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Artigo de método

Injeção de contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica e entrega de célula em uma grande maquete pré-clínicos

11K vistas

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DOI:

10.3791/56699

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21 de janeiro de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Cardiovascular and Metabolic Research, School of Biological Sciences, University of Reading, 2Departamento de Medicina y Cirugía Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia, 3Institute of Virology and Immunology (IVI), 4Departamento de Anatomía y Anatomía Comparada, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia, 5Unidad de Trasplante Hematopoyético y Terapia Celular, Departamento de Hematología, Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca, IMIB, Universidad de Murcia

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Novas estratégias terapêuticas na medicina regenerativa cardíaca exigem extensos e detalhados estudos em modelos animais pré-clínicos grandes antes que eles podem ser considerados para uso em seres humanos. Aqui, vamos demonstrar uma técnica de injeção contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica em coelhos, que é valioso para a eficácia de tais terapias romance de testes de hipóteses.

Resumo

Terapia celular e gene são emocionantes e reduziram de promissoras para efeitos de regeneração cardíaca no cenário de insuficiência cardíaca com fração de ejeção (HFrEF). Antes que possam ser considerados para uso e implementados nos seres humanos, estudos pré-clínicos extensivos são necessárias em grandes modelos animais para avaliar a segurança, eficácia e destino do injectate (por exemplo, as células-tronco), uma vez entregado para o miocárdio. Pequenos roedores modelos oferecem vantagens (por exemplo, custo-eficácia, acessibilidade para manipulação genética); no entanto, tendo em conta as limitações inerentes destes modelos, estas conclusões raramente traduzem para a clínica. Por outro lado, grandes modelos animais como coelhos, têm vantagens (por exemplo, eletrofisiologia cardíaca semelhante em relação aos seres humanos e outros animais de grandes porte), mantendo um bom equilíbrio de custo-benefício. Aqui, demonstramos como executar uma técnica de injeção (IMI) contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica, que é minimamente invasiva, segura, bem tolerada e muito eficaz na entrega alvo de injectates, incluindo as células, em vários locais dentro do miocárdio de um modelo de coelho. Para a execução desta técnica, podemos também aproveitaram de um sistema de ecocardiografia clínica amplamente disponível. Depois de colocar em prática o protocolo descrito aqui, um pesquisador com conhecimento básico de ultra-som irá tornar-se competente no desempenho desta técnica minimamente invasiva e versátil para uso rotineiro em experiências, destinadas a testes de hipóteses do capacidades de terapêuticas regenerativas cardíaca no modelo de coelho. Uma vez que a competência é alcançada, todo o processo pode ser realizado em 25 min depois anestesiando o coelho.

Introdução

Terapias celulares e gene são emocionantes e sempre desenvolvendo estratégias para a regeneração/reparação de miocárdio lesionado em HFrEF. Alguns estudos compararam a eficácia (por exemplo, taxa de retenção de célula) com as diferentes rotas de entrega de celular, que têm consistentemente demonstrado a superioridade do IMI sobre rotas Intracoronário ou intravenosa1,2 , 3 , 4 , 5. assim, não é surpreendente que uma grande proporção de estudos sobre modelos translacionais de terapia com células estaminais do miocárdio lesionado, entregar o injectate através do IMI realizada sob visão direta em um peito aberto procedimento6,7 . No entanto, esta abordagem tem várias limitações, incluindo a natureza invasiva do procedimento, que acarreta o risco de mortalidade peri-processuais (muitas vezes sob-relatado)8. Além disso, um IMI sob visão direta não elimina a possibilidade de injeção inadvertida na cavidade ventricular. Na prática clínica um IMI durante a cirurgia de peito aberto pode ser um método apropriado para a entrega de célula terapêutico, por exemplo, durante a artéria coronária ignorar a cirurgia de enxerto (CABG); no entanto, esta abordagem pode não ser apropriada para a entrega de célula na cardiomiopatia global de origem não-isquêmica (por exemplo, HFrEF secundária à cardiomiopatia induzida pelo regime (AICM)).

