Artigo de método

Simultânea distinção de monoespecíficos e DFS70 mistos padrões durante exibição de ANA com um substrato de romance nocaute ELITE/DFS70 HEp-2

DOI:

10.3791/56722

⸱

17 de janeiro de 2018

 , 
1Research & Development, Immco Diagnostics, A Trinity Biotech Company

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autoanticorpos DFS70 imitam padrões comuns de anticorpos antinucleares doença associada a exata interpretação desafiador quando usando substratos convencionais de HEp-2. O protocolo descreve vantagens do romance substrato engenharia de HEp-2 em HEp-2 convencional em ANA triagem e distinguir padrões de DFS70 com alta confiança em monoespecíficos e mistos casos positivos de ANA.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autoimune sistêmica dos tecidos conjuntivos caracterizam-se por circulação de anticorpos antinucleares (ANA). Embora existam várias tecnologias disponíveis para a triagem de ANA, imunofluorescência indireta (IIF) usando substrato de (HEp-2) 2-células epitelial humano permanece o método primário e recomendado por causa da sua sensibilidade superior. Substratos de HEp-2 podem detectar uma infinidade de padrões resultantes da ligação de auto-anticorpos para várias proteínas e ácidos nucleicos auto-antigénios distribuídos por todo o núcleo e o citoplasma das células. A grande diversidade de monoespecíficos e padrões mistos, resultantes de reacções positivas em substrato HEp-2 também complicar a interpretação e a precisão dos relatórios. Um exemplo específico que recebeu maior atenção recentemente é o denso bem malhados 70 (DFS70) padrão resultante de auto-anticorpos que se ligam especificamente a uma proteína chamada fator de crescimento de epitélio derivado de lente (LEDGF). Falta de uma associação clara com uma doença autoimune sistêmica específica e alta prevalência em populações saudáveis fizeram exata interpretação do padrão DFS70 importante. Distinção precisa de DFS70 padrão de doença associada padrões usando convencional substrato HEp-2 é um desafio. Além disso, frequente co-ocorrência de DFS70 padrão juntamente com padrões de doença associada como homogêneos, malhados e mistos padrões homogêneos-salpicado complicar a interpretação do IIF. O objetivo deste trabalho é demonstrar que a utilidade de um romance engenharia substrato HEp-2 IIF que mantém todas as vantagens de convencional substrato HEp-2, proporcionando simultaneamente a capacidade de distinguir DFS70 padrão com alta confiança em ambos os monoespecíficos e mistos exemplos positivos de ANA. O novo substrato é mais capaz de desmascarar a padrões de ANA associada a doença anteriormente ocultados por padrão DFS70.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ANAs são uma marca registrada da doença auto-imune do tecido conjuntivo sistêmica mediada doenças1. Vários métodos são empregados para rastreio e confirmação de ANAs. IIF técnica usando restos de substrato HEp-2 o mais amplamente utilizado e recomendado frequentemente método para triagem de ANAs1,2. Apesar dos avanços em metodologias de ensaio diagnóstico fase sólida como ensaio de lig da imunoabsorção enzimática (ELISA), imunoensaio enzimático (EIA), imunoensaio de quimioluminescência (CLIA) e ensaios de multiplex do grânulo-based, IIF por HEp-2 é a triagem mais prevalente método devido a sua utilidade diagnóstica e custo eficácia1,2,3. As tecnologias de ensaio acima mencionados dependem de um conjunto limitado de nativo purificado ou recombinantes auto-antigénios Considerando que os preparativos de monocamada de células HEp-2 em poços de slide de vidro apresentam um extenso leque de auto-antigénios em sua forma natural, distribuídos em o núcleo e o citoplasma, que reagem com os auto-anticorpos do soro dos doentes ou controlos positivos, resultando em uma infinidade de padrões que estão associados a várias doenças auto-imunes. Esses padrões são classificados em padrões mitóticos, citoplasmáticos e nucleares baseados na localização do antígeno nas células. Cada padrão e o antígeno associados/antígenos e Estados de doença são bem caracterizadas4. No método IIF, paciente e controle de soros são incubados em poços de slide de vidro que apresentam uma cultura de monocamadas de células HEp-2 devidamente corrigido para preservar uma infinidade de auto-antigénios em sua configuração natural. Os autoanticorpos no soro dos doentes ou controlos positivos podem ligar para os auto-antigénios apresentados pelas células HEp-2 sobre o substrato (lâmina de vidro bem) durante a incubação. Post, incubação, desvinculado de anticorpos são lavados fora e anticorpos ligados da classe IgG são detectados com fluoresceína/fluoresceína isotiocianato (FITC) conjugado anti-humano IgG reagente. Relatou-conjugado não ligado é lavada e as lamelas de vidro são montadas em cima dos slides usando um meio de montagem que preserva as reações e facilita a observação ao microscópio fluorescente. As reações são observadas sob um microscópio de fluorescência, equipado com combinação de filtro de excitação adequada-emissão configurado conforme o repórter usado (para repórter FITC, um microscópio de diagnóstico geralmente usa filtros com gama de excitação de 467 -498 nm e uma faixa de emissão de 513-556 nm). A presença de ANA é demonstrada por uma fluorescência verde brilhante de estruturas específicas nas células. Ao contrário de plataformas automatizadas de ensaio, metodologia IIF baseia-se no processo trabalhoso de serial diluir os soros e a visual determinação positiva dos padrões de coloração que requer o usuário significativa experiência5,6. Apesar dessas limitações, IIF por HEp-2 continua a ser o mais amplamente utilizado e método para rastreio de ANAs devido aos esforços de padronização para a nomenclatura e a interpretação do padrão recomendado pelo consenso internacional sobre ANA Comitê de padrões (ICAP), aumento da disponibilidade de soluções de automação para IIF slide processamento e interpretação de resultado3.

