Summary
Этот протокол описывает использование модифицированных t-лабиринту для оценки функциональных обучения и памяти в асфиксии сердца индуцированной ишемии головного мозга.
Abstract
Фон: Оценки легкой до умеренных когнитивных нарушений в модели глобальной церебральной ишемии (т.е. инфаркт миокарда) может быть затруднено из-за плохого передвижения после операции. Например крыс, которые проходят хирургических процедур и подвергаются лабиринт Морриса воды может не быть в состоянии плавать, таким образом мочеиспускания эксперимент.
Новый метод: Мы создали изменение поведенческих спонтанное чередование t-лабиринту испытания. Основным преимуществом измененного Протокола t-лабиринту является его относительно простой дизайн, что является достаточно мощным, чтобы оценить функциональное обучение и память после ишемии. Кроме того анализ данных прост и понятен. Мы использовали t-лабиринту для определения дефицита обучения и памяти крыс как в присутствии или отсутствии легкой до умеренной (6 мин), asphyxial инфаркт миокарда (ACA). Крысы имеют естественную склонность для разведки и будет изучать альтернативные оружия в t-лабиринту, тогда как гиппокампа пораженного крыс, как правило, принимают сторону предпочтение, в результате чего снижение спонтанной чередование соотношениях, раскрывая гиппокампа связаны функциональные обучения и памяти в наличие или отсутствие ACA.
Результаты: Академика группы имеют более высокие коэффициенты стороне предпочтения и Нижняя изменения по сравнению с контролем.
Сравнение с существующими метод(ы): Моррис воды и Барнс лабиринт более заметным для оценки функции обучения и памяти. Однако лабиринт Морриса воды более стрессовым, чем другие лабиринтов. Барнс лабиринт широко используется для измерения памяти ссылку (долгосрочные), в то время как ACA-индуцированной нейрокогнитивный дефицит более тесно связаны с рабочей памяти (краткосрочные).
Выводы: Мы разработали простую, но эффективную стратегию разграничить рабочие (краткосрочные) памятью через t-лабиринту в нашей модели глобальной церебральной ишемии (ACA).
Introduction
По данным Американской ассоциации сердца (2017), сердца (CA)-индуцированного смертности происходит каждые четыре минуты и влияет на более чем 400 000 человек в год в Соединенных Штатах1. Это хорошо документированы, что CA может вызвать повреждения нейронов мозга вследствие недостаточно крови перфузии2,3,4. CA-индуцированной мозговой травмы происходит в регионе ишемии чувствительных СА1 гиппокампа5,6,7, затрагивающих нейронов, которые имеют решающее значение для обучения и памяти8,9, 10,,1112. Кроме того Потеря плотности дендритных позвоночника, при ишемическом условиях в гиппокампе (т.е. CA1 нейронов), играет важную роль в пространственной памяти обесценения13,14,15. Из-за этих патологических изменений после CA, поведенческие расстройства, такие как: тревога, депрессия, посттравматического стрессового расстройства и потеря памяти более распространены. Несмотря на достижения в области медицинских технологий (т.е. эффективный амбулаторного обслуживания), которые коррелируют с улучшение выживаемости CA, большая часть нейропротекторной лечения (за исключением гипотермия) не в состоянии улучшить функциональных результатов после CA16 ,17. CA выживших обычно имеют плохое качество жизни и обременены дополнительных медицинских расходов16.
Когнитивной оценки для церебральной ишемии через поведенческие тесты важно определить эффективность обоих наркотиков и в конечном итоге разработать успешные клинические испытания. В 1940 году Эдвард Толман разработан первый судебный процесс поведение для изучения на основе гиппокампа пространственной памяти18. Впоследствии различных лабиринтов (т.е. Моррис воды лабиринт, радиальные лабиринте, T или Y-лабиринт и Барнс лабиринт) были разработаны для оценки гиппокампа пространственного обучения и памяти в крыс19,20,21,22 ,23. Одним из более широко используемых поведенческих теста является Моррис воды лабиринт, который исследует пространственные обучения и памяти в крыса модели24. Однако лабиринт Морриса воды требует крыса плавать и приложить полный двигательной функции и управления. Для экспериментов ишемии как модель asphyxial инфаркт миокарда (ACA, крысы модель CA) для получения жизненно кровяного давления, газов крови и внедрение различных наркотиков необходимы катетеризации бедренной артерии/вен. Так как катетеризации бедренной артерии/вен может ингибировать ноги мобильности рендеринга крыс способность правильно плавать, лабиринт Морриса воды не может быть наиболее подходящим для тестирования когнитивные расстройства под ACA.