Não há dúvida que doença isquêmica do coração (IHD) é a causa mais comum de HFrEF (~ 66%)9,10; no entanto, cardiomiopatia não-isquêmica, incluindo AICM, ainda afeta uma proporção significativa de pacientes com HFrEF (33%)9 . Com efeito, os avanços recentes em oncologia clínica resultaram em mais de 10 milhões de sobreviventes de câncer em os EUA sozinhos11, com estimativas de um número similar na Europa, consistente com uma tendência geral para a sobrevivência melhorada de pacientes com câncer12 ,13. Assim, explorando os benefícios da novela terapias tais como transplante de células estaminais para cardiomiopatia não-isquêmica, bem como a testagem de uma rota eficaz e minimamente invasiva de células-tronco de entrega é de extrema importância, dado o número crescente de pacientes afetados por cardiotoxicidade secundária a drogas anticâncer.

Digno de nota, estudos utilizando a terapia de células-tronco, com o objetivo de reparação/regenerar o miocárdio lesionado frequentemente de testes de hipóteses envolve o uso de pequenos roedores (por exemplo, ratos e ratazanas). Estes modelos, muitas vezes, exigem sistemas de ultra-som caro de alta frequência para avaliação da função miocárdica, geralmente equipada com transdutores de matriz linear que tem algumas limitações inerentes de associado (por exemplo, reverberação)14. No entanto, outros modelos tais como coelhos, representando uma grande maquete pré-clínicos, possuem algumas vantagens para testar a hipótese de terapias de células-tronco em HFrEF. Assim, em contraste com ratos e camundongos, coelhos mantêm um sistema de transporte do Ca+ 2 e Eletrofisiologia celular que se assemelha ao de seres humanos e outros animais de grande porte (por exemplo, cães e porcos)15,16,17 ,18,19. Outra vantagem, é a sua acessibilidade para ultrassom cardíaco de imagem usando relativamente barato e sistemas amplamente disponível ecocardiografia clínica equipados com transdutores array fase relativamente alta frequência, por exemplo, 12 MHz, tais como aqueles usados frequentemente em Cardiologia Pediátrica e neonatal. Estes sistemas permitem excelente imagem ecocardiográfica com tecnologia de ponta, e eles se aproveitam da superioridade da harmônica de imagem20. Além disso, testes de hipóteses extensa do potencial de terapias regenerativas cardíacas (por exemplo, terapia de células-tronco), sua segurança, eficácia, cardiomyogenic potencial, bem como avaliação do destino do injectate uma vez entregaram para o miocárdio, é obrigatório antes de eles podem ser considerados para uso humano, e eles exigem o uso de modelos animais pré-clínicos grandes, tais como o coelho17,19. Aqui, descrevemos uma técnica minimamente invasiva para a entrega do celular através do IMI de contraste-ecocardiografia percutânea guiada usando um sistema de ecocardiografia clínica, que se destina na terapia baseada em transplante de células-tronco para cardiomiopatia não-isquêmica20 . Descrevemos também os benefícios da tinta nanquim (InI, também conhecida como tinta de China) como um traçador ultra-som de agente e em situ de contraste da injectate no centro de coelho.

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Protocolo

Os experimentos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê de ética pesquisa da Universidade de Múrcia, Espanha e foram realizados em conformidade com a Directiva 2010/63/UE da Comissão Europeia. As etapas descritas foram realizadas sob protocolos operacionais padrão que faziam parte do plano de trabalho e não tem sido realizados exclusivamente com o propósito de filmar o vídeo que acompanha este livro.

1. preparação de células e o vetor de expressão dos mamíferos

Nota: Aqui, vamos descrever brevemente um protocolo para a preparação e a transfeccao de uma linha de celular (rim embrionário humano 293 (HEK-293)); no entanto, protocolos específicos de célula apropriada para o tipo de célula de interesse devem ser otimizada (por exemplo, as células-tronco).

