Name: Expressão transiente de estrangeiros Genes em células de inseto (sf9) para o ensaio funcional da proteína (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Aprenda a expressão transiente de genes estrangeiros em células Sf9 para avaliar atividade antiapoptótica de proteínas. Este método controlado por choque térmico permite estudar funções proteicas em biotecnologia.

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Agradecemos o Dr. Jian-Horng Leu do Instituto de biologia marinha, Universidade Nacional de Taiwan oceano para fornecer 3 construções de plasmídeo. Esta pesquisa foi apoiada por Grant 106-2311-B-197-001 - do Ministério da ciência e tecnologia (a maioria).

1. preparações
<ol><li>Cultura de células de inseto<ol>
<li>Prepare-se 50 mL de meio de cultura celular. Para fazer isso, adicione 500 µ l de antibióticos (Anfotericina B = 0,25 µ g/mL, penicilina = 100 unidades/mL, estreptomicina = 100 µ g/mL) e 5 mL de soro de bovino fetal inactivadas pelo calor em meio de cultura celular isento de soro (sem FBS ou antibióticos). Nota: Aquece o soro bovino fetal a 65 ° C por 30 min em um banho de água antes da utilização.</li>
		<li>Manter a Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Arctiidae), células de inseto sf9. Desanexar ca. 80% das células do frasco de cultura 25cm2 célula agitando o balão e verificar sob microscopia de luz. Em seguida, transferir 50% de suspensão de célula para um frasco de cultura celular de2 novos 25 cm e permitir que as células anexar durante 15 minutos à temperatura ambiente. Substituir o meio com 5 mL meio de cultura de células frescas e crescer em uma incubadora a 28 ° C. Células de passagem cada 2 a 3 dias dependendo do crescimento da célula.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elaboração de plasmídeos de transfecção celular<ol>
<li>Inserir os fragmentos de DNA alvo (por exemplo, a mariposa Ksýlina MNPV (LyxyMNPV) iap3 gene e suas construções de exclusão) em pDHsp/V5-His baseados em PCR clonagem método11. Verifique o crescimento de colônias transformados pela colônia PCR usando PCR Master Mix (2 X) e o primer pDhsp-F2/Op-IE2R definido. Confirme as sequências de plasmídeo pelo serviço comercial de sequenciamento. Nota: A tabela 1 lista os primers utilizados para PCR e as construções de correspondentes.</li>
		<li>Os colônias bacterianas sequenciados único de cultura, que contêm as construções acima do plasmídeo (etapa 1.2) em 200 mL LB médio contendo selecionado antibióticos (50 µ g/mL), respectivamente.</li>
		<li>Extrai os plasmídeos do culto Escherichia coli usando o Kit de plasmídeo de Midi de acordo com instruções12 a fabricante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare o chapeamento médio misturando 1,5 mL de meio de cultura celular e 8,5 mL de meio de cultura celular livre de soro.</li>
	<li>Preparar o meio de cultura celular de actinomicina D (ActD) adicionando 1,5 µ l de estoque ActD (1 mg/mL) em 10 mL de meio de cultura celular (concentração final = 150 ng/mL). Loja a 4 ° C.</li>
</ol>2. expressão transitória da proteína
<ol><li>Célula de semeadura<ol>
<li>Colher as células sf9 agitando o frasco de cultura, derrubar e cair a suspensão de eritrócitos ao tubo de 50 mL e pipeta, transferir 10 µ l de hemocytometer uma P10. Conte o número de células em um microscópio de luz.</li>
		<li>Placa de 3 × 105 sf9 células em cada poço em uma placa de 24 para 15 min à temperatura ambiente. Substitua o médio 0,5 mL do chapeamento médio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfection de plasmídeos<ol>
<li>Reagente de Transfeccao de célula diluído: diluir 8 µ l de reagente de Transfeccao de célula em 100 µ l meio de cultura celular isento de soro e misture vortexing por 1 s.</li>
		<li>Adicionar 2 µ g do ADN do plasmídeo (pDHsp70-Ac-P35/V5-His ou pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His ou pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His ou pDHsp70-Ly-IAP3-anel/V5-His) em 100 µ l de meio de cultura celular isento de soro e misture vortexing para 1 s (Figura 2).</li>