Лабиринт Барнс является широко используемым поведенческих тест для изучения пространственного обучения и памяти в грызунов моделей. Барнс лабиринт не требует напряжения полной двигательные функции и контроля и таким образом менее напряженный, чем лабиринт Моррис воды. В прошлом мы проводили эксперименты с использованием Барнс лабиринт для определения, если различия функционального обучения и памяти происходят между управления или обманом против ACA-индуцированной крыс. Данные получены для Барнс лабиринт не имеют резолюции для тестирования когнитивные расстройства, после легкой до умеренной ACA, с тем, что Барнс лабиринт широко используется для измерения ссылку (долгосрочные) памяти25,26, в то время как ACA-индуцированной нейрокогнитивный дефицит более тесно связана с работы (краткосрочные) памяти27,28,,2930 о том, что Барнс лабиринт менее жизнеспособным для оценки функции памяти в нашем ACA модели.
Таким образом, мы разработали изменение t-лабиринту с помощью спонтанное чередование теста для оценки работы (краткосрочные) памяти после ACA. Изменение t-лабиринту спонтанное чередование тест основным преимуществом является его простоте и минимальным стрессом на крысах по сравнению с другими поведенческие тесты с тем, что изменение t-лабиринту не требует предварительного обучения животных, как хорошо как тяжелых вычислительных анализ или суб подпрограмм (то есть, видео изображений крысы), требуемые Моррис воды лабиринт и Барнс лабиринт. Здесь мы покажем, что измененное испытание спонтанное чередование t-лабиринту является простой и еще высокоэффективных поведенческих пробную парадигмы, которая может предложить достаточно резолюции точно определять и оценивать гиппокампа функция заболеваний, которые вызывают краткосрочные потери памяти (т.е. ACA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с руководящими принципами национальных институтов здоровья и утверждены институциональный уход животных и использования Комитетом (LSU медицинских наук Центр-Шривпорт) для использования мужского (крысах Sprague-Dawley 300-350 г, 9-10 недель). Крысы были постились ночь перед операцией ACA.
1. t-лабиринту аппарат проектирование и установка
Примечание: Базовый дизайн t-лабиринту диакон и Роулинз 2006 модель31.
- Дизайн 3D структура лабиринт, используя SketchUp32. Для создания 3D структуры t-лабиринту, постройте начать руку с внешним длина 200 мм, ширина 165 мм и высота 148 мм для вписываются в печати размеры 3D-принтер. Использование пола толщиной 8 мм и толщиной стенки 5,5 мм.
- Печать лабиринт с помощью 3D-принтер (см. таблицу материалов)32. Если 3D-принтер доступен не в лаборатории, используйте другие материалы, такие как дерево, ДВП средней плотности или пластиковый (то есть поливинилхлорид), которые могут быть приобретены из магазинов улучшение дома.
- Из-за ограничения по высоте в области печати, построить стены лабиринта в двух отдельных 3D-печать и объединиться на лабиринт Ассамблеи (т.е., второй высота стены был добавлен в раздел лабиринт, чтобы увеличить высоту 140 мм, для общей стены высотой 280 мм). Каждый отдельный 3D печати база содержит «T», образный механизм блокировки, где один из разделов подключенных к следующему.
- На стыке начать руку с цели оружия создайте раздел 165-мм широкий присоединиться ширины начать руку с этим цели оружия. Построить цель оружия с помощью аналогичного метода дизайн как начало руки; Однако уменьшите ширину руку до 100 мм в дизайн диакон и Rawlins.
- Смотрите Рисунок 1 подробная схема/размеры t-лабиринту.
- Центральный раздел входит в дизайн на стыке начала руку и цели оружия. Расширить этот раздел от задней стенки t-лабиринту и 200 мм в руку начала разделить цели оружия. Этот раздел также продлил высоту лабиринт (рис. 1).
2. asphyxial инфаркт миокарда (ACA)
- Автоклав хирургические инструменты (121 ° C 15 мин) до начала операции. Продезинфицируйте операционный стол на 70% этиловом спирте 15 мин бритья волос животных на сайте хирургии. Применение решения Бетадин кожи поверхности для хирургической операции.
- Анестезии
- Анестезировать крыс с 4% изофлюрановая и 30: 70 смеси O2 и N2O (300 мл/мин O2 и 700 мл/мин N2O) через маску.
- Дать крысы эндотрахеальной интубации для искусственной вентиляции легких (после интубации, крысы были подключены к искусственной вентиляции легких).
- Поддержание анестезии путем снижения изофлюрановая от 4% до 2% с 30: 70 смесь O2 и N2O. Используйте метод Пинч ответ для определения глубины анестезии.
- Нанесите мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом. Также температура тела от грызунов, грелку с анальный зонд как ссылку температуры.
- Эндотрахеальной интубации
- Место крыса в зале индукции. Анестезировать крыс с изофлюрановая и 30: 70 смесь 4% O2 и N2O.
- Удаление крысы из камеры для индукции. Место под наркозом в лежачем положении с крыса лицом к анестезии маски животных.
- Аккуратно переместите язык к левой или правой животного с левый большой палец и указательный палец.