  1. Manter as células HEK-293 em alta glicose Dulbecco modificada do meio da águia (DMEM) suplementado com soro fetal bezerro de 10% (FCS), piruvato de sódio 1%, 2 mM de glutamina e 1% penicilina/estreptomicina e incubadas a 37 ° C numa atmosfera contendo 5% umidificada CO2 . Uma vez que as células são sub confluentes, dividido na proporção de 1:3.
  2. Começar a dividir as células aspirando a mídia, em seguida, lave uma vez com fosfato estéril tampão salino (PBS), retire o excesso PBS e então incubar com 2,5 mL de 0.5 x ácido tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (5 min, a 37 ° C).
    1. Adicionar um volume de mídia DMEM (completada conforme descrito acima) para parar a reação e então separar as células aspirando lentamente e delicadamente acima e para baixo com uma pipeta eletrônica.
  3. Em seguida, transferi a suspensão de células para um recipiente apropriado (por exemplo, tubo de centrifuga conico de 15-50 mL). Centrifugue em um balde de balanço (100 x g), desprezar o sobrenadante e lavar o sedimento duas vezes com PBS estéril.
  4. Resuspenda o pellet em mídia DMEM fresca e sementes em uma densidade de célula apropriada (por exemplo, 1 x 106 células em balão2 75 cm) em frascos de cultura fresco ou pratos grandes, de acordo com as práticas de laboratório local.
    1. Substitua a mídia existente com mídia fresca cada 2 dias.
      Nota: O vetor de expressão foi derivado de pIRES1hyg e usado de acordo com as instruções do fabricante, como descrito anteriormente,21. p(EGFP) IRES1hyg foi gerado pelo subcloning do cDNA EGFP como um BamHI + NotI inserir do pEGFP-N1 para o BamHI + NotI digerido pIRES1hyg21.
  5. 1 dia antes de transfeccao, semente HEK-293 células em uma densidade de 0,5 x 105 células/cm2 em placas de cultura de tecidos de 24 ou 12 --bem.
  6. No dia do transfection, prepare-se complexos de reagente de transfeccao lipídios-DNA em tubos de microcentrifuga separadas 1,5 mL (1 tubo/poço).
    1. Comece adicionando 250 µ l de meio de soro reduzida em cada tubo, e em seguida, adicione 4 µ g de DNA (misture suavemente).
    2. Posteriormente, adicionar 250 µ l de uma mistura previamente preparada de reagente de transfeccao 10 µ l lipídico e 250 µ l de meio de soro reduzida, para cada tubo (misture delicadamente novamente).
    3. Finalmente, proceder com transfections, incubando células HEK-293 com complexos de reagente de Transfeccao de lipídios de DNA por 4 h, então substitua DMEM suplementado como descrito acima (etapa 1.1) e incube por outro 48 h. Executar seleção de drogas de estábulo transfectants com 100 µ g/mL hptII B.
  7. Separe as células HEK-293 com tripsina como descrito acima (etapa 1.2). Depois de lavar as células em PBS estéril, resuspenda em um veículo apropriado (por exemplo, 10% v/v InI em PBS), para obter uma concentração final de célula de 5 x 106/mL.

2. preparação do coelho

Nota: O posicionamento do transdutor e do coelho para IMI não é o ideal para avaliar a morfologia e função do coração do animal. Assim, é aconselhável realizar um exame ecocardiográfico completo20 antes o IMI (veja abaixo) e nos pontos de tempo posterior, conforme definido pelo design experimental. Isto terá como objectivo avaliar as linha de base características anatômicas e funcionais do coração no animal que receberá uma injeção e também avaliar os efeitos, do IMI na função do coração.

