Subretinal transplante de células epiteliais de pigmento retinal derivado de células-tronco embrionárias humanas em um modelo de grandes olhos de atrofia geográfica

Resumo

Células epiteliais de pigmento retinal podem servir como uma terapia de reposição celular para a forma avançada de degeneration macular age-related seco. Este protocolo descreve a geração de um modelo de grandes olhos de atrofia geográfica e o subretinal transplante de células epiteliais de pigmento retinal embrionárias humanas células-tronco derivadas para este modelo de doença.

Resumo

Atrofia geográfica (GA), a fase tardia do degeneration macular age-related seco é caracterizada por perda de pigmento da retina epitelial (RPE) camada, que leva à subsequente degeneração das estruturas da retina vitais (por exemplo, fotorreceptores) causando deficiência de visão severa. Da mesma forma, RPE-perda e diminuição da acuidade visual é visto no seguimento a longo prazo acima dos pacientes com avançado relacionadas com a idade degeneração macular úmida (AMD) intravitreal tratamento de anti-vascular fator de crescimento endotelial (VEGF). Portanto, por um lado, é fundamental para derivar eficientemente as células RPE de uma fonte ilimitada de que poderia servir como terapia de reposição. Por outro lado, é importante avaliar o comportamento e a integração das células derivadas em um modelo da doença acarrete cirúrgica e métodos de imagem como perto possível aqueles aplicados no corpo humano. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado baseado em nossas publicações anteriores que descreve a geração de um modelo pré-clínicos de GA usando o olho de coelho albino, para avaliação das células-tronco embrionárias humanas derivadas de células epiteliais de pigmento retinal (RPE-hESC) em um configuração de clinicamente relevante. HESC-RPE diferenciado são transplantadas para olhos ingénuos ou olhos com NaIO₃-induzido GA-como degeneração da retina usando uma G 25 transvitreal pars plana técnica. Avaliação de áreas degeneradas e transplantadas é realizada pelo multimodal de alta resolução não-invasiva imagens em tempo real.

Introdução

Este protocolo descreve a geração de um modelo de grandes olhos pré-clínicos de atrofia geográfica (GA) que permite a avaliação da integração do transplantado hESC-RPE no espaço subretinal. Os métodos descritos em detalhe aqui têm sido utilizados em 3 publicações recentes que demonstram a produção de uma população enriquecida, pura e funcional das células RPE de hESC¹, bem como a criação de danos na retina exterior e um fenótipo de GA-como induzida pela subretinal injeção de soluções salinas fisiológicas (i.e., BSS e PBS) ou NaIO₃ no coelho olho^2,3. Mais demonstrámos que transplantes de suspensão sub retiniana de hESC-RPE formam extensas monocamadas funcionais com capacidade de resgate do fotoreceptor².

Várias vantagens acompanham o uso do olho de coelho para a geração de um modelo de GA da doença. Em primeiro lugar, o tamanho do olho de coelho, que é de 70% do volume de um olho humano adulto, permite o transplante clinicamente significativa usando uma densidade de celular que é muito menor do que rotineiramente utilizados em olhos pequenos roedores (1.000 células / µ l vs 50.000 células / µ l)^{4 , 5}. em segundo lugar, a cirurgia em roedores é geralmente transscleral através da coroide, que compromete a barreira da retina e potencialmente desencadeia uma resposta inflamatória e uma possível rejeição⁶. Os dois fatores juntos podem levar a multilayering e aglutinação de células transplantadas e uma integração total pobre das células transplantadas em um tecido retinal nativo perturbado. No entanto, o modelo de grandes olhos coelho permite executar uma técnica cirúrgica com instrumentação idêntica a um ambiente clínico. Em terceiro lugar, um modelo de grandes olhos também permite alta resolução na vivo de imagens e monitoramento de células transplantadas e retina sobrejacente a tempo^1,2,3. Assim, descrevemos um modelo pré-clínicos clinicamente relevante e custo-eficiente que deve ser uma alternativa atraente para roedores para qualquer pessoa com interesse em pesquisa de retina normal e doente e o espaço abaixo da retina.

Protocolo

O seguinte protocolo segue as orientações de cuidados com animais de Karolinska Instituet. Todas as experiências com animais usando coelhos albinos de Nova Zelândia (Tabela de materiais) foram aprovadas pelo Comitê de ética animal regional (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) (permitir: dnr 56/15). O uso de hESC (dnr 2011/745-31/3) e a transferência e manipulação de hESC-RPE (dnr 2013/813-31/2) também está em conformidade com a legislação sueca e regulamentos do Karolinska Institutet e foi aprovado pelo (Comité de ética humana regional Regionala Etikprövningsnämnden eu Stockholm).