- Скользить по 17-го калибра тупой совет дозирования иглы (93 мм длиной, с 10-градусный угол на кончик иглы) 14-го калибра гибкие внутривенного катетера (49 мм длины). Вставьте иглу дозирования тупой совет 17-го калибра в трахею.
- Осторожно выдвиньте 17-манометра дозирования от трахеи. Подключите концентратор катетер 14-guage к вентилятора. Отрегулируйте громкость вентилятора инсульта 0,67 мл/100 g и частота дыхания 60 вдохов/мин.
- Поддержания головы и тела температуры при 37 ° C в течение всей процедуры, грызунов, грелку с анальный зонд как ссылку температуры.
- Катетеризации бедренной артериальной и венозной
- Бритье волос вблизи паховой области (обе стороны) и применять Бетадин кожи поверхности для хирургической операции.
- Помещены крыса в лежачем положении. Сделать надрез (10 мм) в паховой области с Ножницы хирургические.
- Отделить соединительной ткани, щипцы тупой совет пока не подвергается паховой связки. Используйте зажим для понять паховой связки. Бедренной артерии и Вены находятся под паховой связки.
- Используйте тупой совет щипцы для разделения соединительной ткани до тех пор, пока подвергаются бедренной артерии и Вены.
- Аккуратно отделить бедренного нерва, которая проходит вдоль бедренной артерии через штрафа отзыв щипцами. Тщательно отдельные бедренной артерии и Вены как блок через штрафа отзыв щипцами.
- Используйте корнцанг штрафа отзыв для разделения бедренной артерии от Вены.
- Место 2 шт 5-0 Шелкового шва (один к ноге и другой к телу) в Вену.
- Завязывайте узел свободные на стороне рядом с телом. Используйте зажим и тянуть шва по возможности к противоположной стороны тела.
- Завязывайте узел свободные на стороне вблизи ногу. Держите и потяните швом к ноге через зажим, чтобы позволить Вены, чтобы наполнить кровью.
- Сделайте небольшой надрез в Вену (около 0,1 мм), микро Рассекающий ножницы (под углом 45°). Впитывать любую крови стерилизовать марлей.
- Придаем тупым кончик иглы шприца (заполнены соленой с 20 ед/мл гепарина) PE-50 катетер. Заполните PE-50 катетер с физраствора с 20 ед/мл гепарина. Вырежьте PE-50 катетер с Рассечение ножницами под углом 45° для создания точки или острый конец. Используйте корнцанг тупой совет провести к концу катетера PE-50. Аккуратно вставьте PE-50 катетер в бедренной вены.
- После катетер вводится полностью, медленно администрировать 0,1 мл гепарина/физиологического раствора, чтобы убедиться, что нет утечки. Связать узлы фирмы шовные (сингл узел) для стабилизации катетер PE-50. Держите PE-50 катетер для непрерывного внутривенного (IV) введения различных препаратов.
- Использование 1 мл шприц, связанные с 23 калибровочных Luer заглушка адаптера для администрирования Векурония бромид (0,67 мг/кг, осуществляется каждые 10 мин) через бедренной вены для иммобилизации крыс на протяжении всей процедуры.
- Место 2 шт 5-0 Шелкового шва (один к ноге и другой к телу) под артерии.
- Завязывайте узел свободные на стороне вблизи ногу. Используйте зажим провести и тянуть шва по возможности к ноге.
- Завязывайте узел свободные на стороне рядом с телом. Держите и потяните швом к телу через зажим позволяет артерии для заполнения с кровью.
- Сделайте небольшой надрез в артерии (около 0,1 мм), микро Рассекающий ножницы (под углом 45°).
- Придаем тупым кончик иглы шприца (заполнены соленой с 20 ед/мл гепарина) PE-50 катетер. Заполните PE-50 катетер с физраствора с 20 ед/мл гепарина. Вырежьте PE-50 катетер с Рассечение ножницами на 45-градусный угол для создания точки или острый конец. Используйте корнцанг тупой совет провести к концу катетера PE-50. Используйте корнцанг тупой совет провести к концу катетера PE-50. Аккуратно вставьте PE-50 катетер в бедренной артерии.
- После того, как полностью вставляется катетер, медленно отступать шприца, чтобы убедиться, что то, что катетер функциональной. Связать узлы фирмы шовные (сингл узел) для стабилизации катетер PE-50. Держите PE-50 катетер для непрерывной записи артериальной крови и давление газов.
- Asphyxial процедура сердечной арест (ACA)
- Отрегулируйте физиологические параметры (т.е. по2, ЦУП2, кровяное давление и рН), модулируя ударный объем, O2 и N2O уровни. Используйте нормальных физиологических параметров: pO2: 100 мм рт.ст., ЦУП2: 35-40 мм рт.ст., кровяное давление: 100 мм рт.ст и pH: 7.4.
