carbonato de sódio 5 mM da mistura que foi usado por Rogers et al. 20 além disso, as amostras foram fixadas em freezer a-20 ° C. Isto trabalhou particularmente bem para imuno-etiquetar + dicas, como CLIP-170 e o EBs, mas também se mostrou excelente para fixação e imuno-rotulagem microtúbulos e actina no tecido e 3D organoids. Muito boa preservação estrutural era evidente e antigenicidade foi preservada para várias proteínas do citoesqueleto e associadas, bem como centrosomal proteínas tais como a gama-tubulina e 8h30, apesar de rotulagem para 8h30 trabalhou mais consistentemente com metanol fixação.

    Divulgações

    Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

    Agradecimentos

    Os autores graças a Paul Thomas para assistência e conselhos de microscópio. Este trabalho envolvido aqui foi apoiado pelo BBSRC (conceder n. BB/J009040/1 M.M.M. e TW).

    Materiais

    Lista de materiais utilizados neste artigo
    NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
    Dulbecco' s Fosfato tampolado com solução salina (PBS)SigmaD8537-500MLlavagem e
    solução de recuperação de célulasCorning354253isolado organoides
    lobind tubos de microcentrífugaEppendorf30108116evitar que as células grudem
    0,5 M Solução EDTA, pH 8,0Sigma03690-100ML Isolamento decripta
    70 μ filtro de células mFisher Scientific11517532Isolate criptas de vilosidades
    Triton X-100SigmaT8787detergente
    soro de cabraSigmaG6767agente bloqueador
    Soro Fetal Bovino (FBS)Sigmausado como agente antiaderente
    Paraformaldeído, 4% em PBSAlfa AesarJ61899fixador
    Solução de formaldeído (36.5– 38% em H2O)SigmaF8775usado como fixador
    Metanol 99,9% Grau analíticoFisherM/4000/17usado como fixador
    MaxFluor Mouse on Mouse Kit de Detecção de ImunofluorescênciaMaxvision
    Biosciences    		MF01-Skit de imunofluorescência comercial; para reduzir a marcação não específica
    Rotator SB2 ou SB3Stuartrotador de tubo de microcentrífuga
    Recuperação de antígenode citrato
    HydromountNational DiagnosticsHS-106mountant
    DABCO - 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octanagemSigmaD27802agente anti-desbotamento
    Permanente Carregado Positivo, Pré-Lavado, 90 Graus Bordas do SoloClarezaN/C366slides
    Lamínula de vidro - espessura nº 1, 22 x 50 mmClarityNQS13/2250lamínulas
    MatrigelCorning356231Matriz de porão para cultura de organoides 3D
    Tubos cônicos de 50 mLSarstedt62.547.254para processamento de tecidos/organoides
    Tubos cônicos de 15 mLSarstedt62.554.502para processamento de tecidos/organoides
    Tubos LoBind de 1,5 mLEppendorf30108051para organoides isolados
    Anticorpo monoclonal anti-E-caderinade camundongo BD Biosciences610181anticorpo primário 1:500
    Anticorpo monoclonal anti-tubulina YL1/2 de ratoAbcamab6160anticorpo primário 1:100
    Anticorpo alfa-tubulina de coelhoAbcamab15246anticorpo primário 1:100
    Anticorpo anti-beta-actina de coelhoAbcamab8227anticorpo primário 1:100
    Anticorpo monoclonal de rato anti-p150 ColadoBD Bioscience610473/4anticorpo primário 1:100
    Anticorpo monoclonal de EB3KT36 de ratoAbcamab53360anticorpo primário 1:200
    Monoclonal de camundongo EB1 anticorpoBioscience6105351:200
    Anticorpo anti-Lgr5 de coelhoAbgentAP2745danticorpo primário 1:100
    Dylight anti-rato 488Jackson112545167anticorpo secundário 1:400
    Dylight anti-camundongo 488JacksonST115545166anticorpo secundário 1:400
    Dylight anti-coelho 647Jackson111605144secundário anticorpo 1:400
    PFA de sódio BD

    Referências

    1. Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. H., Simons, K. The subcellular organization of Madin-Darby canine kidney cells during the formation of a polarized epithelium. J Cell Biol. 109 (6 Pt 1), 2817-2832 (1989).
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    3. Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Mackie, J. B., Prescott, A. R., Nathke, I. S. The adenomatous polyposis coli protein unambiguously localizes to microtubule plus ends and is involved in establishing parallel arrays of microtubule bundles in highly polarized epithelial cells. J Cell Biol. 157 (6), 1041-1048 (2002).
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