		<li>Combinar o Plasmídeo diluídos e reagente de Transfeccao de célula diluído (210 µ l) e misture num Vortex durante 1 s. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Adicione uma pipeta P1000 210 µ l de mistura de reagente de Transfeccao de DNA gota a gota sobre as células. Incube a 28 ° C por 5h.</li>
		<li>Substitua o meio de chapeamento com 0,5 mL de meio de cultura celular usando uma pipeta P1000. Selo da placa de 24 com fita e incube as celulas a 28 ° C, durante 16 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>As células transfectadas de choque do calor: colocar a placa em um banho de água de 42 ° C (flutuando na superfície da água). Aqueça por 30 min e retornar a placa de 24 a 28 ° C a temperatura da incubadora.</li>
	<li>Deteção da expressão da proteína<ol>
<li>Após 1h ou choque de calor 5h, lave as células com 0,5 mL de tampão de PBS 1 x brevemente três vezes. Nota: Diluir 10 x tampão PBS para tampão PBS 1x, adicionando 1 mL de tampão PBS de 10 x 9 mL esterilizado ddH2O</li>
		<li>Lise as células com 40 µ l de 1 x tintura de carregamento SDS pipetando para cima e para baixo. Nota: Dilua 4 x tintura de carregamento SDS pela mistura de 30 µ l de tampão PBS 1x e 10 µ l de tampão de amostra SDS de 4x.</li>
		<li>As amostras da proteína a 98 ° C por 10 min em um bloco de calor de calor, spin para baixo por 1 min e colocar no gelo para ensaio de Western blot.</li>
		<li>Western blot-ensaio Siga o procedimento de ensaio de Western blot no Eslami e Lujan13. Executar geles de SDS-PAGE14: um gel submetido a azul de Coomassie coloração (controle de carregamento para verificar que a quantidade de amostras da proteína carregadas em cada bem é igual em quantidade) e o outro sujeito a Western blot ensaio, de acordo com Eslami e Lujan13 .</li>
		<li>Detectar proteínas da fusão V5-marcados com anticorpos de coelho anti-V5 (5 mg/mL) (diluição 1:5000 no buffer TBST para trabalhar a concentração de 1 µ g/mL) e conjugado de peroxidase (HRP) de anti-coelho IgG-rábano cabra (0,8 mg/mL) (diluição de 1: 10000 em buffer TBST para trabalhar concentração 0,08 µ g/mL). Nota: Ajustar a porcentagem de poliacrilamida para 17,5% quando o peso molecular da proteína a ser < 17 kDa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. anti-apoptotic ensaio da atividade
<ol><li>Apoptose celular induzida pelo gene: repita o procedimento acima de 2.1 para 2.3. Co transfect 1 µ g de pDHsp/D-rpr/bandeira-His plasmídeo (contendo gene de indutor de apoptose) com 1 µ g de DNA de plasmídeo [pDHsp70/V5-seu vetor (controle negativo), pDHsp70-Ac-P35/V5-His (controle positivo), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His ou pDHsp70-Ly-IAP3-anel/V5-His, respectivamente... Às 5h pós-calor tratamento de choque, conduza o ensaio da viabilidade celular (Figura 2).</li>
	<li>Apoptose celular induzida por substância química: repita o procedimento acima de 2.1 para 2.3. Na etapa 2.1.2, chapa de 1 x 106 células de sf9 em cada poço em uma placa de 6. Transfect 4 µ g de DNA de plasmídeo [pDHsp70/V5-seu vetor (controle negativo), pDHsp70-Ac-P35/V5-His (controle positivo), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His ou pDHsp70-Ly-IAP3-anel/V5-His, respectivamente... Em choque de pós-calor 5h, tratar sf9 células com 2 mL de meio de cultura celular ActD para 16 h e realizar o ensaio da viabilidade celular (Figura 2). Nota: Volume mínimo para cobrir um poço de placa de 6 é de 1 mL.</li>
	<li>Execute as acima anti-apoptotic atividade ensaio experiências, incluindo 3.1 e 3.2 no triplica.</li>
</ol>4. ensaio da viabilidade celular
<ol><li>Lave as células tratadas com a adição de 1 mL de tampão de PBS x 1 por 1 min 3 vezes. Ressuspender as células pipetando 1 mL 1X PBS de tampão contendo 0,04% trypan azul e mancha por 3 min à temperatura ambiente. Transferi a suspensão de células em um microtubo de 1,5 mL. Nota: Dilua a solução de azul de Tripan 0,4% pela mistura de 9 mL de 1X PBS buffer e 1 mL 0,4% azul trypan solução.</li>
	<li>Transferência de 10 µ l trypan azul manchado de suspensão para o hemocytometer com uma pipeta de P10 e contar as células viáveis intactas sob um microscópio de luz.</li>