- Использование 1 мл шприц, связаны с адаптером заглушки Luer 23 калибровочных администрировать Векурония бромид (0,67 мг/кг, и.в.) через бедренной вены и ждать 2 мин убедитесь, что давление на или около 100 мм рт.ст перед выполнением ACA.
- Вызвать апноэ (6 мин), отключение эндотрахеальной трубки (14-guage катетер хаб) от вентилятора. Далее блок эндотрахеальной трубки на 1 мл шприц для обеспечения полной апноэ.
Примечание: Время 6-мин асфиксии определяется как период между отключение вентилятора и начале реанимации. Полная остановка сердца определяется как среднее артериальное давление ниже, чем 10 мм ртутного столба. - В ходе последнего мин апноэ Отрегулируйте частоту дыхания вентилятора 80 вдохов/мин и увеличить O2 -2 Л/мин с 0% N2O. Это действие будет удар из любых оставшихся изофлюрановая или N2O оставшихся в вентиляторе.
- мин, после апноэ, удалите 1 мл шприц с эндотрахеальной трубки. Повторно подключите эндотрахеальной трубки для вентилятора.
- Использование 1 мл шприц, связанные с 23 калибровочных Luer заглушки адаптер для администрирования эпинефрина (0,005 мг/кг, и.в.) через бедренной вены и администрировать компрессии ручной грудной клетки на большой палец, указательный и средний пальцы на грудь животного в легкие круговые движения на x и ось z (200/мин), до возвращения спонтанного циркуляции (среднее артериальное давление ≥ 50 мм рт.ст.)33,34,35.
- Использование другой 1 мл шприц, связанные с 23 калибровочных Luer заглушки адаптер для администрирования бикарбоната натрия (1 мг-экв/кг, и.в.) через бедренной вены сразу же после возвращения в спонтанной циркуляции (50 мм рт.ст и выше)33,34, 35 для облегчения респираторный ацидоз.
- Мера крови газов снова 10 мин после реанимации определить состояние кислотно щелочной (рН после ACA должно быть около 7.35 в 7.40)
- Используйте зажим для зажима бедренной артерии и Вены. Медленно и осторожно удалите артериальные и венозные катетеры, используя пинцет тупой совет. Перевязать бедренной артерии/вен с 5-0 Шелковый шов для предотвращения кровотечения. Закройте кожа хирургической сайта с помощью шелкового шва 3-0. Используйте Прерванный технику наложения шва для сведения к минимуму шансы возобновления рану.
- Подождите, пока крыса дышит сам (обычно 30 минут до 60 мин после реанимации), Отсоедините вентилятор крыса и аккуратно удалить эндотрахеальной трубки.
- Ночь место крыса в инкубаторе ребенка (27 ° C, влажность 50%). Место размягченное пищи (сделано путем замачивания их в воде) и воды в инкубатор ребенка на ночь.
- Передавать отдельные клетки крыс и вернуть животных фонда с регулярной Чоу и воды крысы. T-лабиринту испытания начать через 3 дня после ACA.
3. t-лабиринту
-
Подготовка животных
- За день до операции (Шам или ACA), обработайте каждый Крыса за 5 мин. Никогда не поднять крыс от их клетке (480 мм x 250 мм x 200 мм, пластиковые прозрачные Кейдж) при обработке (рис. 2).
- После обработки крыса, аккуратно забрать крыса его хвост с одной стороны, с другой стороны поддержки его ' ноги. Пусть они прыгать от руки к клетке (высота 100 мм) 5 раз. Разделите каждый Крыса на отдельные клетки, так что они не будут доминировать для пищи и/или борьбы.
- Через три дня после Шам или ACA хирургии (рис. 2), передача крыс с клеткой в комнату тихо и темно, до начала первого запуска. Только включите настольной лампы малой мощности и поместите его в углу кабинета тестирования для поддержания минимальной освещенности. Разрешить крыса адаптации к темноте за 10 мин.
- Выполните все эксперименты во второй половине дня, чтобы избежать каких-либо эффектов суточные вариации на производительность крыс. Не советую оператор на котором крысы получили Шам или ACA хирургии.
-
Спонтанное чередование
- Распространение тонкий слой постельных принадлежностей (~ 10 мм толщиной), чтобы покрыть весь этаж лабиринта. Затем место крысы на начало руку (внизу «T»), которая является отправной точкой каждого запуска и позволить каждому крысы 3 мин исследовать цели правой или левой руки.
- После того, как крыса совершает к конкретной цели руку (все четыре лапы крысы ввели цели руку), блок «T» стыке начала руку и противоположные цели руку (рис. 1), чтобы предотвратить проникновение противоположные цели руку крыса. Оставьте крыса в лабиринте на 30 секунд, а затем забрать крыса и поместить его обратно в его клетке за минимальное время (~ 30 секунд). Затем удалите «T» Джанкшен блока (125 мм X 230 мм X 65 мм, сделанное на 3D принтере) от t-лабиринту.