1. apresentam injeção de iodato de sódio (NaIO₃) em um modelo Animal de olhos grandes

1. Anestesiar animais por administração intramuscular na coxa com uma mistura de 35 mg/kg de ketamina e xilazina 5 mg/kg em soro fisiológico, utilizando uma seringa de 30 G, e dilatar as pupilas com colírio tópico, usando uma mistura de fenilefrina ciclopentolato e 2,5% de 0,75%. Anesthetization adequada é confirmado se o animal não reage a uma pitada dura de sua perna de trás.
2. Coloque o coelho sob o microscópio cirúrgico com a cabeça virada para o cirurgião (figura 1A). Use um afastador de tampa para remover as pálpebras e nictitans membrana com um pano estéril para minimizar o risco de contaminação. Uso equilibrado de solução salina (BSS) para evitar ressecamento enquanto sob anestesia em ambos os olhos.
3. Para microcirurgia, uso uma porta 2 (ou 3-porta opcional) 25 G transvitreal pars plana técnica com GMD sem válvula, para a inserção de instrumentos microcirúrgicos (figura 1B). A máquina multifunções vitrectomia tem portas para conectar uma cânula de infusão, endoillumination, vitrector e endolaser. Por injeções subretinal, apenas o endoillumination é obrigatório, o que faz um set-up 2 portas suficientes. Insira o endoillumation através do trocarte superior esquerdo e use o trocarte direito superior para a cânula injeção subretinal.
   1. Para uma configuração de 3 portas, use o trocarte temporal inferior para a cânula de infusão de BSS. Se os instrumentos facultativos (como um vitrector) são usados, inseri-los através do trocarte direito superior.
   2. Introduza os 2 trocartes superiores 1-2 mm do limbo usando pinça de garras para agarrar e deslocar a conjuntiva sobrejacente o local de inserção.
   3. Verifique se os trocartes são transsclerally inserido em um ângulo de paralelo de limbo de 30-45° e prosseguir para o meio da ponta do trocarte. Em seguida rode o trocarte 90° e avançar para dentro do olho, visando o polo posterior do olho. Este procedimento irá evitar o escapamento pós-cirúrgica dos sclerotomies e também diminuir o risco de Endoftalmite (ou seja, a infecção bacteriana no olho). Veja também Figura 2B para posições de trocarte.
   4. Colocar uma lente de contato plana de uso único na córnea para visualizar a retina, com lágrimas sintéticas como gel de contato entre o olho e a lente de contato (figura 1A).
   5. Desenhe 500 µ l de NaIO₃ em uma seringa de 1 mL, conectado a um tubo de extensão (operado pelo assistente) e uma cânula de polytip de 38 G (operado pelo cirurgião).
   6. Inserir a sonda de endoillumination através do trocarte superior esquerdo e a cânula de injeção através do trocarte superior direito e fazer avançar a cânula através do espaço vítreo para a retina, apontando para a área logo abaixo da cabeça do nervo óptico.
   7. Permitir que a ponta da cânula para tocar lentamente a retina até um clareamento focal é visível. A injeção em si irá penetrar na retina, permitindo a entrega subretinal. Não deixe a cânula penetrar na retina, pois pode causar hemorragia.
   8. Injete 50 µ l de NaIO₃ subretinally durante um período de 5 s. Uma vez que existe um plano de clivagem natural entre a retina e a coroide subjacente, uma bolha semitransparente claramente visível deve formar gradualmente durante a injeção.
   9. Durante a injeção, lentamente retratar a agulha, mas certifique-se de que a ponta é mantida dentro da bolha para minimizar o refluxo.
   10. Após a remoção da cânula endoillumation e injeção, remover os trocartes usando pinça de garras e aplique uma leve pressão para 30 s para os sclerotomies de sutura-menos Auto-selante usando a ponta ou extremidade romba da pinça.
4. Post-surgically dar 10 mL de soro fisiológico por via subcutânea para prevenir a desidratação. Não dê pós-cirúrgica esteroides tópicos ou antibióticos. Para analgésicos dar 0,5 mL de buprenorfina 0,3 mg/ml por via subcutânea após a cirurgia, bem como o dia após a cirurgia.
5. Após o uso, lavar todos os instrumentos, mergulhando-os por alguns segundos em primeiro lugar em etanol a 70%, em segundo lugar em etanol a 45% e por último, em água destilada. Secá-las corretamente com uma toalha de papel.
6. Assistir animais até que recupere a consciência suficiente e colocá-los todos solteiros engaiolado. Se for necessário (por exemplo, para fins de imuno-histoquímica), eutanásia em animais por injecção intravenosa de pentobarbital 100 mg/kg (ver Tabela de materiais).
7. Espere 7 dias para prosseguir com o transplante de células hESC-RPE.