Entre a multidão de padrões detectados pelo método IIF HEp-2, os auto-anticorpos que visasse o produto do gene psip1 (também referido como DFS70/LEDGF/p75), ganharam um interesse significativo nos últimos anos por várias razões4,5 ,6,7,8,9,10. DFS70 os auto-anticorpos estão presentes em títulos elevados em controles saudáveis, e estudos até agora não conseguiram demonstrar uma associação de clínica distinta para a presença de DFS70 auto-anticorpos7,8,9 ,10,11,12,13. As taxas de resultados positivos relatados para auto-anticorpos DFS70 em vários Estados de doença e saudáveis coortes variadas amplamente entre estudos6,8,9,10,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,,27,28. O padrão monoespecíficos DFS70 é bem diferenciado de um padrão homogêneo ou manchado mas interpretação de padrões homogêneos-salpicado mistos e anticorpos anti-DFS70 co ocorrendo com outras ANAs é um desafio mesmo para leitores especializados. A geração atual de IIF triagem métodos e ensaios de fase sólida específica de DFS70 não é capaz de diferenciar um monoespecíficos DFS70 reação de padrões mistos (figura 1A, amarela área sombreada do algoritmo). Interpretação de DFS70 padrão como homogêneo, salpicado, padrão misto ou vice-versa, pode ter sérias implicações no atendimento ao paciente. O atual protocolo comumente usado é o seguinte: os laboratórios clínicos empregam um número de testes confirmatórios de fase sólida para ANAs associada a doença e/ou um método de immunoadsorption para DFS70/LEDGF quando bem densa salpicado (AC-2) padrão é suspeito (Figura 1a)4,5.

O objetivo do presente protocolo é demonstrar a utilidade de um romance engenharia substrato HEp-2 IIF (HEp-2 ELITE/DFS70 nocaute (KO), será referido como a ELITE de HEp-2) que retém todas as vantagens do convencional HEp-2 para a seleção de ANAs, enquanto simultaneamente distinção entre padrão DFS70 com alta confiança em monoespecíficos e mista ANA casos positivos (figura 1B, amarela área sombreada do algoritmo)5. Substrato HEp-2 ELITE é composto de uma mistura aproximada de não modificadas células HEp-2 convencionais e engenharia células desprovidas de antígeno LEDGF/p75/DFS70 na proporção de 1:95. O procedimento IIF para ELITE de HEp-2 é idêntico ao método convencional de HEp-2. A configuração exclusiva de substrato HEp-2 ELITE não só mantém todas as vantagens do HEp2 convencional mas pode diferenciar padrões de reação homogênea, malhados e misto de padrão de DFS70 para o rastreio inicial ou testes de uma amostra (figura 1B )5. Soros de pacientes a ser reagiram em slides com substrato HEp-2 IIF devem ser diluídos 01:40 com diluição de triagem ou conforme o critério de cada laboratório. Uma reacção específica às 01:40 ou maior título é considerada positiva.