  1. Efectuar este exame de forma cega e seguindo as orientações do Comité de ecocardiografia do colégio americano de medicina interna de veterinária e associação americana de sociedade de ecocardiografia/Europeia para Cardiovascular Imaging 22 , 23 , 24.
  2. Obter um rastreamento simultâneo 1-chumbo eletrocardiograma (ECG) ao longo do estudo ecocardiográfico toda.
  3. Anestesiar o coelho com ketamina 10mg/kg, combinado com a medetomidina 200 µ g/kg, injeção intramuscular (IM).
  4. Verifique se o nível da anestesia após 10-20 min após a administração da anestesia.
  5. Usando uma tesoura Retire os cabelos do peito amplamente (por exemplo, abaixo do pescoço à região sub xifoide) (figura 1A).
  6. Raspar as regiões adicionais de 1-2cm2 na face interna do membro direito anterior (região mediocubital) e de ambos os membros posteriores (região mediotibial) (figura 1B).
  7. Coloque o adesivos eletrodos de ECG nas regiões depiladas dos membros de forma síncrona, monitorar o ritmo cardíaco durante o procedimento (Figura 1).
  8. Coloque o animal na posição decúbito supino em uma manta térmica, com os membros estendidos usando fita cirúrgica anexada à tabela (Figura 1).
    1. Certifique-se que as orelhas são flexionadas para trás por trás das costas/cabeça do coelho e em uma posição que é inferior a seus membros dianteiros, pois isso ajuda a manter o correto posicionamento do tórax do animal durante todo o procedimento.
  9. Permitir que o animal de respirar espontaneamente enquanto administrar oxigênio por máscara durante todo o processo (100%, 2-3 L/min).

figure-protocol-1
Figura 1. Preparação do coelho para IMI. (A) cortar o cabelo do tórax; (B) grampo de cabelo de membros; (C) Coloque eléctrodos e posicione o coelho com as pernas estendidas em uma manta térmica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. técnica de contraste percutânea guiada por ecocardiografia IMI no coelho