- Крыса в руку Пуск и повторите 3.2.2. Чередование определяется как: когда крыса входит противоположной рукой по сравнению с предыдущей запуска36. У крыс выполнять 4 работает в день следующим образом:
1st запуска
2-й запуск
перерыв 10-мин
Запуск 3rd
Запуск 4th - Измените постельные принадлежности во время перерыва на 10-мин и между животных, чтобы устранить запах предвзятости. Очистите t-лабиринту с 75% этанола, следуют дистиллированной воды в конце каждого дня экспериментальной.
- Повторите шаги 3.2.1. -3.2.4. за два дня (12 работает в общей сложности) как показано на рисунке 2.
-
Чередование скорость и боковые предпочтение скорость вычислений
- Рассчитать чередование % и % предпочтение стороне, где
L: крысы выберите левую руку
R: крысы выбрать правую руку
Правильный вариант: 2-й запуск отличается от 1st в заданном наборе (каждый набор содержит два запуска)
Неправильный выбор: крысы выбрать той же руке, похож на предыдущего запуска
Пример:
День 1: Л Л / Л Л
День 2: Л Л / Л Р
День 3: R L / L L
Чередование: 2 (правильный выбор) /6 (общая наборов производится) * 100 = 33.33%
Предпочтение стороне: 10 L, предпочтительные стороны /12 (выполнена всего работает) * 100 = 83,33%
- Рассчитать чередование % и % предпочтение стороне, где
-
Послеоперационный уход:
- Дать крысы бупренорфин (0,01 мг/кг IP) каждые 12 ч в течение 2 дней после операции. Наблюдать крыс до 1 часа после остановки сердца.
- Прикрепите крыс на вентилятор и Отопление pad до тех пор, пока он сознание достаточно для поддержания грудной recumbency. Для поддержания температуры тела животных после операции, место крыса в ребенка инкубатор (устанавливается при 27 ° C, влажность 50%).
- Предоставлять смягчил Чоу (сделанные замачивания в воде) животных за первые 24 часа после операции. Если крысы не питьевой воды, администрировать бактериостатическое физраствора (100 мл/кг/день, и.п.) до тех пор, пока животное восстанавливает и это питьевая вода свободно.
- Дать крысы актуальных антибиотик с боли (Бацитрацин и лидокаина мазь) на все раны. Переместите крысы обратно в объекте животных после того, как они полностью восстановиться.
-
Эвтаназия метод
- Использование изофлюрановая 5% и 100% N2O усыпить животных в конце эксперимента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ACA (глобальной церебральной ишемии) главным образом вызывает рабочей памяти (краткосрочные) дефицит28,29. Для оценки функции обучения и памяти после ACA, мы использовали изменение спонтанного чередование тест для оценки работы (краткосрочные) памяти30. Результаты теста спонтанное чередование показывают, что уровень чередование от трех дней подряд в группе ACA (26.19 ± 4,96%) был значительно ниже по сравнению с контрольной группой (62.96 ± 6.07%) (* p0.05) 35 из-за тот факт, что крысы, представляемых ACA разработан стороне уклоном по сравнению с контролем (82.14 ± 4,57% против 62,89 ± 2,86%, * p0.05) (рис. 3a и 3b)35, таким образом представлены с низким уровнем спонтанного чередование. Результаты были высказаны как средства ± S.E.M. данные анализируются с помощью односторонней ANOVA, следуют Турции в пост hoc тест37. p < 0,05 (95% уровень доверия) был рассмотрен статистически значимой.
Рисунок 1. T-лабиринту дизайн.
Т-образный платформы лабиринта (для крыс) был построен с руку начала 600 мм х 165 мм и 400 мм х 100 мм цели оружия на верхние вершины «T». Толщина стен была 5,5 мм x 8 мм (толщина пола). Центральный раздел был на стыке начала руку к цели руку, где этот раздел простиралась от задней стенки t-лабиринту и 100 мм в руку начала деления цели оружия. Пунктирная квадраты представляют собой расположение блока соединения «T», который заблокирован либо руки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Экспериментальный график ACA/Шам хирургии и t-лабиринту.
Перед днем операции ACA крысы были обработаны 4 раза (5 мин/каждый раз, в день 0) для акклиматизации крысы человеческого прикосновения. После операции ACA крысы разрешалось лечить и стабилизации в течение следующих 3 дней. После восстановления крысы исполнил спонтанные чередование тесты для 3 последовательных дней (12 запусков, 4 работает/день). Каждый Крыса выполняет 4 работает в день. Экспериментальный timeline является одинаковым для Шам хирургии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
На рисунке 3. Краткосрочного дефицита памяти после ACA.