	<li>Análise estatística<ol>
<li>Calcular os dados gravados e apresentar como os meios ± S.D. para todas as acusações.</li>
		<li>Analise os dados usando o teste de Student bicaudal t por com o Microsoft Excel. Definir dados estatisticamente significativos como P-valor < 0,05.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculoviruses+as+gene+expression+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Baculoviruses as gene expression vectors.</a> Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).</li>
<li>Theilmann, D. A., et al. Family Baculoviridae. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTheilmann%2C+DA+%22Virus+Taxonomy%3A+Eighth+Report+of+the+International+Committee+on+Taxonomy+of+Viruses%22">Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses</a>. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Springer Press. New York. 1129-1185 (2005).</li>
<li>Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H. Determination of nucleopolyhedrovirus' taxonomic position. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNai%2C+YS+%22Biological+Control+of+Pest+and+Vector+Insects%22">Biological Control of Pest and Vector Insects</a>. Shields, V. D. C. , InTech Press. Rijeka. 169-200 (2017).</li>
<li>Friesen, P. D. Regulation of baculovirus early gene expression. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFriesen%2C+PD+%22The+Baculoviruses%22">The Baculoviruses</a>. Miller, L. K. , Plenum Press. New York. 141-170 (1997).</li>
<li>Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+human+beta+interferon+in+insect+cells+infected+with+a+baculovirus+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector.</a> Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).</li>
<li>Luckow, V. A., Summers, M. D. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nbt0188-47">Trends in the development of baculovirus expression vectors.</a> Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).</li>
<li>Jarvis, D. L., Finn, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifying+the+insect+cell+N-glycosylation+pathway+with+immediate+early+baculovirus+expression+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors.</a> Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).</li>
<li>Clem, R. J., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+programmed+cell+death+by+the+baculovirus+genes+p35+and+iap%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap.</a> Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).</li>
<li>Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+characterization+of+an+inhibitor+of+apoptosis+protein+%28IAP%29+from+the+tiger+shrimp%2C+Penaeus+monodon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon.</a> Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).</li>
<li>Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+promoters+for+transient+gene+expression+in+cultured+mosquito+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells.</a> Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).</li>
<li>Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s13355-016-0403-x">Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay.</a> Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).</li>
<li>Geneaid™. Geneaid™ Midi Plasmid Kit & Geneaid™ Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Instruction Manual Ver. 05.11.17. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf">http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf</a> (2017).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+Blotting%3A+Sample+Preparation+to+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Western Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), e2359(2010).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , Cambridge, MA. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page">https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page</a> (2017).</li>
<li>Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+reaper-induced+apoptosis+by+interaction+with+inhibitor+of+apoptosis+proteins+%28IAPs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