Nesse estudo, os soros positivos para homogêneo, salpicado, Centrómero, nucleolar, citoplasmático reticular/AMA e padrões de DFS70 que produziu um sinal positivo médio (relativo para o controle negativo e positivo controle de ANA fornecido pelo kit) na seleção diluição de 01:40 foram selecionados para simular os padrões mono-específicos e mistos em substratos de HEp-2 (convencional e ELITE HEp-2). O 01:40 diluídos DFS70 de soros positivos foram misturadas com 01:40 diluições de ANA associada a doença individual padrão controles (homogêneo, salpicado, Centrómero, nucleolar, ou citoplasmático reticular-AMA) em várias relações (controle: DFS70 em 100:0, 80: 20, 50: 50, 20:80 e 0:100) e avaliadas no convencional e substratos de HEp-2 ELITE seguindo o procedimento padrão do IIF descrito abaixo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo segue as diretrizes do Comitê de ética de pesquisa institucional humana Trinity Biotech.

1. amostra e preparo do substrato

  1. Permitir que malotes contendo lâminas de substrato (vidro corrediças com 12 poços em cada slide contendo HEp2 ou HEp-2 + mistura HEp2 KO com o celular) para equilibrar a temperatura ambiente para um desempenho ideal e evitar a condensação de umidade na superfície do slide antes do adição da amostra. Isso deve levar aproximadamente entre 10-15 min.
  2. Depois de incubado à temperatura ambiente, remova cuidadosamente os slides de substrato usando os dedos sem lhes tocar os lados da bolsa.
  3. Rotular os slides e colocá-los em uma câmara de incubação (à temperatura ambiente), forrada com papel toalha umedecida com água para impedir a secagem das lâminas durante incubação conjugada e amostra.
    Nota: Mancha não específica pode resultar de poços secos; uma toalha de papel molhada dentro da câmara de incubação fornece umidade e previne a secura bem.

2. adição de controles e amostras

  1. Dispense a aproximadamente 50 µ l de controles negativo/positivo, combinações de soros positivos DFS70-ANA conforme descrito neste estudo, ou amostras de soro do paciente em poços de slides individuais.
  2. Dispense a controles e amostras em cada poço no slide.
  3. Para evitar contaminação cruzada bem, evite o enchimento excessivo dos poços. Enquanto não encher demasiado poços, assegurar uma cobertura completa da superfície bem e evitar bolhas de ar.
    Nota: O volume recomendado é de 50 µ l de acordo com passo 2.1.
  4. Coloque a tampa na incubadora e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. Se houver qualquer ANA presentes no soro do paciente, ele irá ligar para as células presentes em cada poço, durante este período de incubação.
  5. Uma vez que o período de incubação é longo, retire a lâmina da incubadora. Segure o slide no final do guia e lave delicadamente com aproximadamente 10 mL tampão fosfato salino (PBS) tampão de lavagem fornecido no kit, com uma pipeta ou num copo cheio de PBS por 10-15 s. transferir o slide imediatamente em uma jarra de Coplin com tampão de lavagem PBS e lavagem ( molho) por 10 min. repetir o processo com todos os slides restantes.
    Nota: Quando colocar vários slides em uma jarra de Coplin, certifique-se de que o lado da cela do slide não entra em contacto com outro slide, pois isso resultará em danificar as células aderida na lâmina de vidro.