2. apresentam transplante de células de hESC-RPE em animais tratados

1. Administrar 2mg (100 µ l) de intravitreal triancinolona em animais anestesiados, usando uma agulha de injeção de 30g inserida 1-2 mm do limbo no quadrante temporal inferior 1 semana antes do transplante de hESC-RPE e administrá-lo novamente a cada 3 meses. Certifique-se de ponto a ponta para o polo posterior do olho para evitar um toque de lente.
2. Cultura uma monocamada hESC-RPE conforme descrito anteriormente,¹.
3. Remova a mídia de diferenciação celular (ver Tabela de materiais) de uma monocamada confluente 24-bem hESC-RPE e lavar cada um com 500 µ l de PBS sem Ca^{2 +} e Mg^{2 +}. Repita esta ação mais uma vez, para um total de 2 lavagens.
4. Descartar o sobrenadante, adicione 500 µ l de tripsina por bem e incubar durante 12 min a 37 ° C.
5. Incline o prato e Retire cuidadosamente a tripsina (células devem permanecer anexadas à placa). Recolha pilhas em 800 µ l de mídia de diferenciação escaldadas fresco 37 ° C por pipetagem suave, ou mesmo raspar se necessário, para obter uma suspensão de célula única.
   Nota: Use um coador de célula de 40 µm se observam-se aglomerados de células.
6. Contagem de células em uma câmara de hemocytometer usando 0,2% Trypan azul, de acordo com as instruções do fabricante.
7. Adicione 5 mL de células de mídia e centrífuga de diferenciação à temperatura ambiente, 300 x g durante 5 min.
8. Descartar o sobrenadante e ressuspender em PBS filtro recém esterilizados (passado através de um filtro de seringa de 25 mm) a uma concentração final de 1.000 células / µ l.
9. Alíquota a anterior suspensão de eritrócitos em 600 alíquotas µ l e manter no gelo até e durante a cirurgia.
10. Anestesia animais por administração intramuscular na coxa com uma mistura de 35 mg/kg ketamina e 5 mg/kg de xilazina em Salinas, utilizando uma seringa de 30 G. Dilate as pupilas com colírio tópico usando amix de fenilefrina ciclopentolato e 2,5% de 0,75%. Anesthetization adequada é confirmado se o animal não reage a uma pitada dura em sua perna de trás.
11. Coloque o coelho com a cabeça virada para o cirurgião. Use um afastador de tampa para remover as pálpebras e nictitans membrana com um pano estéril para minimizar o risco de contaminação. Use BSS para evitar ressecamento enquanto sob anestesia em ambos os olhos.
12. Para microcirurgia, uso uma porta 2 (ou 3-porta opcional) 25 G transvitreal pars plana técnica com trocartes colocados nas mesmas posições, conforme descrito na etapa 1.3 e a Figura 2. Se o sclerotomies anteriores são visíveis, realizar inserção de trocarte só adjacente, mas não através destes, para minimizar o risco de fugas no pós-operatório.
    1. Colocar uma lente de contato plana de uso único na córnea para visualizar a retina, com lágrimas sintéticas como o gel de contato entre o olho e a lente de contato (figura 1A).
    2. Após o correcto posicionamento (consulte as etapas 1.3.5 e 1.3.6) da ponta, injete 50 µ l de uma suspensão suavemente misturados hESC-RPE (50.000 células) subretinally. Aponte para o centro da área de₃ pré-tratados NaIO distinguida-se por um reflexo característico "metálico" endo-iluminação. A retina marcante deve separar facilmente criar uma bolha visível. Resplendor a agulha com estéril H₂O entre coelhos/após utilização para evitar entupimento devido à célula de agulha agrupa. Mudança da agulha quando o entupimento é notada.
    3. Durante a injeção, lentamente, retirar a agulha mas certifique-se de que a ponta é mantida dentro da bolha para minimizar o refluxo.
    4. Após a remoção da cânula endoillumation e injeção, remover os trocartes usando pinça de garras e aplique uma leve pressão para 30 s para os sclerotomies de sutura-menos Auto-selante usando a ponta ou extremidade romba da pinça.
13. Post-surgically dar 10 mL de soro fisiológico por via subcutânea para prevenir a desidratação. Não dê pós-cirúrgica esteroides tópicos ou antibióticos. Para analgésicos dar 0,5 mL de buprenorfina 0,3 mg/ml por via subcutânea após a cirurgia, bem como o dia após a cirurgia.
14. Após o uso, lavar todos os instrumentos, mergulhando-os por alguns segundos, em primeiro lugar em etanol a 70%, em segundo lugar em etanol a 45% e por último, em água destilada. Secá-las corretamente com uma toalha de papel.
15. Assistir animais até que recupere a consciência suficiente e colocá-los todos solteiros engaiolado. Se for necessário (por exemplo, para fins de imuno-histoquímica), eutanásia em animais por injecção intravenosa de pentobarbital 100 mg/kg.