O conceito de sistema de células de pDHsp/V5-His/sf9 baseada em choque de calor foi primeiramente descrito por Clem et al em 19948. Comparação do promotor do gene de baculoviral (IE1) e Drosophila hsp70 mostrou que aquele hsp70 tinha uma eficiência mais elevada em células de mosquito10. Além disso, devido a indução de choque do calor, o momento da expressão da proteína pode ser controlado precisamente após o tratamento de choque térmico. ...

Dois sistemas de expressão da proteína tem sido comumente usados para a produção de proteínas: sistemas de expressão da proteína de procarionte (sistema de expressão de gene deEscherichia coli ) e sistemas de expressão da proteína eucariota. Um sistema de expressão de proteínas eucariota popular é a expressão de baculovirus vetor sistema (BEVS)1. Baculoviruses primeiro foram usados como agentes em todo o mundo controle biológico de produtos agrícolas e florestais pragas. Nas últimas décadas, baculoviruses foram desenvolvidas como ferramentas biotecnológicas para vetores da expressão da proteína também. Os genomas de baculoviruses consistem de DNA circular de dupla-hélice e envoltos envelopada2. Até à data, mais de setenta e oito baculovirus isolados foram sequenciados3. Baseado em cascata temporal de expressões de gene baculoviral em células de inseto hospedeiro, a transcrição do gene pode ser classificada em quatro cascatas temporais, incluindo imediata-início, início atrasado, atrasado e muito tarde genes4.
BEVSs, foram designados para que os promotores de genes muito tarde (ou seja, Poliedro ou p10 promotor) foram usados para conduzir os genes-alvo, enquanto o baculovirus recombinante foi gerado pelo recombination homologous. Expressão de proteínas extrangeiras em células de inseto pelo baculovirus recombinante é similar de proteínas de mamíferos em modificações borne-translational (adequadas para a produção de glicoproteína). Assim, o baculovirus tem sido amplamente utilizado5,6,7. No entanto, uma limitação é a presença de diferentes percursos de N-glicosilação em células de inseto7.
Portanto, um novo sistema de expressão de baculovirus, o sistema de expressão de gene transiente, foi desenvolvido. Este sistema expressa genes estrangeiros sob a unidade de baculoviral imediata-primeiros promotores (promotorou seja,-1 ) em células de inseto. Usando este sistema, a proteína do alvo pode ser imediatamente expressa sob o controle do promotor ou seja-1 ao modificar o caminho de N-glicosilação em células de inseto, resultando em melhor oligossacarídeos N-ligados7. Além disso, baculoviral imediata-primeiros genes são trascritos pela RNA polimerase II a pilha de anfitrião e não requerem qualquer fator viral para ativação4. Portanto, proteínas estranhas podem ser expressa em células de inseto dentro de um curto período de tempo. Até à data, o transitório, sistema de expressão de gene é uma das tecnologias mais importantes para a realização de ensaios funcionais da proteína do baculovirus em vitro sistema de cultura celular. O sistema pode ser aplicado para analisar a função de baculovirus ou proteínas estranhas. Um dos sistemas de expressão de gene transiente comercialmente disponível é baseado nos promotores de gene início imediato (IE) de medicamentos multicapsid de Orgyia pseudotsugata (OpMNPV) (promotores de OpIE2 e OpIE1).
No entanto, o menor nível de expressão de genes estrangeiros em células de inseto ainda era um problema quando o sistema de expressão de gene transiente baseado no promotor OpIE foi usado8,9,10. Assim, um outro sistema de expressão de gene transiente foi construído com base no promotor da drosófila calor choque proteína 70 (hsp70) gene8,9. O promotor da hsp70 funciona mais eficientemente do que o promotor baculoviral IE quando induzida por choque térmico em células de inseto10. Neste sistema, os genes-alvo foram expressos sob a unidade de Drosophila 70 (Dhsp70) promotor de calor choque. Genes estrangeiros podem ser facilmente clonados em plasmídeo de expressão do gene transitória por métodos de clonagem baseados em PCR. Além disso, o controle de sincronismo para a expressão do gene pode ser executado por indução de choque do calor.
Neste relatório, vamos seguir a abordagem e expressar três truncamentos diferentes do gene baculoviral (inibidor da apoptose 3, iap3 de mariposa Ksýlina MNPV) usando o sistema de expressão de proteína transiente baseada em choque de calor e aplicam-se ainda mais estas proteínas expressas na análise da atividade anti-apoptotic. Este sistema também pode expressar proteínas estranhas rapidamente ou ainda ser aplicado para a avaliação da atividade anti-apoptotic de proteína nas células sf9, tendo também o potencial para ser aplicado a outros ensaios de atividade da proteína.