3. a adição do conjugado fluorescente

  1. Remova apenas um slide de cada vez do Coplin. Para remover o tampão de lavagem PBS excesso de slide, suavemente, toque ou borre o slide sobre a toalha de papel. Cada kit é fornecido com FITC rotulado conjugado fluorescente de IgG anti-humano. Para cada poço, suavemente aplique 1 gota (cerca de 50 µ l) do conjugado fornecido.
  2. A incubar na câmara de incubação fechado da coloração por 30 min.
    Nota: Recomenda-se o uso do Fc conjugado de IgG específico. Se houver qualquer ANA presentes no soro do paciente, o conjugado irá ligar para as células presentes em cada poço, durante este período de incubação, o que resulta na fluorescência específica das células presentes nos poços. O conjugado é sensível à luz. Incubadora fechada vai ajudar a evitar a interferência de luz com a reação conjugada das células presentes em cada poço.
  3. Uma vez que o período de incubação é longo, retire a lâmina da incubadora. Segure o slide no final guia e lave delicadamente com aproximadamente 10 mL de PBS lavagem buffer fornecido no kit, com uma pipeta ou um copo cheio de PBS. Transferi o slide imediatamente em uma jarra de Coplin com tampão de lavagem PBS e lavagem (imersão) por 10 min. Repita o processo com todos os restantes slides.
    Nota: Quando colocar vários slides em uma jarra de Coplin, certifique-se de que o lado da cela do slide não entra em contacto com outro slide, pois isso resultará em danificar as células aderida na lâmina de vidro.
  4. Lugar de lamelas que são fornecidas no kit em uma toalha de papel seca. A mídia de montagem é fornecida com o kit. A borda inferior da lamela, aplicam-se entre 3 a 4 gotas da mídia em uma linha de montagem.
  5. Tire um slide de cada vez do Coplin contendo o tampão de lavagem. Para remover o tampão de lavagem em excesso, suavemente, toque ou borre o slide sobre a toalha de papel.
  6. Baixe a lâmina suavemente sobre a lamela, colocando a borda inferior do slide para a extremidade da lamela. Isso permite que a mídia de montagem presente na borda inferior lamela a fluir para a parte superior do slide e minimiza a formação de bolhas de ar, que podem interferir com a leitura de cada poço de um slide.
    Nota: A pressão mínima deve ser usado para montar o slide de capa para o slide. Qualquer excesso de pressão pode causar o movimento lateral das lamínulas. Isso pode causar danos para a preparação de monocamada de células e resultado em distorção.
  7. Armazenar os slides no escuro a 2-8 ° C. Examine os slides, assim eles são montados, ou no prazo de 48 h.
    Nota: Mais armazenamento pode resultar em deterioração do padrão e sinal fluorescente.

4. identificação dos resultados positivos e negativos

  1. Visualizar os slides com um microscópio fluorescente usando um conjunto de filtro FITC, localizado em um quarto escuro.
  2. Examine para fluorescência verde brilhante específica sob um microscópio de fluorescência em uma ampliação de 200 X ou maior para fazer a interpretação final sobre positividade e padrão. Observe os controles positivos e negativos.
    Nota: O controlo positivo mostrará fluorescência verde brilhante no núcleo (Figura 2A, homogéneo). O controle negativo não irá exibir nenhuma fluorescência verde específica sob um microscópio de fluorescência.
  3. Gravar o resultado positivo/negativo para cada poço e incluem o padrão de ANA para casos positivos.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Substrato hEp-2 ELITE/DFS70 KO preserva padrões clássicos ANA e facilita a distinção clara do padrão de DFS70:

Células convencionais e engenharia em substrato HEp-2 ELITE/DFS70 KO são idênticas, preservando todos os auto-antigénios exceto o p75/LEDGF. O controlo negativo fornecido pelo kit estabelece o sinal fluorescente de linha de base. Controlos positivos para padrões de homogêneos, salpicado, Centrómero, nucleolar e mitocondrial na ELITE de HEp-2 produzem um padrão idêntico aos padrões esperados na convencional substrato HEp-2 IIF (Figura 2A). Esses padrões de referência têm sido descritas em detalhes juntamente com a associação do cada padrão antígeno e doença anteriormente4,29. Uma breve descrição dos padrões observados na Figura 2A são fornecidas na tabela 1.

DFS70 padrão na ELITE de HEp-2:

Aproximadamente 10% das células em cada bem mostrar um padrão salpicado bem denso (ICAP atribuído a nomenclatura: AC-2) que pode ser observado no núcleo interfásico, e cromatina associada a coloração é vista em núcleos mitóticos (Figura 2B). Sobre um substrato HEp-2 convencional, todas as células terão este padrão quando reagiu com uma amostra positiva DFS70. Os restantes ~ 90% de células HEp-2 têm o gene psip1 codificação o antígeno LEDGF nocauteado e, portanto, não produzirá um sinal ou padrão quando reagiu com um monoespecíficos DFS70 soro positivo (Figura 2B). Se 10% das células HEp-2 tem mais brilhante fluorescência correspondente para o padrão de DFS70 e o resto dos células presentes adicionais padrões (por exemplo, bem malhados ou nucleolar), isso indica a presença de padrões mistos. Uma análise mais aprofundada de tais padrões é essencial para confirmar todas as especificidades de auto-anticorpos que estão presentes, além do padrão de DFS70. Para demonstrar a capacidade do substrato HEp-2 ELITE, um painel de soros amostras foi criado com as diferentes concentrações de DFS70 e ANA positivo controlam soros e testaram em ambos convencional e substratos de ELITE de HEp-2, usando um padrão IIF (Figura 3 do protocolo , Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7).

