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Summary

Este protocolo descreve um calor induzida por choque proteína expressão (sistema pDHsp/V5-His/sf9 célula), que pode ser usado para expressar proteínas estranhas ou avaliando a atividade anti-apoptotic de potenciais proteínas estranhas e seus truncado amino ácidos em células de inseto.

Abstract

O sistema de expressão de gene transiente é uma das tecnologias mais importantes para a realização de análise funcional da proteína do baculovirus em vitro sistema de cultura celular. Este sistema foi desenvolvido para os genes expressam estrangeiros sob o controle do promotor baculoviral em plasmídeo de expressão transiente. Além disso, este sistema pode ser aplicado a um ensaio funcional de baculovirus em si ou proteínas estranhas. O sistema de expressão de gene transiente mais amplamente e comercialmente disponível é desenvolvido com base no promotor do gene imediata-início (IE) da Orgyia pseudotsugata multicapsid Membros (OpMNPV). No entanto, observou-se um nível de baixa expressão de genes estrangeiros em células de inseto. Portanto, um sistema de expressão de gene transiente foi construído para melhorar a expressão da proteína. Neste sistema, o plasmídeo recombinante foram construído para conter a sequência alvo sob o controle do promotor Drosophila calor choque 70 (Dhsp70). Este protocolo apresenta a aplicação deste calor baseada em choque pDHsp/V5-His (epítopo V5 com 6 histidina) /Spodoptera frugiperda celular sistema (sf9 celular); Este sistema está disponível não só para a expressão de gene, mas também para avaliar a atividade anti-apoptotic de proteínas de candidato em células de inseto. Além disso, este sistema pode também ser transfected com um plasmídeo recombinante ou transfectadas co dois funcionalmente potencialmente antagônico plasmídeo recombinante em células de inseto. O protocolo demonstra a eficiência deste sistema e fornece um caso prático desta técnica.

Introduction

Dois sistemas de expressão da proteína tem sido comumente usados para a produção de proteínas: sistemas de expressão da proteína de procarionte (sistema de expressão de gene deEscherichia coli ) e sistemas de expressão da proteína eucariota. Um sistema de expressão de proteínas eucariota popular é a expressão de baculovirus vetor sistema (BEVS)¹. Baculoviruses primeiro foram usados como agentes em todo o mundo controle biológico de produtos agrícolas e florestais pragas. Nas últimas décadas, baculoviruses foram desenvolvidas como ferramentas biotecnológicas para vetores da expressão da proteína também. Os genomas de baculoviruses consistem de DNA circular de dupla-hélice e envoltos envelopada². Até à data, mais de setenta e oito baculovirus isolados foram sequenciados³. Baseado em cascata temporal de expressões de gene baculoviral em células de inseto hospedeiro, a transcrição do gene pode ser classificada em quatro cascatas temporais, incluindo imediata-início, início atrasado, atrasado e muito tarde genes⁴.

BEVSs, foram designados para que os promotores de genes muito tarde (ou seja, Poliedro ou p10 promotor) foram usados para conduzir os genes-alvo, enquanto o baculovirus recombinante foi gerado pelo recombination homologous. Expressão de proteínas extrangeiras em células de inseto pelo baculovirus recombinante é similar de proteínas de mamíferos em modificações borne-translational (adequadas para a produção de glicoproteína). Assim, o baculovirus tem sido amplamente utilizado^5,6,7. No entanto, uma limitação é a presença de diferentes percursos de N-glicosilação em células de inseto⁷.

Portanto, um novo sistema de expressão de baculovirus, o sistema de expressão de gene transiente, foi desenvolvido. Este sistema expressa genes estrangeiros sob a unidade de baculoviral imediata-primeiros promotores (promotorou seja,-1 ) em células de inseto. Usando este sistema, a proteína do alvo pode ser imediatamente expressa sob o controle do promotor ou seja-1 ao modificar o caminho de N-glicosilação em células de inseto, resultando em melhor oligossacarídeos N-ligados⁷. Além disso, baculoviral imediata-primeiros genes são trascritos pela RNA polimerase II a pilha de anfitrião e não requerem qualquer fator viral para ativação⁴. Portanto, proteínas estranhas podem ser expressa em células de inseto dentro de um curto período de tempo. Até à data, o transitório, sistema de expressão de gene é uma das tecnologias mais importantes para a realização de ensaios funcionais da proteína do baculovirus em vitro sistema de cultura celular. O sistema pode ser aplicado para analisar a função de baculovirus ou proteínas estranhas. Um dos sistemas de expressão de gene transiente comercialmente disponível é baseado nos promotores de gene início imediato (IE) de medicamentos multicapsid de Orgyia pseudotsugata (OpMNPV) (promotores de OpIE2 e OpIE1).

