Subretinal transplante de células epiteliais de pigmento retinal derivado de células-tronco embrionárias humanas em um modelo de grandes olhos de atrofia geográfica

Resumo

Células epiteliais de pigmento retinal podem servir como uma terapia de reposição celular para a forma avançada de degeneration macular age-related seco. Este protocolo descreve a geração de um modelo de grandes olhos de atrofia geográfica e o subretinal transplante de células epiteliais de pigmento retinal embrionárias humanas células-tronco derivadas para este modelo de doença.

Resumo

Atrofia geográfica (GA), a fase tardia do degeneration macular age-related seco é caracterizada por perda de pigmento da retina epitelial (RPE) camada, que leva à subsequente degeneração das estruturas da retina vitais (por exemplo, fotorreceptores) causando deficiência de visão severa. Da mesma forma, RPE-perda e diminuição da acuidade visual é visto no seguimento a longo prazo acima dos pacientes com avançado relacionadas com a idade degeneração macular úmida (AMD) intravitreal tratamento de anti-vascular fator de crescimento endotelial (VEGF). Portanto, por um lado, é fundamental para derivar eficientemente as células RPE de uma fonte ilimitada de que poderia servir como terapia de reposição. Por outro lado, é importante avaliar o comportamento e a integração das células derivadas em um modelo da doença acarrete cirúrgica e métodos de imagem como perto possível aqueles aplicados no corpo humano. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado baseado em nossas publicações anteriores que descreve a geração de um modelo pré-clínicos de GA usando o olho de coelho albino, para avaliação das células-tronco embrionárias humanas derivadas de células epiteliais de pigmento retinal (RPE-hESC) em um configuração de clinicamente relevante. HESC-RPE diferenciado são transplantadas para olhos ingénuos ou olhos com NaIO₃-induzido GA-como degeneração da retina usando uma G 25 transvitreal pars plana técnica. Avaliação de áreas degeneradas e transplantadas é realizada pelo multimodal de alta resolução não-invasiva imagens em tempo real.

Introdução

Este protocolo descreve a geração de um modelo de grandes olhos pré-clínicos de atrofia geográfica (GA) que permite a avaliação da integração do transplantado hESC-RPE no espaço subretinal. Os métodos descritos em detalhe aqui têm sido utilizados em 3 publicações recentes que demonstram a produção de uma população enriquecida, pura e funcional das células RPE de hESC¹, bem como a criação de danos na retina exterior e um fenótipo de GA-como induzida pela subretinal injeção de soluções salinas fisiológicas (i.e., BSS e PBS) ou NaIO₃ no coelho olho^2,3. Mais demonstrámos....

Protocolo

O seguinte protocolo segue as orientações de cuidados com animais de Karolinska Instituet. Todas as experiências com animais usando coelhos albinos de Nova Zelândia (Tabela de materiais) foram aprovadas pelo Comitê de ética animal regional (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) (permitir: dnr 56/15). O uso de hESC (dnr 2011/745-31/3) e a transferência e manipulação de hESC-RPE (dnr 2013/813-31/2) também está em conformidade com a legislação sueca e regulamentos do Karolinska Institutet e foi aprovado pelo (Comité de ética humana regional Regionala Etikprövningsnämnden eu Stockholm).

1. apresentam injeção de iodato de sódi....

Resultados

Representante na vivo imagens da FAB, IR-cSLO e SD-PTU de uma retina de coelho albino normal são mostradas na Figura 2. Observe as diferentes camadas da retina com seus distintos níveis de reflexão da luz capturada pelo instrumento SD-OCT.

Figura 1A e figura 1B, a instalação para criar bolhas sub retiniana é ilustrada: um retractor.......

Discussão

Neste protocolo, a geração de um modelo de grandes olhos de GA e seu uso pré-clínicos para avaliar hESC-RPE integração na vivo é descrita.

Para tradução de terapias regenerativas para GA e doenças relacionadas para a clínica⁷, é importante desenvolver e aperfeiçoar métodos que fielmente capturar os métodos clínicos para o transplante e de imagem. O coelho é neste aspecto atraente: tem um olho relativamente grande que permite que a cirurgia intra-ocular e uso de.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio de diferenciação NutriStem hESC XF - bFGF e – TGFb	Biological Industries	06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x	Gibco, ThermoFisher Scientific Corp	12563-011
PBS sem Ca2+ e Mg2+	Gibco, ThermoFisher Scientific Corp	14190-094
Filtro de células 40 μ m Nylon	VWR	732-2757
Agulha 30 G 0,5' ’; 0,3 mm x 13 mm	BD Microlance	304827
Acrodisc 25 mm Filtro de seringa	Acrodisc	PN4612
0,4% azul tripano	ThermoFisher Scientific Corp	15250061	Uso a 0,2%
NaIO3	Sigma-Aldrich Corp	S4007
BSS	Alcon Nordic A/S	65079550
70% Etanol	Solveco AB	1047
Cetaminol, 100 mg / mL	Intervet, Boxmeer	511519	Use 35 mg / kg de cetamina
Rompun vet, 20 mg / mL	Bayer Animal Health	22545	Use 5 mg / kg de xilazina
Triescência, 40 mg / mL	Alcon Nordic A / S	412915	2 mg de
Cyklopentolat-fenilefrina intraviterial, 0,75% + 2,5%	APL	321968	Use 1 gota em cada olho
Viscotears	Laboratoires Thé um	597562
Solução salina tópica	Apotea AB	7053249369080
Allfatal vet. 100 mg/mL	Omnidea	77168	Use 100 mg/mL pentobarbital
Tubo de extensão (Hammer)	MedOne Surgical Inc	3223
25 G/38 G cânula sub-retiniana politip	MedOne Surgical Inc	3219	25 G/38 G
Lente plana de uso único	Volk
Barraquer Colibri afastador de tampa	AgnTho's AB	42-020-030
Trocartes não valvulados	Alcon Nordic A/S	8065751448
Pinça com garras	Bausch & Máquina de vitrectomia Lomb Nordic AB	ET1811
Alcon Accurus 400VS	Alcon Nordic A/S	8065740238
Accurus 25+ Gauge Vitrectomia TotalL Plus Pak	Alcon Nordic A/S	8065751493
dispositivo SD-OCT	Heidelberg Engineering	Spectralis HRA+OCT	Use Heidelberg Eye Explorer versão 1.9.10.0
Placas de 24 poços	Sarstedt	83.3922
Hemocitômetro Neubauer	VWR	631-0925
Coelhos albinos da Nova Zelândia	Lidkö pings Rabbit Farm, Suécia
		hESC-RPE	Ver número de referência 1
Buprenodale Vet, 0,3 mg/ml	Dechra	660500	Utilizar 0,5 ml de buprenorfina por via subcutânea