Interpretação de DFS70 monoespecíficos e reacções mistas em substratos ELITE convencionais e HEp-2:

Para cada padrão de ANA associada a doença específica (Figura 3 Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7), um monoespecíficos ANA padrão à esquerda a maioria da coluna e um monoespecíficos DFS70 padrão à direita coluna mais podem ser observados. As três colunas no meio representam vários rácios de doença associada e controlos positivos de padrão de DFS70. Os padrões mistos resultantes estão desafiando para discernir sobre convencional substrato HEp-2 (Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6, Figura 7, linha superior). No entanto, com o romance substrato Hep-2 ELITE, na maioria das amostras, a diferença de intensidades entre células não modificadas e engenharia é distinta que não só confirma a presença de auto-anticorpos DFS70 (quando a relação mais brilhante para menos células brilhantes é 1:9), mas também revela um padrão secundário de ANA. No caso de homogêneos-DFS70 ou salpicado-DFS70 reações misturada, é impossível predizer com confiança o padrão correto, que leva para o laboratório que optar por executar um número de ensaios adicionais (figura 1A). No caso do centrómero-DFS70 e DFS70-nucleolar misturado reações, suspeitando DFS70 positividade é muito desafiador (Figura 5, Figura 6). Com reações nucleolar e citoplasmático reticular/AMA, o padrão de DFS70 não é dominante, até que a proporção de soros atinge 50%. Em todos os exemplos, o substrato HEp-2 ELITE pode apresentar o padrão de DFS70 e o padrão secundário subjacente ao longo de uma vasta gama de intensidade os níveis e assim facilita uma interpretação mais precisa de ANA.

Para observar de perto os padrões mistos, resultados para várias combinações de 50: 50 de ANA e DFS70 positivo controles foram alargada (Figura 8), para ambos convencional e substratos de ELITE de HEp-2. É incentivado a observar a interfase e coloração mitótica para todos os padrões de ANA, incluindo DFS70 em substratos de HEp-2 para melhorar a interpretação e a exatidão do padrão relatado. No entanto, para os padrões mistos, o padrão diferencial apresentado pela divisão do núcleo de células pode não ser suficiente para facilitar a interpretação exata. Setas vermelhas (Figura 8) indicam os núcleos mitóticos na célula convencional e engenharia. Pode-se observar que misturado DFS70 reações na divisão de células não conformes com o conjunto estabelecido de regras para interpretação da doença associada ANA padrões. Amarelas e azuis setas indicam não modificado e engenharia núcleo de células HEp-2 (KO DFS70), respectivamente. Em todas as combinações (Figura 8), é observada uma diferença de intensidade clara entre a célula sem modificações nucleares coloração (~ 10%) e a cela de engenharia nuclear (~ 90%) padrão o mesmo campo de visão microscópica, que permite a exibição simultânea e confirmação do padrão DFS70.

