Expressão transiente de estrangeiros Genes em células de inseto (sf9) para o ensaio funcional da proteína

O objetivo geral deste sistema de expressão de proteínas induzido por choque térmico é avaliar a atividade antiapoptótica de proteínas em duas proteínas potencialmente antagônicas funcionalmente em células de insetos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre as funções e atividades de proteínas candidatas em biotecnologia e proteômica, como suas atividades antiapoptóticas e interações proteicas. A principal vantagem dessa técnica é que o tempo de expressão gênica é controlado pela indução de choque térmico.

Portanto, esse método pode fornecer informações sobre o estado funcional da proteína. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como a expressão de proteínas em mamíferos. As células de insetos Spodoptera frugiperda, ou Sf9, usadas neste protocolo são cultivadas em meio de cultura de células em frascos de cultura de células de 25 centímetros quadrados a 28 graus Celsius.

Agitar o balão de cultura de células para separar as células do balão. Em seguida, verifique em um microscópio de luz para certificar-se de que cerca de 80% das células estão destacadas. Transfira 50% da suspensão celular para um novo frasco de cultura de células de 25 centímetros quadrados e deixe as células se fixarem à temperatura ambiente por 15 minutos.

Após 15 minutos, substitua o meio por cinco mililitros de meio de cultura fresco e cresça em uma incubadora a 28 graus Celsius. Dependendo do crescimento celular, passe as células a cada dois ou três dias. Antes de colher as células Sf9, é importante verificar as células ao microscópio óptico para garantir que não haja contaminação por bactérias ou outros microrganismos.

Para colher as células Sf9, agite o frasco de cultura para separar as células e, em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros. Usando uma pipeta P10, transfira 10 microlitros da suspensão celular para um hemacitômetro e conte o número de células ao microscópio óptico. Coloque três vezes 10 até a quinta células em cada poço de uma placa de 24 poços e deixe em temperatura ambiente por 15 minutos.

Após 15 minutos, substitua o meio por 0,5 mililitros de meio de revestimento. Prepare o regente de transfecção celular. Para cada transfecção, dilua oito microlitros de reagente de transfecção celular com 100 microlitros de meio de cultura celular sem soro e vortex por um segundo para misturar.

Neste estudo, três truncamentos diferentes do gene baculoviral, inibidor da apoptose 3, ou IAP3, serão expressos sob o controle do promotor de choque térmico 70 de Drosophila, o IAP3 de comprimento total, um truncamento sem o domínio RING e um truncamento sem o domínio BIR. Adicione dois microgramas de cada DNA de plasmídeo em 100 microlitros de meio de cultura de células sem soro e misture por vórtice por um segundo. Prepare um controle positivo também.

Combine o DNA plasmídico diluído e o reagente de transfecção de células diluídas e misture por vórtice. Incube em temperatura ambiente por 30 minutos. Usando uma pipeta P1000, adicione 210 microlitros de cada mistura de reagente de transfecção de DNA gota a gota nas células.

Incube a 28 graus Celsius por cinco horas. Após cinco horas, substitua o meio de revestimento por 0,5 mililitros de meio de cultura de células e, em seguida, sele a placa de 24 poços com fita adesiva. Incubar a 28 graus.

No dia seguinte, choque térmico para induzir a expressão da proteína flutuando a placa em banho-maria a 42 graus Celsius por 30 minutos. Após 30 minutos, retorne a placa de 24 poços para a incubadora de 28 graus Celsius. A expressão da proteína é posteriormente confirmada por Western blot, conforme descrito no protocolo de texto.

Para examinar a apoptose celular induzida por genes, primeiro prepare as células Sf9 conforme demonstrado anteriormente. Em seguida, transfecte as células da mesma maneira que antes, mas inclua um micrograma de um plasmídeo contendo um gene indutor de apoptose em cada reação de transfecção. Incube a 28 graus Celsius por cinco horas, substitua o meio e incube por 16 horas.

Choque térmico nas células transfectadas a 42 graus Celsius por 30 minutos. Incube as células a 28 graus Celsius por cinco horas antes de realizar o ensaio de viabilidade celular. Para apoptose celular induzida por produtos químicos, coloque uma vez 10 elevado a seis células Sf9 em cada poço de uma placa de seis poços.

Deixe em temperatura ambiente por 15 minutos e, em seguida, substitua o meio por um mililitro de meio de revestimento. Transfectar as células com quatro microgramas de cada DNA de plasmídeo. Após cinco horas, substitua o meio de plaqueamento por um mililitro de meio de cultura celular e incube as células a 28 graus Celsius por 16 horas.

Em seguida, choque térmico a 42 graus Celsius por 30 minutos. Incube as células a 28 graus Celsius por cinco horas após o choque de calor. Em seguida, trate as células transfectadas com actinomicina D para induzir a apoptose.

Incube a 28 graus Celsius por 16 horas antes de realizar o ensaio de viabilidade celular. Comece este procedimento lavando as células tratadas. Remova o meio de cada poço, adicione um mililitro de PBS e deixe por um minuto.

Lave as células três vezes com PBS desta maneira. Ressuspenda as células em cada poço com um mililitro de PBS contendo 04% de azul de tripano e core à temperatura ambiente por três minutos. Transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Transfira 10 microlitros da suspensão de células coradas com azul de tripano para um hemacitômetro e conte as células intactas viáveis sob um microscópio óptico. Por fim, realize a análise estatística conforme descrito no protocolo de texto. O comprimento total e dois truncamentos de IAP3 de Lymantria xylina MNPV foram superexpressos em células Sf9, e Western blot foi realizado em lisados celulares para confirmar a expressão proteica.

A proteína antiapoptótica Ac-P35 foi incluída como controle positivo. Todas as proteínas podem ser detectadas em células transfectadas em uma hora ou cinco horas após o choque térmico, com uma expressão mais alta em cinco horas. Este sistema pode ser adaptado para avaliar a atividade antiapoptótica.

Para a apoptose celular induzida por genes, o indutor de apoptose Drosophila Reaper foi co-transfectado com construções de plasmídeo de gene alvo em células Sf9, que foram posteriormente eletrocutadas por calor para ativar a expressão gênica. Em comparação com o vetor Drosophila Reaper, o controle positivo apresentou alta atividade antiapoptótica, atingindo até 80% da taxa de viabilidade. Os outros construtos mostraram vários efeitos na atividade antiapoptótica.

Para apoptose celular induzida por produtos químicos, apenas uma construção foi transfectada em células Sf9 e a actinomicina D foi adicionada cinco horas após o choque térmico. Em comparação com o controle positivo ou o controle negativo, os outros construtos mostraram vários efeitos sobre a atividade antiapoptótica. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em dois a três dias se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de obedecer às regras de operação da cultura de células em fluxo laminar e verificar o status das células diligentemente. Após esse procedimento, outros métodos, como a co-imunoprecipitação, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se existe alguma interação entre as duas proteínas co-expressas nas células do inseto. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de biotecnologia explorarem as funções das proteínas em animais ou microrganismos.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar esse sistema para expressar proteínas estranhas ou avaliar proteínas potencialmente antagônicas funcionalmente em células de insetos. Não se esqueça de que trabalhar com alguns produtos químicos, como a actinomicina D, pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de luvas, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.