<table><tbody><tr><td>Antibiótico-Antimicótico, 100X</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>para cultura de células de insetos</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal certificado</td><td>Bioind</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>Thermo Fisher</td><td>10902096</td><td>meio de cultura de células sem soro</td></tr><tr><td>Células Sf9</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>25cm2 frasco de cultura de células</td><td>Nunc, Thermo Fisher</td><td>156340</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia de luz invertida</td><td>WHITED</td><td>WHITED WI-400</td><td></td></tr><tr><td>RBC HIT Célula Competente</td><td>Bioman</td><td>RH618-J80</td><td>Escherichia coli (DH5&alpha;)</td></tr><tr><td>L.B. Caldo (Miller)</td><td>Bioman</td><td>LBL407</td><td></td></tr><tr><td>Ágar, Grau Bacteriológico</td><td>Bioman</td><td>AGR001</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invitrogen</td><td>antibiótico de seleção</td><td>ant-zn-1</td></tr><tr><td>PCR Master Mix (2X)</td><td>ThermoFisher</td><td>K0171</td><td></td></tr><tr><td>Geneaid Midi Plasmid Kit (Livre de Endotoxinas)</td><td>Geneaid</td><td>PIE25</td><td></td></tr><tr><td>Actinomicina D</td><td>SIGMA</td><td>A9415</td><td></td></tr><tr><td>Corning tubos de centrífuga de 50 mL</td><td>SIGMA</td><td>CLS430829-500EA</td><td>tubos de 50 mL</td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Gizmo Supply Co</td><td>B-CNT-SLDE-V2</td><td></td></tr><tr><td>24-Well Multidish</td><td>Nunc, Thermo Fisher</td><td>142475</td><td>placa de 24 poços</td></tr><tr><td>Cellfectin II Reagente</td><td>Thermo Fisher</td><td>10362100</td><td>reagente de transfectina</td></tr><tr><td>de célula PBS-Phosphate-Buffered Solução salina (10X) pH 7.4</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>4&vezes; Corante de carregamento SDS</td><td>Bioman</td><td>P1001</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P (membranas de blotting PVDF)</td><td>Membranas Merck Milipore</td><td>IPVH00010</td><td>PVDF</td></tr><tr><td>Mini sistema celular Trans-Blot</td>, dispositivo <td>de</td><td>blotting</td><td>1703930 BIO-RED</td></tr><tr><td>Solução Ponceau S</td><td>SIGMA</td><td>6226-79-5</td><td></td></tr><tr><td>Anti-V5</td><td>SIGMA</td><td>V8137</td><td>anticorpo</td></tr> <tr><td>anti-V5 de coelhoPeroxidase de rábano IgG-rábano anti-coelho de cabra (HRP)</td> <td>Jackson</td><td>111-035-003</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Merck</td><td>817072</td><td></td></tr><tr><td>6-Well Multidish</td><td>Nunc, Thermo Fisher</td><td>145380</td><td></td></tr><tr><td>0,4% solução de azul de tripano</td><td>AMRESCO</td><td>K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>P10 pipetman</td><td>Gilson</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipetman</td><td>Gilson</td><td></td><td></td>Fita F123602</tr><tr><td></td><td>Symbio</td><td>PPS7</td><td>24 poços (19 mm&vezes; 36 milhões)</td></tr></tbody></table>

expressão transiente de estrangeiros genes em células de inseto (sf9) para o ensaio funcional da proteína