Diagrama de algoritmos de triagem ANA usando métodos HEp-2, DFS70 IIF; ELISA, EIA para diagnóstico.
Figura 1: ANA rastreio de algoritmos usando métodos convencionais de HEp-2 e HEp-2 ELITE/DFS70 KO IIF. (A) diagrama esquemático desvenda a deficiência de IIF convencional de HEp-2 em identificar monoespecíficos e mistos padrões positivos de DFS70 na fase de triagem (área sombreada amarela) e a sua incapacidade para governar para fora uma secundária associada a doença ANA padrão que pode escondido por padrão DFS70. Além disso, a geração atual de fase sólida específica DFS70, ensaios de confirmação não são capazes de confirmar a positividade de DFS70 monoespecíficos que leva a testes de confirmação adicional para ANAs. (B) esquema revela as capacidades da ELITE de HEp-2 para a seleção de ANAs, distinção simultânea de monoespecíficos e reacções mistas de DFS70, e eliminando a necessidade de fase sólida DFS70 ensaios de confirmação. Algoritmo usando HEp-2 ELITE significativamente simplifica a ANA triagem e reduz o número necessário de ensaios de confirmação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Análise do padrão ANA do substrato HEp-2; microscopia, identificação de padrões, comparação de células DFS70.
Figura 2: padrão clássico ANA e DFS70 em substrato HEp-2 ELITE/DFS70 KO. (A) substrato HEp-2 ELITE/DFS70 KO preserva padrões clássicos de ANA. Clássica reação homogênea e DFS70 reações positivas foram produzidas usando os controles positivos fornecidos pelo kit. Outras reações foram produzidas usando soros de controlo positivo estabelecida anteriormente para salpicados, Centrómero, nucleolar e citoplasmático reticular/AMA reações5. (B) substrato HEp-2 ELITE/DFS70 KO fornece células convencionais e engenharia, que facilita a fácil distinção de padrão de DFS70. Diagrama esquemático mostra a reação de monoespecíficos DFS70 resultante coloração padrão na interfase e a divisão do núcleo de células para convencionais e engenharia (DFS70-KO) células. Engenharia de células HEp-2 são desprovidas de antígeno LEDGF/p75/DFS70 que permite a detecção simultânea de padrões secundários que geralmente ficam escondidas pela reação de auto-anticorpos DFS70 em substratos convencionais de HEp-2. As setas (amarelo) indicam exemplos de núcleos de células mitóticas. Barras de escala representam 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Microscopia de fluorescência, comparação de coloração celular, células HEP-2, detecção de autoanticorpos DFS70.
Figura 3: DFS70 e sera homogênea em combinação. DFS70 monoespecíficos sera foram combinada com um controle padrão homogêneo positivo em várias relações (100:0, 80: 20, 50: 50, 20:80 e 0:100) e testado em substratos de convencional e engenharia (DFS70-KO) HEp-2. Barras de escala representam 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Microscopia de fluorescência de células Hep-2; localização de proteínas; resultados de experimentos; núcleos celulares; padrão salpicado.
Figura 4: DFS70 e salpicado sera em combinação. DFS70 monoespecíficos sera foram combinada com um controle positivo padrão salpicado em várias relações (100:0, 80: 20, 50: 50, 20:80 e 0:100) e testado em substratos de convencional e engenharia (DFS70-KO) HEp-2. Barras de escala representam 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Microscopia de imunofluorescência, células HEP-2, coloração de centrômero vs anticorpo DFS70, intensidade de fluorescência.
Figura 5: DFS70 e Centrómero sera em combinação. DFS 70 monoespecíficos sera foram combinada com um controlo de padrão centromérico positivo em várias relações (100:0, 80: 20, 50: 50, 20:80 e 0:100) e testado em substratos de convencional e engenharia (DFS70-KO) HEp-2. Barras de escala representam 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Microscopia de fluorescência de células HEP-2 com coloração nucleolar DF570; resultados de experimentos e análises.
Figura 6: DFS70 e nucleolar sera em combinação. DFS 70 monoespecíficos sera foram combinada com um controle padrão nucleolar positivo em várias relações (100:0, 80: 20, 50: 50, 20:80 e 0:100) e testado em substratos de convencional e engenharia (DFS70-KO) HEp-2. Barras de escala representam 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Imunofluorescência de células Hep-2, padrão reticular citoplasmático, anticorpo DFS70, resultados de microscopia.
Figura 7: DFS70 e sera de citoplasmático reticular/AMA em combinação. DFS70 monoespecíficos sera foram combinada com um controle positivo padrão mitocondrial em várias relações (100:0, 80: 20, 50: 50, 20:80 e 0:100) e testado em substratos de convencional e engenharia (DFS70-KO) HEp-2. Barras de escala representam 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Comparação de microscopia de fluorescência de células HEp-2 e DFS70-KO, analisando padrões de coloração nuclear.
Figura 8: misturado padrões (proporção de 50: 50) produzidos no convencional e substratos de ELITE de HEp-2. Diferenças entre os dois substratos são reveladas. Setas vermelhas indicam os núcleos mitóticos em células convencionais e engenharia em ambos os substratos. Para estas combinações, o padrão diferencial apresentado pela divisão do núcleo de células convencional substrato HEp-2 não é suficiente para a interpretação exata dos padrões mistos. Pode-se observar que reacções mistas de DFS70 na divisão de células podem perturbar o conjunto estabelecido de regras para interpretação da doença associada ANA padrões. Amarelas e azuis setas indicam não modificado e engenharia núcleo de células HEp-2 (KO DFS70), respectivamente. Resultados obtidos para todas as combinações testaram no substrato engenharia: diferença entre o padrão nuclear interfase pertencentes a intensidade clara não modificado células (~ 10%) e células engenharia (~ 90%) foi observado, que permitiu simultânea a detecção e confirmação do padrão DFS70. Barras de escala representam 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Padrão de ANADescrição
HomogêneaO núcleo inteiro fluoresce a uniformemente com um padrão de coloração difuso.
SalpicadoDiscreta, grossa à multa cegueta de fluorescência em todo o núcleo.  Bem malhados e grossos salpicados padrões têm sido descritos.
NucleolarOs nucléolos mancham como vários corpos sólidos ou salpicados dentro do núcleo. Os subtipos têm sido descritos anteriormente.
CentrómeroGrandes manchas de número finito. Antigénio reativo segrega com cromossomas condensadas nas células em fase de mitose.
Citoplasmático reticular/AMAO citoplasma aparece granular com coloração positiva das mitocôndrias.
DFS70Células HEp-2 de •conventional: um padrão salpicado bem denso é observado no núcleo interfásico e cromatina associada coloração é vista em núcleos mitóticos.
•Engineered KO DFS70 células: anticorpos Anti-DFS70 produzem coloração negativa
Elite de HEp-2 / DFS70 KO tem células convencionais e engenharia (DFS70 KO) na proporção de 1:9 aproximadamente. Células convencionais produzem o típico padrão de DFS70 e células projetadas produzem um padrão negativo quando reagiu com um DFS70 monoespecíficos/isolado reacções positivas.