No entanto, o menor nível de expressão de genes estrangeiros em células de inseto ainda era um problema quando o sistema de expressão de gene transiente baseado no promotor OpIE foi usado^8,9,10. Assim, um outro sistema de expressão de gene transiente foi construído com base no promotor da drosófila calor choque proteína 70 (hsp70) gene^8,9. O promotor da hsp70 funciona mais eficientemente do que o promotor baculoviral IE quando induzida por choque térmico em células de inseto¹⁰. Neste sistema, os genes-alvo foram expressos sob a unidade de Drosophila 70 (Dhsp70) promotor de calor choque. Genes estrangeiros podem ser facilmente clonados em plasmídeo de expressão do gene transitória por métodos de clonagem baseados em PCR. Além disso, o controle de sincronismo para a expressão do gene pode ser executado por indução de choque do calor.

Neste relatório, vamos seguir a abordagem e expressar três truncamentos diferentes do gene baculoviral (inibidor da apoptose 3, iap3 de mariposa Ksýlina MNPV) usando o sistema de expressão de proteína transiente baseada em choque de calor e aplicam-se ainda mais estas proteínas expressas na análise da atividade anti-apoptotic. Este sistema também pode expressar proteínas estranhas rapidamente ou ainda ser aplicado para a avaliação da atividade anti-apoptotic de proteína nas células sf9, tendo também o potencial para ser aplicado a outros ensaios de atividade da proteína.