3. in Vivo Retinal e apresentam imagem

1. Usar um dispositivo de (SD-OCT) a tomografia de coerência óptica domínio espectral com o software que acompanha (consulte a tabela de materiais) para obter transversais b-exames de animais tratados, de acordo com as instruções do fabricante. Para evitar o desfoque de imagem, certifique-se de manter a córnea úmida por lavagem com solução salina tópica cada 30-60 s.
   1. Coloque os animais anestesiados e pupila dilatada (consulte as etapas 1.1 e 2.10) em uma montagem ajustável para obter um caminho desobstruído da fonte de luz de instrumento para a retina de coelho.
   2. Obter pelo menos 3 exames de OCT com Oftalmoscopia do laser infravermelho-confocal digitalização de simultânea de imagens de referência de reflectância (IR-cSLO) que representa a parte superior, inferior e central da área injetada.
   3. Obter imagens de fundo pt-rosto com cSLO azul, verde, infravermelho e multicolor laser reflectância (ou seja, várias cores simultâneas do laser), respectivamente.
   4. Capture imagens de autofluorescência de luz azul (BAF) usando a capacidade de laser de luz azul do dispositivo SD-OCT.

Resultados

Representante na vivo imagens da FAB, IR-cSLO e SD-PTU de uma retina de coelho albino normal são mostradas na Figura 2. Observe as diferentes camadas da retina com seus distintos níveis de reflexão da luz capturada pelo instrumento SD-OCT.

Figura 1A e figura 1B, a instalação para criar bolhas sub retiniana é ilustrada: um retractor...

Discussão

Neste protocolo, a geração de um modelo de grandes olhos de GA e seu uso pré-clínicos para avaliar hESC-RPE integração na vivo é descrita.

Para tradução de terapias regenerativas para GA e doenças relacionadas para a clínica⁷, é importante desenvolver e aperfeiçoar métodos que fielmente capturar os métodos clínicos para o transplante e de imagem. O coelho é neste aspecto atraente: tem um olho relativamente grande que permite que a cirurgia intra-ocular e uso de...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio de diferenciação NutriStem hESC XF - bFGF e – TGFb	Biological Industries	06-5100-01-1A
TrypLE Select 1x	Gibco, ThermoFisher Scientific Corp	12563-011
PBS sem Ca2+ e Mg2+	Gibco, ThermoFisher Scientific Corp	14190-094
Filtro de células 40 μ m Nylon	VWR	732-2757
Agulha 30 G 0,5' ’; 0,3 mm x 13 mm	BD Microlance	304827
Acrodisc 25 mm Filtro de seringa	Acrodisc	PN4612
0,4% azul tripano	ThermoFisher Scientific Corp	15250061	Uso a 0,2%
NaIO3	Sigma-Aldrich Corp	S4007
BSS	Alcon Nordic A/S	65079550
70% Etanol	Solveco AB	1047
Cetaminol, 100 mg / mL	Intervet, Boxmeer	511519	Use 35 mg / kg de cetamina
Rompun vet, 20 mg / mL	Bayer Animal Health	22545	Use 5 mg / kg de xilazina
Triescência, 40 mg / mL	Alcon Nordic A / S	412915	2 mg de
Cyklopentolat-fenilefrina intraviterial, 0,75% + 2,5%	APL	321968	Use 1 gota em cada olho
Viscotears	Laboratoires Thé um	597562
Solução salina tópica	Apotea AB	7053249369080
Allfatal vet. 100 mg/mL	Omnidea	77168	Use 100 mg/mL pentobarbital
Tubo de extensão (Hammer)	MedOne Surgical Inc	3223
25 G/38 G cânula sub-retiniana politip	MedOne Surgical Inc	3219	25 G/38 G
Lente plana de uso único	Volk
Barraquer Colibri afastador de tampa	AgnTho's AB	42-020-030
Trocartes não valvulados	Alcon Nordic A/S	8065751448
Pinça com garras	Bausch & Máquina de vitrectomia Lomb Nordic AB	ET1811
Alcon Accurus 400VS	Alcon Nordic A/S	8065740238
Accurus 25+ Gauge Vitrectomia TotalL Plus Pak	Alcon Nordic A/S	8065751493
dispositivo SD-OCT	Heidelberg Engineering	Spectralis HRA+OCT	Use Heidelberg Eye Explorer versão 1.9.10.0
Placas de 24 poços	Sarstedt	83.3922
Hemocitômetro Neubauer	VWR	631-0925
Coelhos albinos da Nova Zelândia	Lidkö pings Rabbit Farm, Suécia
		hESC-RPE	Ver número de referência 1
Buprenodale Vet, 0,3 mg/ml	Dechra	660500	Utilizar 0,5 ml de buprenorfina por via subcutânea

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