Tabela 1: descrição dos padrões de ANA.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os auto-anticorpos para antigénios nucleares e citoplasmáticos são altamente prevalentes em doenças auto-imunes sistêmicas. Embora nenhum único ensaio fornece a melhor possível sensibilidade e especificidade, IIF por HEp-2 é amplamente considerado como um método de triagem altamente sensível e cost-effective para doenças auto-imunes sistêmicas2,3,4 . Apesar da prevalência do protocolo IIF para mais de 50 anos, a precisão do ensaio IIF é altamente dependente da habilidade do técnico, execução cuidadosa das etapas individuais do protocolo e exata interpretação dos resultados usando um bem-mantido microscópio de fluorescência. Diagnóstico de doença autoimune sistêmica não deve basear nos resultados de um único teste serológico como IIF por HEp-2.

Reconstituição de reagentes utilizando alta qualidade da água (água destilada/deionizada), uso de componentes do kit padronizado (slides com monocamadas de células HEp-2, diluente de amostra, controles positivos e negativos, pré-diluídos conjugado FITC otimizado e meio de montagem) ter um impacto positivo sobre os resultados. Ignorando a adição de controles ou amostras em poços pode encorajar falsas interpretações negativas. Secagem de slides em qualquer momento após a adição da amostra ou controle pode resultar em reações falso-positivas diferente e/ou padrões de impróprios. O tampão de lavagem muito deixou no slide ou secagem de poços slide antes da dispensação de meio de montagem pode resultar em artefatos. Adicionar uma quantidade insuficiente de meio de montagem ou gerando bolhas na superfície de slide antes de colocar uma lamela pode resultar em reações que parecem borradas ou fora de foco quando observado ao microscópio. Slides montados devem ser armazenados a 2-8 ° C e analisadas dentro da janela recomendada de tempo para minimizar os resultados falso negativos ou diferente.

Usar um microscópio de epi-fluorescente bem-mantido, que abriga uma fonte de luz LED/Hg/Xenon apropriada e componentes limpo ópticos, incluindo filtros de excitação e emissão que não sejam danificados é fundamental para obter resultados precisos do IIF. Treinamento para discriminar intensidades de reação positiva/negativa e interpretação dos testes padrões do usuário final é fundamental. IIF HEp-2 ensaios são vulneráveis a falta de padronização de procedimentos, configuração de microscópio e treinamento dos usuários finais ou habilidade. Os padrões de nomenclatura e representante do consenso e exemplos de imagens adquiridas usando vários fabricantes são disponibilizados pelo ICAP (< www.ANApatterns.org>) para fins educacionais,4. Uma árvore de classificação padrão de células HEp-2 fornecida pelo ICAP para vários padrões mitóticos, citoplasmáticos e nucleares é um recurso valioso para aprender as diferenças sutis entre vários padrões que podem parecer semelhantes aos olhos destreinados,4. Um dos principais exemplos de um padrão desafiador é o DFS70 que também carece de uma distinta associação com uma doença auto-imune, e conforme discutido nas seções anteriores este padrão é altamente prevalente em populações saudáveis5.