Увеличение ставки предпочтение стороне может наблюдаться у крыс, подвергается ACA (). Спонтанное чередование ставка была снижена у крыс с ACA по сравнению с контролем (b). Цифры в скобках указывают животных, используемых для каждой группы. Результаты были высказаны как средства ± S.E.M. * P < 0.05 указывает значительно отличается от управления. Статистический анализ оценивалась по односторонний дисперсионный анализ с Тьюки тест post hoc. Эта цифра была изменена от Lee et al., 201735. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящем исследовании по сравнению с диаконом и Роулинз протокол31были внесены изменения. 3D-принтер использовался для построения t-лабиринту. 3D-печать обеспечивает доступным и экономически эффективные альтернативы коммерциализированной t-лабиринту. Чтобы уменьшить беспокойство крыс во время испытания, t-лабиринту была исполнена в темной комнате с минимальной освещенности. После того, как крыса вошел один из цели оружия, мы мягко заблокирован противоположные руку. Это позволяет избежать возможных стресс для крыс хвост из теста, а также возможные повреждения при одновременном снижении гильотинные дверь. Любого ненужного стресса будет тормозить крыса производительность при последующих запусках. Таким образом мы использовали junction блок «T», как ворота в настоящем исследовании для устранения любых шлифовальных шума от двери пластиковые гильотине во время теста. Этот шаг может значительно уменьшить тревожности крыс во время эксперимента t-лабиринту.
Привыкания является важным шагом для успешных исследований t-лабиринту, так как тревожно крыс не мотивированы, чтобы запустить в лабиринте. Таким образом важно обеспечить что крысы акклиматизироваться к человеческого прикосновения, высота и переход от клетки лабиринта до экспериментов. Тревожно крысы делают скрип или шипящий звук, когда операторы пытаются прикоснуться к ним. Кроме того тревожно, что крысы либо представить с давно замораживания ответы или отказываются работать в лабиринте во время всей t-лабиринту экспериментов. Они обычно проводят большую часть времени, начать руку без изучения лабиринт. Если крыс в лабиринте, нежно коснуться их хвост, и они будут выполняться. Другой возможной причиной является, что крысы получили недостаточное привыкания. Аккуратно положил обратно в клетке крыса и ждать 10 минут для уменьшения их тревоги. Если крыса не удается завершить запустить снова, что крысы исключены из сферы исследования. Если крысы не удается завершить за один проход в 3 мин, положил его обратно в его клетке и подождите 10 минут. Если крысы по-прежнему не удается завершить запуск, крысы должны быть исключены из исследования. Крысы не следует выполнить тест для расширенной продолжительности или частоты или остаться в зале испытания более чем на час, в противном случае они будет прекращен из-за отсутствия новизны.
Предыдущие исследования показали, что 70% крыс exhibit влево или вправо смещения в38,39. Это боковое смещение ухудшает производительность t-лабиринту в крыса39. Таким образом мы определили критерии включения и исключения для крыс в настоящем исследовании. Мы проверили в общей сложности 15 крысы получили ACA хирургии в нашем исследовании t-лабиринту. Средняя чередование в ACA-лечение крыс составляет 29 ± 4%. Так как управления или фиктивный крыс не имеют каких-либо гиппокампа травмы или обучения и памяти дефицита, мы предположили, что контроль или фиктивный крысы должны иметь лучшую производительность t-лабиринту (чередование показатель ≥ 29 ± 4%) по сравнению с ACA-лечение животных. Таким образом управления или фиктивный крыс с чередованием ставка < 29% (общее количество чередование ≤ 1), которые предлагают крысы имеют предпочтение стороне либо удалось узнать в лабиринте должны быть исключены из исследования. Мы применили этот критерий исключения 25 управления крыс. 6 из них (24%), выполняются с высокой стороне предпочтения (85 ± 3%) и низкой спонтанное чередование (ниже, чем на 29%) были исключены из исследования.