  1. Limpar e desinfectar a pele do tórax com uma solução à base de clorexidina.
    1. Use uma técnica asséptica durante todo o processo, de acordo com a actual melhor prática.
    2. Sempre que possível e se possível, realizar um procedimento totalmente estéril, incluindo, mas não limitado a, o uso de material estéril como vestidos, luvas, cortinas de ferida cirúrgica, estéril vestir material para a mesa, bem como um ultra-som estéril cobertura do transdutor e o gel de ultra-som estéril. Isto irá reduzir ao mínimo o risco de introdução de patógenos ao animal recebendo IMI e é uma prática comum na prática clínica (por exemplo, durante a punção cardíaca).
      Nota: Recomenda-se sempre proceder em conformidade com os regulamentos locais e nacionais de investigação animal aplicável à instituição local e país de prática.
  2. Aplicar o gel de transmissão do ultra-som no peito e/ou para o transdutor e com o cabo do transdutor em volta do pescoço do experimentador, executar uma verificação de janela rápida do coração do animal, que muitas vezes é útil para visualizar a anatomia e planejar para o IMI.
  3. Coloque o transdutor manualmente no 4th-6th intercostal espaço, 2-3 cm da linha paraesternal direita com um ângulo de incidência de ~ 90 ° em relação ao lado direito da parede torácica (Figura 2A).
  4. Ajuste a localização do transdutor em relação do espaço intercostal, bem como seus ântero-posterior e ângulo dorsoventral para otimizar uma visão do eixo curto modificado ao nível dos músculos papilários. Identifica-se neste ponto de vista do ventrículo direito (RV), ventrículo esquerdo (LV), septo interventricular (IVS), parede posterior (PW), bem como ântero-lateral (AL) e músculos papilar póstero-medial (PM), (Figura 2B).
    1. Tem um amplo campo de visão, aumentando significativamente a profundidade utilizando o controle apropriado no sistema (por exemplo, botão, dial).
    2. Prestar especial atenção à obtenção de uma imagem simétrica nesta vista, bem como a diferenciação adequada de contornos endocárdico e epicárdico e, se necessário, ajuste através de controles de otimização de imagem (por exemplo, ganho).
  5. Uma vez que a visão ecocardiográfica ideal é obtida (Figura 2B), manter esta posição durante o resto do procedimento, enquanto um segundo operador executa o IMI (veja abaixo).
    1. Enquanto segura o transdutor, evite esconder a marca de orientação do transdutor, que deve sempre ser virado para a frente, permitindo assim o seu alinhamento com a agulha em etapas subsequentes (Figura 2A, C).
  6. Com uma agulha 24G ligada a uma seringa de 1 mL, coloca a agulha perto da pele do hemithorax esquerdo em uma posição de espelhamento simétrica em relação ao transdutor. Em seguida, manualmente, alinhe a agulha com a marca de orientação do transdutor em um ângulo de ~ 90° (Figura 2) e avançar lentamente a agulha através da pele e na cavidade do peito.
    Nota: A inserção da agulha percutânea nesta posição e orientação facilita a visualização da agulha no plano do feixe de ultra-som (Figura 2D, E), permitindo o monitoramento em tempo real e, quando necessário, ajuste de a localização da agulha em relação à região alvo do miocárdio (Figura 2, G, H).
  7. Com a ponta do local de destino, lentamente entregar o injectate (até 0,25 mL por injecção) dentro de 10-30 s (Figura 2E), enquanto a lenta e suavemente retracção da agulha durante a injeção para aumentar a extensão do miocárdio tratados.
    1. Use InI 10% (v/v), diluído em PBS para padronização da técnica e como um traçador em situ enquanto adquirindo competência, bem como para confirmar a segmentação bem sucedida de todos os quatro sites IMI dentro do miocárdio por patologia bruta e Histopatologia (ver Resultados do representante). Uma vez que a competência é alcançada, InI poderia ser substituído por um agente de contraste de ultra-som comercial adequado, se desejado.
      Nota: Entrega de 10% (v/v) InI diluída em PBS com ou sem células em resultados de miocárdio em hyperechogenicity transmural (ou seja, a aparência brilhante eco) no local de destino da injeção (Figura 2E, F). Transiente desaceleração ou aceleração da frequência cardíaca, associada com contrações ventriculares prematuras (por exemplo, isolado, parelhas de versos e trigêmeos) frequentemente são observados até mesmo do primeiro contato da agulha com o epicárdio, bem como durante e/ou logo após o IMI. No entanto, sem arritmias fatais são desenvolvidas, e efeitos adversos agudos raramente são observados usando até 0,25 mL (1,25 x 106 células) de injectate por injecção IMI (consulte Representante resultados e discussão).
  8. Realizar mudanças sutis no ângulo de incidência da agulha conforme necessário para completar a injeções de 0,25 mL para cada um dos sites IMI de quatro destino (três na ventricular esquerda livre parede (LVFW) e no IVS).
  9. Depois de concluir o procedimento IMI contraste percutânea guiada por ecocardiografia, avaliar o ritmo cardíaco (por exemplo, através da série ECG rastreamento e/ou 24 h Holter ECG) e realizar exames ecocardiográficos de serial janela para verificar a ausência de complicações, até que o animal está totalmente recuperado da anestesia e só então transferência para um quarto de ciclo de luz.
    1. Aqui, usamos o Holter ECG de 24h para monitorar os efeitos de IMI com InI no ritmo cardíaco durante 24 h. Para isso, comparamos um grupo de 6 coelhos com fenótipo normal (grupo Normal) e um grupo de 6 coelhos que receberam a administração intravenosa de doxorrubicina (uma cardiotóxicos regime droga, comumente usada para o tratamento de câncer; Grupo DOX) na dose de 2 mg/kg/semana por 8 semanas e então as duas coortes recebeu IMI com InI.