Protocol

1. preparações Cultura de células de inseto Prepare-se 50 mL de meio de cultura celular. Para fazer isso, adicione 500 µ l de antibióticos (Anfotericina B = 0,25 µ g/mL, penicilina = 100 unidades/mL, estreptomicina = 100 µ g/mL) e 5 mL de soro de bovino fetal inactivadas pelo calor em meio de cultura celular isento de soro (sem FBS ou antibióticos).Nota: Aquece o soro bovino fetal a 65 ° C por 30 min em um banho de água antes da utilização. Manter a Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Arctiidae), células de inseto sf9. Desanexar ca. 80% das células do frasco de cultura 25cm2 célula agitando o balão e verificar sob microscopia de luz. Em seguida, transferir 50% de suspensão de célula para um frasco de cultura celular de2 novos 25 cm e permitir que as células anexar durante 15 minutos à temperatura ambiente. Substituir o meio com 5 mL meio de cultura de células frescas e crescer em uma incubadora a 28 ° C. Células de passagem cada 2 a 3 dias dependendo do crescimento da célula. Elaboração de plasmídeos de transfecção celular Inserir os fragmentos de DNA alvo (por exemplo, a mariposa Ksýlina MNPV (LyxyMNPV) iap3 gene e suas construções de exclusão) em pDHsp/V5-His baseados em PCR clonagem método11. Verifique o crescimento de colônias transformados pela colônia PCR usando PCR Master Mix (2 X) e o primer pDhsp-F2/Op-IE2R definido. Confirme as sequências de plasmídeo pelo serviço comercial de sequenciamento.Nota: A tabela 1 lista os primers utilizados para PCR e as construções de correspondentes. Os colônias bacterianas sequenciados único de cultura, que contêm as construções acima do plasmídeo (etapa 1.2) em 200 mL LB médio contendo selecionado antibióticos (50 µ g/mL), respectivamente. Extrai os plasmídeos do culto Escherichia coli usando o Kit de plasmídeo de Midi de acordo com instruções12 a fabricante. Prepare o chapeamento médio misturando 1,5 mL de meio de cultura celular e 8,5 mL de meio de cultura celular livre de soro. Preparar o meio de cultura celular de actinomicina D (ActD) adicionando 1,5 µ l de estoque ActD (1 mg/mL) em 10 mL de meio de cultura celular (concentração final = 150 ng/mL). Loja a 4 ° C. 2. expressão transitória da proteína Célula de semeadura Colher as células sf9 agitando o frasco de cultura, derrubar e cair a suspensão de eritrócitos ao tubo de 50 mL e pipeta, transferir 10 µ l de hemocytometer uma P10. Conte o número de células em um microscópio de luz. Placa de 3 × 105 sf9 células em cada poço em uma placa de 24 para 15 min à temperatura ambiente. Substitua o médio 0,5 mL do chapeamento médio. Transfection de plasmídeos Reagente de Transfeccao de célula diluído: diluir 8 µ l de reagente de Transfeccao de célula em 100 µ l meio de cultura celular isento de soro e misture vortexing por 1 s. Adicionar 2 µ g do ADN do plasmídeo (pDHsp70-Ac-P35/V5-His ou pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His ou pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His ou pDHsp70-Ly-IAP3-anel/V5-His) em 100 µ l de meio de cultura celular isento de soro e misture vortexing para 1 s (Figura 2). Combinar o Plasmídeo diluídos e reagente de Transfeccao de célula diluído (210 µ l) e misture num Vortex durante 1 s. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente. Adicione uma pipeta P1000 210 µ l de mistura de reagente de Transfeccao de DNA gota a gota sobre as células. Incube a 28 ° C por 5h. Substitua o meio de chapeamento com 0,5 mL de meio de cultura celular usando uma pipeta P1000. Selo da placa de 24 com fita e incube as celulas a 28 ° C, durante 16 h. As células transfectadas de choque do calor: colocar a placa em um banho de água de 42 ° C (flutuando na superfície da água). Aqueça por 30 min e retornar a placa de 24 a 28 ° C a temperatura da incubadora. Deteção da expressão da proteína Após 1h ou choque de calor 5h, lave as células com 0,5 mL de tampão de PBS 1 x brevemente três vezes.Nota: Diluir 10 x tampão PBS para tampão PBS 1x, adicionando 1 mL de tampão PBS de 10 x 9 mL esterilizado ddH2O Lise as células com 40 µ l de 1 x tintura de carregamento SDS pipetando para cima e para baixo.Nota: Dilua 4 x tintura de carregamento SDS pela mistura de 30 µ l de tampão PBS 1x e 10 µ l de tampão de amostra SDS de 4x. As amostras da proteína a 98 ° C por 10 min em um bloco de calor de calor, spin para baixo por 1 min e colocar no gelo para ensaio de Western blot. Western blot-ensaioSiga o procedimento de ensaio de Western blot no Eslami e Lujan13. Executar geles de SDS-PAGE14: um gel submetido a azul de Coomassie coloração (controle de carregamento para verificar que a quantidade de amostras da proteína carregadas em cada bem é igual em quantidade) e o outro sujeito a Western blot ensaio, de acordo com Eslami e Lujan13 . Detectar proteínas da fusão V5-marcados com anticorpos de coelho anti-V5 (5 mg/mL) (diluição 1:5000 no buffer TBST para trabalhar a concentração de 1 µ g/mL) e conjugado de peroxidase (HRP) de anti-coelho IgG-rábano cabra (0,8 mg/mL) (diluição de 1: 10000 em buffer TBST para trabalhar concentração 0,08 µ g/mL).Nota: Ajustar a porcentagem de poliacrilamida para 17,5% quando o peso molecular da proteína a ser < 17 kDa. 3. anti-apoptotic ensaio da atividade Apoptose celular induzida pelo gene: repita o procedimento acima de 2.1 para 2.3. Co transfect 1 µ g de pDHsp/D-rpr/bandeira-His plasmídeo (contendo gene de indutor de apoptose) com 1 µ g de DNA de plasmídeo [pDHsp70/V5-seu vetor (controle negativo), pDHsp70-Ac-P35/V5-His (controle positivo), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His ou pDHsp70-Ly-IAP3-anel/V5-His, respectivamente… Às 5h pós-calor tratamento de choque, conduza o ensaio da viabilidade celular (Figura 2). Apoptose celular induzida por substância química: repita o procedimento acima de 2.1 para 2.3. Na etapa 2.1.2, chapa de 1 x 106 células de sf9 em cada poço em uma placa de 6. Transfect 4 µ g de DNA de plasmídeo [pDHsp70/V5-seu vetor (controle negativo), pDHsp70-Ac-P35/V5-His (controle positivo), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His ou pDHsp70-Ly-IAP3-anel/V5-His, respectivamente… Em choque de pós-calor 5h, tratar sf9 células com 2 mL de meio de cultura celular ActD para 16 h e realizar o ensaio da viabilidade celular (Figura 2).Nota: Volume mínimo para cobrir um poço de placa de 6 é de 1 mL. Execute as acima anti-apoptotic atividade ensaio experiências, incluindo 3.1 e 3.2 no triplica. 4. ensaio da viabilidade celular Lave as células tratadas com a adição de 1 mL de tampão de PBS x 1 por 1 min 3 vezes. Ressuspender as células pipetando 1 mL 1X PBS de tampão contendo 0,04% trypan azul e mancha por 3 min à temperatura ambiente. Transferi a suspensão de células em um microtubo de 1,5 mL.Nota: Dilua a solução de azul de Tripan 0,4% pela mistura de 9 mL de 1X PBS buffer e 1 mL 0,4% azul trypan solução. Transferência de 10 µ l trypan azul manchado de suspensão para o hemocytometer com uma pipeta de P10 e contar as células viáveis intactas sob um microscópio de luz. Análise estatística Calcular os dados gravados e apresentar como os meios ± S.D. para todas as acusações. Analise os dados usando o teste de Student bicaudal t por com o Microsoft Excel. Definir dados estatisticamente significativos como P-valor < 0,05.