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

O sistema de expressão de gene transiente é uma das tecnologias mais importantes para a realização de análise funcional da proteína do baculovirus em vitro sistema de cultura celular. Este sistema foi desenvolvido para os genes expressam estrangeiros sob o controle do promotor baculoviral em plasmídeo de expressão transiente. Além disso, este sistema pode ser aplicado a um ensaio funcional de baculovirus em si ou proteínas estranhas. O sistema de expressão de gene transiente mais amplamente e comercialmente disponível é desenvolvido com base no promotor do gene imediata-início (IE) da Orgyia pseudotsugata multicapsid Membros (OpMNPV). No entanto, observou-se um nível de baixa expressão de genes estrangeiros em células de inseto. Portanto, um sistema de expressão de gene transiente foi construído para melhorar a expressão da proteína. Neste sistema, o plasmídeo recombinante foram construído para conter a sequência alvo sob o controle do promotor Drosophila calor choque 70 (Dhsp70). Este protocolo apresenta a aplicação deste calor baseada em choque pDHsp/V5-His (epítopo V5 com 6 histidina) /Spodoptera frugiperda celular sistema (sf9 celular); Este sistema está disponível não só para a expressão de gene, mas também para avaliar a atividade anti-apoptotic de proteínas de candidato em células de inseto. Além disso, este sistema pode também ser transfected com um plasmídeo recombinante ou transfectadas co dois funcionalmente potencialmente antagônico plasmídeo recombinante em células de inseto. O protocolo demonstra a eficiência deste sistema e fornece um caso prático desta técnica.

O comprimento total e outros dois truncamentos (domínios BIR e anel) de Ly-IAP3 de LyxyMNPV foram overexpressed em células sf9, baseia o calor baseada em choque pDHsp/V5-His /Spodoptera frugiperda celular sistema (sf9 celular). O pDHsp/V5-His contido uma drosófila calor choque proteína promotora, que impulsiona a expressão gênica a jusante a uma temperatura de 42 ° C condição usando celulares fatores transcricionais e a tradução sistema (Figura 1</st...

Este protocolo descreve um calor induzida por choque proteína expressão (sistema pDHsp/V5-His/sf9 célula), que pode ser usado para expressar proteínas estranhas ou avaliando a atividade anti-apoptotic de potenciais proteínas estranhas e seus truncado amino ácidos em células de inseto.

Expressão transiente de estrangeiros Genes em células de inseto (sf9) para o ensaio funcional da proteína

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

O objetivo geral deste sistema de expressão de proteínas induzido por choque térmico é avaliar a atividade antiapoptótica de proteínas em duas proteínas potencialmente antagônicas funcionalmente em células de insetos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre as funções e atividades de proteínas candidatas em biotecnologia e proteômica, como suas atividades antiapoptóticas e interações proteicas. A principal vantagem dessa técnica é que o tempo de expressão gênica é controlado pela indução de choque térmico.Portanto, esse método pode fornecer informações sobre o estado funcional da proteína. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como a expressão de proteínas em mamíferos. As células de insetos Spodoptera frugiperda, ou Sf9, usadas neste protocolo são cultivadas em meio de cultura de células em frascos de cultura de células de 25 centímetros quadrados a 28 graus Celsius.Agitar o balão de cultura de células para separar as células do balão. Em seguida, verifique em um microscópio de luz para certificar-se de que cerca de 80% das células estão destacadas. Transfira 50% da suspensão celular para um novo frasco de cultura de células de 25 centímetros quadrados e d

transient-expression-foreign-genes-insect-cells-sf9-for-protein

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Métodos para usar os sistemas de alfavírus transdução de expressar repórteres fluorescentes in vitro e em mosquitos adultos são descritos. Esta técnica pode ser adaptada para expressar toda a proteína de interesse em vez de ou em adição a um repórter.

Sistema Alphavirus Transdução: ferramentas para visualização de infecção em mosquitos vetores

Aqui nós descrevemos uma forma de expressar antígenos de superfície do vírus da influenza corretamente dobradas e funcionais decorrentes do novo vírus H7N9 chinês em células de insetos. A técnica pode ser adaptado para expressar ectodomínios de quaisquer proteínas de superfície virais ou celulares.

Expressão da Funcionais recombinante hemaglutinina ea neuraminidase Proteínas do vírus Influenza H7N9 Novel usando a expressão Sistema de Baculovirus

A expressão de proteínas recombinantes por sistemas de mamíferos está se tornando um método atraente para a produção de complexos proteicos para biologia estrutural. Aqui apresentamos um sistema de expressão simples, mas altamente eficiente, usando células de mamíferos cultivadas em suspensão para purificar complexos de proteínas para estudos estruturais.