figure-protocol-2
Figura 2 . Injeção de contraste percutânea guiada por ecocardiografia Intramiocárdica em coelho. (A) colocação do transdutor no hemithorax direito a um ângulo de ~ 90 °. (B) imagem representativa de uma visão do eixo curto paraesternal (PSSX) do coração ao nível dos músculos papilários no coelho. (C) alinhamento da agulha em um ângulo de ~ 90 ° em relação a marca de orientação do transdutor. (D) localização da agulha no local de destino em uma exibição PSSX do coração (nota que a agulha é facilmente visualizada no plano do feixe de ultra-som). (E e F) demonstração de hyperechogenicity no local de destino mediante injeção Intramiocárdica com tinta nanquim (pontas de seta destacam o hyperechogenicity transmural). (G) localização acidental da agulha na câmara de LV (pontas de seta destacam o eixo da agulha). (H) reposicionamento da agulha para a parede livre de LV (pontas de seta destacam o eixo da agulha). RV = ventrículo direito; LV = ventrículo esquerdo; IVS = septo interventricular; PW = parede posterior; AL = músculo papilar ântero-lateral; PM = músculo papilar póstero-medial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. publicar análises IMI

  1. Realizar análise histopatológica de amostras de tecido do coração de coelhos.
    1. Fixar o tecido para 24h em formol 10%, seguido de desidratação, com o aumento da concentração de etanol como segue:
      • 1 x em 70% (60 min)
      • 1 x em ethanol/5% de 95% de metanol (60 min)
      • 1 x em 100% (60 min)
      • 1 x em 100% (90 min)
      • 1 x em 100% (120 min)
      Nota: Toda a incubação do acima é realizadas à temperatura ambiente (RT). Em seguida, substituir duas vezes com 100% de xileno (1h, RT) e finalmente incorporar em parafina em duas etapas (60 min, 58 ° C)25.
    2. Execute 4-5 µm, cortes de tecido com um micrótomo25. Monte seções em slides.
    3. Execute a coloração com hematoxilina-eosina e2726,25,do métodos corante tricromo de Masson.
  2. Em cortes de tecido do coração transplantada, execute imuno-histoquímica para detectar células HEK-293 de EGFP(+) (por exemplo, usando o método (ABC) complexo avidina-biotina), resumidamente:
    1. Cera de 4-5 µm seções de coração grosso em xilol 100% (10 min, a RT). Reidratar o tecido por lavagem com a diminuição de soluções de concentração de etanol (2 x em 100% (2 min); 2x em 95% (2 min) 1 x em 70% (2 min); 1 x em 50% (2 min); 1 x em 30% (2 min); 1 x ddH2O (2 min)) no RT
    2. Realizar a inibição da peroxidase endógena, cobrindo as seções com 100 µ l de 3% H2O2 diluído em metanol (preparado com 5 mL de solução stock de 30% de H2O2e a adição de metanol acima para um volume total de 50 mL) ( Incubar 30 min, RT) e em seguida lavar por imersão com solução salina tamponada de Tris (TBS; pH 7,6).
    3. Executar o antígeno desmascaramento através de tratamento enzimático, cobrindo as seções com 100 µ l de 0,1% Pronase (preparado com 0,01 g Pronase diluído em 10 mL TBS) (incubar 12 min, RT), em seguida lavar com TBS (5 min, RT).
    4. Incubar em solução (soro de cabra normal a 10% em TBS) de bloqueio usando 100 µ l por deslize (30 min, RT) e lavar com TBS (5 min, RT).
    5. Incube com frango antiproteína verde fluorescente (GFP) como anticorpo primário (1: 500 em TBS) (1 h, 30 ° C) e lavar com TBS (5 min, RT).
    6. Incube com anticorpo secundário biotinilado cabra-antifrango IgG (1: 250 em TBS) (1 h, 30 ° C) e em seguida lavar com TBS (5 min, RT).
    7. Incube com complexo avidina-biotina (20 min, 30 ° C) e então rotular usando tetrahydrochloride 3,30-diaminobenzidina (DAB) (RT, 5-10 min).
    8. Finalmente, desidrata-se por lavagem em aumentar as concentrações de etanol (1 x em 30% (2 min) 1 x em 50% (2 min) 1 x em 70% (2 min); 2 x em 95% (2 min); 2 x em 100% (2 min)) no RT, seções de corante de contraste usando o método de hematoxilina-eosina25e montar slides de capa. Incluem o positivo, negativo, bem como controles de isotipo.
      Nota: O protocolo breve descrito acima não se destina para uso geral imuno-histoquímica; otimização para o tecido de interesse e condições é necessária.