Representative Results

O comprimento total e outros dois truncamentos (domínios BIR e anel) de Ly-IAP3 de LyxyMNPV foram overexpressed em células sf9, baseia o calor baseada em choque pDHsp/V5-His /Spodoptera frugiperda celular sistema (sf9 celular). O pDHsp/V5-His contido uma drosófila calor choque proteína promotora, que impulsiona a expressão gênica a jusante a uma temperatura de 42 ° C condição usando celulares fatores transcricionais e a tradução sistema (F…

Discussion

O conceito de sistema de células de pDHsp/V5-His/sf9 baseada em choque de calor foi primeiramente descrito por Clem et al em 1994⁸. Comparação do promotor do gene de baculoviral (IE1) e Drosophila hsp70 mostrou que aquele hsp70 tinha uma eficiência mais elevada em células de mosquito¹⁰. Além disso, devido a indução de choque do calor, o momento da expressão da proteína pode ser controlado precisamente após o tratamento de choqu…

Materials

Antibiotic-Antimycotic, 100X	Gibco	15240-062	for insect cell culture
Certified Foetal Bovine Serum	Bioind	04-001-1A
Sf-900 II SFM	Thermo Fisher	10902096	serum-free cell culture medium
Sf9 cells	ATCC	CRL-1711
25cm2 cell culture flask	Nunc, Thermo Fisher	156340
Inverted light microscopy	WHITED	WHITED WI-400
RBC HIT Competent Cell	Bioman	RH618-J80	Escherichia coli (DH5α)
L.B. Broth (Miller)	Bioman	LBL407
Agar, Bacteriological Grade	Bioman	AGR001
Zeocin	Invitrogen	ant-zn-1	selection antibiotic
PCR Master Mix (2X)	ThermoFisher	K0171
Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free)	Geneaid	PIE25
Actinomycin D	SIGMA	A9415
Corning 50 mL centrifuge tubes	SIGMA	CLS430829-500EA	50 mL tubes
Hemocytometer	Gizmo Supply Co	B-CNT-SLDE-V2
24-Well Multidish	Nunc, Thermo Fisher	142475	24-well plate
Cellfectin II Reagent	Thermo Fisher	10362100	cell transfectin reagent
PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4	Thermo Fisher	AM9624
4×SDS Loading Dye	Bioman	P1001
Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes)	Merck Milipore	IPVH00010	PVDF membranes
Mini Trans-Blot Cell system	BIO-RED	1703930	Blotting device
Ponceau S solution	SIGMA	6226-79-5
Anti-V5	SIGMA	V8137	rabbit anti-V5 antibody
Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP)	Jackson	111-035-003
Tween 20	Merck	817072
6-Well Multidish	Nunc, Thermo Fisher	145380
0.4 % trypan blue solution	AMRESCO	K940-100ML
P10 pipetman	Gilson	F144802
P1000 pipetman	Gilson	F123602
Tape	Symbio	PPS7	24 well tape ( 19 mm×36 M)