T-лабиринту спонтанное чередование эксперимент сильно зависит от крыс естественная тенденция для изучения новизны. Таким образом основным ограничением t-лабиринту спонтанное чередование протокола является, что крыса будет в конечном итоге прекратить работать в лабиринте. На основе нашего прошлого опыта, крыса только готовы работать в лабиринт в течение трех дней подряд. Так как asphyxial сердца главным образом приводит к краткосрочного дефицита памяти, мы можем экстраполировать наши текущие выводы других травм/заболеваний мозга (т.е. болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и транзиторной ишемической атаки) которые также связаны с короткие памяти дефицита.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана на национальных институтов из здравоохранения/Национальный институт от неврологических расстройств и инсульта Грант 1R01NS096225-01A1, Американская ассоциация сердца предоставляет AHA-13SDG1395001413, Ана 17GRNT33660336, Ана 17POST33660174, Луизиана Государственный университет Грант в помощи исследовательский совет, Малкольм Feist сердечно-сосудистых исследований братство и Институт мозга Макнайта Эвелин ф.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer | MakerBot | Replicator | Fifth generation |
| 3D Printer Filament | Hatchbox | PLA, 1.75 mm filament diameter | |
| 200 Proof Pure Ethanol | Koptec | V1005SG | |
| Sani-Chips | PJ Murphy-Forest Products | Size: 8 to 20 mesh; 2.2 cubic foot/package; autoclavable bags | |
| Rat | Charles River Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Vecuronium bromide | Sun Pharmaceutical | 47335-931-40 | 10 mg |
| Epinephrine | Par Pharmaceutical | 42023-103-01 | Adrenalin Chloride Solution 1 mg/mL, 1:1000 |
| Buprenorphine Hydrochloride Injection | Pfizer | 00409-2012-32 | 0.3mg/mL |
| SketchUp | Trimble Inc. | 3D modeling software | |
| VentElite Small Animal Ventilator | Harvard Apparatus | 55-7040 | Animals raging in size from mouse to guinea pig (10g to 1kg) |
| PowerLab 8/35 | Adinstruments | PL3508 | 8 analog input channels – 4 of which can be used in differential mode. |
| Bio Amps | Adinstruments | FE132 | The Bio Amp is a galvanically isolated, high-performance differential bio amplifier optimized for the measurement of a wide variety of biological signals such as ECG, EMG and EEG recordings. |
| Quad Bridge Amp | Adinstruments | FE224 | A four-channel, non-isolated bridge amplifier designed to allow the PowerLab to connect to most DC bridge transducers. |
| LabChart 8 | Adinstruments | ||
| ABL80 FLEX CO-OX blood gas analyzer | Radiometer | pH / p CO2 / p O2 | |
| SURFLO Teflon I.V. Catheter | Terumo | sc-361556 | Only use the flexible thin wall catheter (49-mm long) |
| Pipet/Infusion Needle | Hamilton | 7748-03 | 17-gauge; 93-mm long; 10-degree angle |
| Classic T3 Vaporizer | SurgiVet | VCT302 | Classic T3 Isoflurane Funnel Fill |
| ENVIRO-PURE Charcoal Canister | SurgiVet | 32373B10 | Designed to absorb waste anesthetic gas |
| O2 single flowmeter | SurgiVet | 32375B1 | 0-1000 mL |
| N2O Flowmeter | VetEquip | 401721 | 0-4LPM |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter (Sterile) | Becton Dickinson | 427565 | 23 gauge |
| Micro Forceps | Black and Black surgical | B3FRC-18 RM-8 | 7 1/4" (18 cm), 8mm RH, counterweight w/ guide pin 2mm, platform 6 x .3 mm, curved. |
| Halstead Mosquito Forceps | Roboz | RS-7111 | Curved; 5" Length, 1.3 mm tip diameter, 2.1 mm jaw width |
| Mixter Forceps | Roboz | RS-7291 | 5.25" Curved Extra Delicate, 1.1 mm tips |
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | Straight, Sharp Points; 9 mm Cutting Edge; 0.15 mm Tip Width; 3 1/2" Overall Length |
| Mayo-Stille Scissors | Roboz | RS-6891 | 5.5" Round Curved |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5058 | 45 Deg Dumoxel Tip Size .10 x .06 mm |
| Olsen-Hegar Combination Scissor And Needle Holder | Roboz | RS-7884 | Cross Serration Tip; 5.5" Length |
| Moloney Forceps | Roboz | RS-8254 | Serrated; Slight Curve; 4.5" Length |
References
- Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133, e38-e360 (2016).
- Beuret, P., et al. Cardiac arrest: prognostic factors and outcome at one year. Resuscitation. 25, 171-179 (1993).
- Kim, Y. J., et al. Long-term neurological outcomes in patients after out-of-hospital cardiac arrest. Resuscitation. 101, 1-5 (2016).
- Earnest, M. P., Yarnell, P. R., Merrill, S. L., Knapp, G. L. Long-term survival and neurologic status after resuscitation from out-of-hospital cardiac arrest. Neurology. 30, 1298-1302 (1980).
- Cerchiari, E. L., Safar, P., Klein, E., Cantadore, R., Pinsky, M. Cardiovascular function and neurologic outcome after cardiac arrest in dogs. The cardiovascular post-resuscitation syndrome. Resuscitation. 25, 9-33 (1993).
- Petito, C. K., Feldmann, E., Pulsinelli, W. A., Plum, F. Delayed hippocampal damage in humans following cardiorespiratory arrest. Neurology. 37, 1281-1286 (1987).
- Schmidt-Kastner, R., Freund, T. F.
- Corkin, S. What's new with the amnesic patient H.M.? Nat Rev Neurosci. 3, 153-160 (2002).
- Scoville, W. B., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. 1957. J Neuropsychiatry Clin Neurosci. 12, 103-113 (2000).
- Smith, T. D., Calhoun, M. E., Rapp, P. R. Circuit and morphological specificity of synaptic change in the aged hippocampal formation. Neurobiol Aging. 20, 357-358 (1999).
- Gage, F. H., Dunnett, S. B., Bjorklund, A. Spatial learning and motor deficits in aged rats. Neurobiol Aging. 5, 43-48 (1984).