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Resultados

IMI guiada por ecocardiografia com contraste percutânea com InI:

Usando o protocolo descrito acima, e uma vez que o posicionamento ideal da ponta da agulha foi confirmado pela ecocardiografia e iniciada a injeção, transmural hyperechogenicity foi observada durante a entrega do InI (10% v/v na PBS) (Figura 2E) , bem como logo após o IMI para a região de destino (...

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Discussão

O objetivo principal era desenvolver uma técnica minimamente invasiva que pode ser utilizada para a entrega de células-tronco em miocárdio de coelhos (um grande porte pré-clínicos modelo animal)17,18, enquanto aproveitando-se da utilização de um relativamente barato prontamente disponível em muitas clínicas do sistema de imagem e centros de pesquisa. Aqui, mostramos que, usando um sistema de ecocardiografia clínica, e auxiliado por InI, um agente amplamente dispo...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecer Sheila Monfort, Brenda Martínez, Carlos Micó, Alberto Muñoz e Manuel Molina excelente apoio prestado durante a coleta de dados e Carlos Bueno para fornecer as células EGFP(+) HEK-293. Este trabalho foi financiado em parte por: Fundación Séneca, Agencia de Ciencia y Tecnología, região de Múrcia, Espanha (JT) (número de concessão: 11935/PI/09); Vermelho de Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Redes, VI PN de eu + D + I 2008-2011 (conceder n. RD12/0019/0001) (JMM), co-financiado com fundos estruturais da União Europeia (FEDER) (GMC); e, a Universidade de Reading, Grã-Bretanha (AG, GB) (financiamento Central). Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Sistema de ultrassom HD11 XESistema deecocardiografiaPhilips 10670267
S12-4PhilipsB01YgG4-12 MHz transdutor de matriz de
fase Ultrasound Transmision Gel (Aquasone)Parket laboratories IncN 01-08
Vasovet 24GBraunREF 381212  cateter sobre a agulha
Omnifix-F Seringa de 1 mlBraun9161406V
Imalgene (Cetamina)MerialRN 9767É necessária prescrição veterinária
Domtor (Medetomidina)EsteveCN 570686.3É necessária prescrição veterinária
Almofada de aquecimento
Faber-Castel TG1Faber-Castel16 33 99Índia (China) Ink
Holter SyneflashEla SF0003044S médicoECG Holter de 24 horas.
Eletrodos Sensor Azul®Eletrodos de ECG Holter Ambu (NUMED)VLC-00-S.
MicrótomoLeica BiosystemsRM2155
MicroscópioOlimpusCO11
ABC Vector EliteVector LaboratoriesPK-6200Avidin Biotin Complex Kit.
Anticorpo anti-GFP de frangoInvitrogenA10262Anticorpo primário.
Laboratório de vetor de anticorpo IgG de cabra anti-frango biotiniladoBA-9010Anticorpo secundário.
3,30-diaminobenzidina tetracloridrato (DAB)DAKO (Agilent)Microscópio de fluorescência S3000
Carl Zeiss
MicroImaging		Zeiss AX10 Axioskop
Holter ECGElamedicalSyneflash SF0003044S
Dulbecco' s meio Eagle modificado (DMEM) Fisher Scientific11965084
10% de soro fetal de bezerro (FCS)Fisher Scientific11573397
0,05% de ácido tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA)Fisher Scientific25300054
Lipofectamine 2000 (reagente de transfecção lipídica)Fisher Scientific11668019
Meio de soro reduzido (Opti-MEM)Fisher Scientific
Higromicina BCalbiochem (MERCK)400051
Xileno (histológico)Fisher ScientificX3S-4
Solução de Peróxido de Hidrogênio (H2O2)SigmaH1009
PronaseFisher Scientific53-702-250KU
. Sistema de 31985070

Referências

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  3. Perin, E. C., et al. Comparison of intracoronary and transendocardial delivery of allogeneic mesenchymal cells in a canine model of acute myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 44, 486-495 (2008).
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