Expressão de proteínas recombinantes de Biologia Estrutural em HEK 293F Suspensão Cells: Uma abordagem inovadora e acessível

Neste estudo, a expressão de uma proteína recombinante humana alvo em diferentes plataformas de produção foi comparada. Focamos em culturas tradicionais baseadas em fermentadores e em plantas, descrevendo a configuração de cada sistema e destacando, com base nos resultados relatados, os limites e vantagens inerentes a cada plataforma.

Uma análise comparativa de Expressão de proteínas recombinantes em Diferentes biofábricas: bactérias, células de insectos e Sistemas de Plantas

A produção em escala laboratorial de proteínas eucarióticas com modificação pós-traducional apropriada representa uma barreira significativa. Aqui está um protocolo robusto com rápido estabelecimento e retorno para expressão de proteínas usando um sistema de expressão de mamíferos. Este sistema suporta aminoácidos seletivos, marcação seletiva de proteínas e moduladores de moléculas pequenas da composição de glicanos.

High Yield Expressão de proteínas recombinantes humanas com o Transient transfecção de células HEK293 em suspensão

Estudar canais iônicos através de um sistema heterólogo expressar tornou-se uma técnica nuclear em pesquisa biomédica. Neste texto, apresentamos um método eficiente tempo para conseguir uma expressão de canal iónico com força controlada através da realização de transfecção transiente, sob o controlo de um promotor indutível.

Controlável Expressão Ion Canal através de transfecção transiente Induzível

sistemas de expressão em células de insecto Nonlytic são pouco utilizados para a produção, o tráfico celular / localização, e a análise funcional da proteína recombinante. Aqui, nós descrevemos métodos para gerar vectores de express e subsequente expressão da proteína transiente em linhas de células de lepidópteros disponíveis comercialmente. A co-localizao de aquaporinas de Bemisia tabaci com proteínas marcadoras fluorescentes subcelulares também é apresentada.

Expressão transitória e Celular Localização de proteínas recombinantes em células de cultura de insectos

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir casa voar carboxylesterase proteínas em vitro com um sistema de expressão baculovirus mediada por células de inseto e mais tarde funcionalmente caracterizar seus papéis em metabolisante permetrina, desse modo, conferindo piretroide resistência por estudos baseados em células MTT ensaio e in vitro metabólica.

Caracterização funcional de Carboxylesterases em casa resistente a inseticida moscas, Musca Domestica

Aqui, apresentamos os protocolos para utilizando o inseto sistema expressão da proteína celular e baculovirus para produzir grandes quantidades de proteínas vegetais secretada por cristalização de proteínas. Um vetor de expressão de baculovirus foi modificado com GP67 ou inseto hemolin peptídeo sinal planta secreção na expressão de proteínas nas células de inseto.

Modificar vetores de expressão de Baculovirus para produzir secretado proteínas vegetais em células de inseto

O sistema vetorial de expressão baculovírus (BEVS) é uma plataforma robusta para triagem de expressão e produção de metiltransferases de arginina proteica (PRMTs) a serem utilizadas para estudos bioquímicos, biofísicos e estruturais. Quantidades de miligrama de material podem ser produzidas para a maioria dos PRMTs e outras proteínas de interesse que requerem uma plataforma de expressão eucariótica.

Produção de Proteínas PRMT Recombinantes utilizando o Sistema Vetorial de Expressão baculovírus

A transformação germinal bem sucedida no verme do exército de outono, Spodoptera frugiperda,foi alcançada usando mRNA de transposase hiperativo piggyBac.

Transformação germline hiperativa da Transposase mediada pela Transposase no Verme do Exército de Outono, Spodoptera frugiperda

Aprenda a expressão transiente de genes estrangeiros em células Sf9 para avaliar atividade antiapoptótica de proteínas. Este método controlado por choque térmico permite estudar funções proteicas em biotecnologia.

Expressão transiente de estrangeiros Genes em células de inseto (sf9) para o ensaio funcional da proteína

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