- Tulving, E., Markowitsch, H. J. Episodic and declarative memory: role of the hippocampus. Hippocampus. 8, 198-204 (1998).
- Neigh, G. N., et al. Cardiac arrest with cardiopulmonary resuscitation reduces dendritic spine density in CA1 pyramidal cells and selectively alters acquisition of spatial memory. Eur J Neurosci. 20, 1865-1872 (2004).
- Volpe, B. T., Davis, H. P., Towle, A., Dunlap, W. P. Loss of hippocampal CA1 pyramidal neurons correlates with memory impairment in rats with ischemic or neurotoxin lesions. Behav Neurosci. 106, 457-464 (1992).
- Astur, R. S., Taylor, L. B., Mamelak, A. N., Philpott, L., Sutherland, R. J. Humans with hippocampus damage display severe spatial memory impairments in a virtual Morris water task. Behav Brain Res. 132, 77-84 (2002).
- Lee, R. H., et al. Fatty acid methyl esters as a potential therapy against cerebral ischemia. OCL. 23, D108 (2016).
- Lee, R. H., et al. Chapter 1. Palmitic acid: occurrence, biochemistry and health effects. Porto, L. F. , Nova Science Publishers, Inc. 1-15 (2014).
- Tolman, E. C., Gleitman, H. Studies in spatial learning; place and response learning under different degrees of motivation. J Exp Psychol. 39, 653-659 (1949).
- Koopmans, G., Blokland, A., van Nieuwenhuijzen, P., Prickaerts, J. Assessment of spatial learning abilities of mice in a new circular maze. Physiol Behav. 79, 683-693 (2003).
- Barnes, C. A. Memory deficits associated with senescence: a neurophysiological and behavioral study in the rat. J Comp Psychol. 93, 74-104 (1979).
- Paul, C. M., Magda, G., Abel, S. Spatial memory: Theoretical basis and comparative review on experimental methods in rodents. Behav Brain Res. 203, 151-164 (2009).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Assessing spatial learning and memory in rodents. ILAR J. 55, 310-332 (2014).
- Sharma, S., Rakoczy, S., Brown-Borg, H.
- Poon, T. P., et al. Spinal cord toxoplasma lesion in AIDS: MR findings. J Comput Assist Tomogr. 16, 817-819 (1992).
- Sunyer, B., Patil, S., Höger, H., Lubec, G. Barnes maze, a useful task to assess spatial reference memory in the mice. Nat Protoc. 390, (2007).
- Shoji, H., Hagihara, H., Takao, K., Hattori, S., Miyakawa, T. T-maze forced alternation and left-right discrimination tasks for assessing working and reference memory in mice. J Vis Exp. , (2012).
- Seeger, T., et al. M2 muscarinic acetylcholine receptor knock-out mice show deficits in behavioral flexibility, working memory, and hippocampal plasticity. J Neurosci. 24, 10117-10127 (2004).
- Olton, D. S., Feustle, W. A. Hippocampal function required for nonspatial working memory. Exp Brain Res. 41, 380-389 (1981).
- Hayashida, K., et al. Hydrogen inhalation during normoxic resuscitation improves neurological outcome in a rat model of cardiac arrest independently of targeted temperature management. Circulation. 130, 2173-2180 (2014).
- Spontaneous alternation behavior. Dember, W. N., Richman, C. L. , (1989).
- Deacon, R. M., Rawlins, J. N. T-maze alternation in the rodent. Nature protocols. 1, 7-12 (2006).
- Wong, K. V., Hernandez, A. A review of additive manufacturing. ISRN Mechanical Engineering. 2012, (2012).
- Lin, H. W., et al. Derangements of post-ischemic cerebral blood flow by protein kinase C delta. Neuroscience. 171, 566-576 (2010).
- Lin, H. W., et al. Fatty acid methyl esters and Solutol HS 15 confer neuroprotection after focal and global cerebral ischemia. Transl Stroke Res. 5, 109-117 (2014).
- Lee, R. H., et al. Interruption of perivascular sympathetic nerves of cerebral arteries offers neuroprotection against ischemia. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 312, H182-H188 (2017).
- Bali, Z. K., et al. Differential effects of alpha7 nicotinic receptor agonist PHA-543613 on spatial memory performance of rats in two distinct pharmacological dementia models. Behav Brain Res. 278, 404-410 (2015).
- McDonald, J. H. Handbook of biological statistics. 2, Sparky House Publishing. Baltimore, MD. (2009).
- Castellano, M. A., Diaz-Palarea, M. D., Rodriguez, M., Barroso, J. Lateralization in male rats and dopaminergic system: evidence of right-side population bias. Physiol Behav. 40, 607-612 (1987).
- Andrade, C., Alwarshetty, M., Sudha, S., Suresh Chandra, J. Effect of innate direction bias on T-maze learning in rats: implications for research. J Neurosci Methods. 110, 31-35 (2001).