Dependendo do estudo, a prevalência de auto-anticorpos anti-DFS70 variam entre coortes saudáveis, ANA rastreio de populações e indivíduos positivos ANA sem evidência de doença sistêmica auto-imune9,16,20 ,30,31. Os autoanticorpos DFS70 foram relatados para ocorrer isoladamente, bem como com outros padrões de ANA associada a doença. Isolado ou padrão monoespecíficos DFS70 é relatado em 2-22% dos controles sadios mas em menos de 1% dos casos com doença reumática auto-imune32. Baseia-se estas tendências, DFS70 padrão de mono-positivo foi proposto como um critério para excluir em doenças reumáticas auto-imunes por3231,3,do Comité ICAP. O Comité ICAP, criado para promover a harmonização de nomenclatura de teste de anticorpo e interpretação dos resultados IIF HEp-2, recomenda relatórios DFS70 positividade enquanto relatórios ANA triagem resultados4.

Antes de descartar uma doença auto-imune sistêmica com base na DFS70 mono-positividade, é vital para analisar o estado dos atuais métodos de rastreio e confirmação (particularmente aquelas específicas para DFS70). Acordo entre positividade pelo IIF HEp-2 e ensaios de confirmação fase sólida ou seja ELISA DFS70, CLIA e métodos de borrão de imunoensaio/ponto de linha) variou amplamente entre vários estudos13,22,25,33 . Interpretação de IIF e teste de confirmação parâmetros que contribuem para este desacordo tem sido discutiram anteriormente5,13,34. Uma abordagem de immunoadsorption recentemente proposto para confirmação de anticorpos anti-DFS70 aborda algumas das deficiências dos ensaios de fase sólida atual (para DFS70), mas exige que os laboratórios para executar uma etapa adicional no procedimento IIF em amostras suspeitas, que aumenta o tempo de custo e turnaround por relatar resultados13. Este passo adicional não é necessário quando as células HEp-2 ELITE/DFS70 KO são utilizadas para o rastreio de rotina ANA. Isso reduz o custo total e além disso não há nenhum impacto no tempo de retorno como padrão de DFS70 é discernido na exibição inicial passo27. Uma desvantagem adicional usando o método convencional de IIF HEp-2 é que ele é incapaz de distinguir o padrão DFS70 co ocorrendo com outros ANA padrões na fase de triagem. No entanto, esta desvantagem é superada pelo uso de de células HEp-2 ELITE/DFS70 KO27.

Avaliação comparativa de HEp-2 convencional e a nova engenharia HEp-2 (HEp-2 ELITE/DFS70 KO) usando controles positivos ANA e suas combinações com um controle de DFS70 de mono-positivo, demonstrar a utilidade da capacidade do novo substrato de simultaneamente tela para ANAs e confirmar o padrão de DFS70 (Figura 1). O protocolo IIF para o novo substrato é idêntico ao método convencional de IIF HEp-2. Esquema de interpretação para padrões de ANA está associada a doença é idêntica, com excepção do padrão DFS70 (tabela 1). Interpretação dos padrões de DFS70 mono-positivo e mistos foi relativamente fácil, usando o novo método e não garante ensaios adicionais (figura 1B). Implementação do novo método no laboratório clínico simplifica o desafio associado com a interpretação de DFS70 padrão e melhora a precisão geral do rastreio, revelando mais associada a doença ANA padrões anteriormente escondidos por ANA DFS70 (misturada de padrões).

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores Kishore Malyavantham e Lakshmanan Suresh são empregados da Trinity Biotech, EUA.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos Andrew Zenger realizando experiências o IIF e coletando imagens.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
HEp-2 ELITE / DFS70-KO 12 Well Slide selado individualmente na bolsaTrinity Biotechparte do kit# 1108, 1108-120, 1108-240
Controle positivo ANATrinity Biotech parte do kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Controle positivo de anticorpo DFS70Trinity Biotechparte do kit# 1108, 1108-120, 1108-240
Controle negativoTrinity Biotechparte do kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Conjugado FITC IgG anti-humano contendo contracoloração azul de EvanTrinity Biotechparte do kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Diluente tampão parasoro Trinity Biotechparte do kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Trinity Biotechparte do kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Meio de montagemTrinity Biotechparte do kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Coverslips Parte da Trinity Biotechdo kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Células ImmuGlo ANA HEp-2 12 poços de lâmina seladas individualmente na bolsaTrinity Biotechparte do kit# 1103, 1103-240
NomeEmpresa<strong>Número de CatálogoComentários
Materiais usados no estudo, mas não fornecidos pelos kits
Microscópio fluorescente de diagnósticoNikon Eclipse 50iEquipado com uma câmera dignostica pontual, modelo 2.2.1
Câmara de incubaçãoTrinity Biotechfornecida aos clientes (sem catálogo #)
Frasco Coplinn/aMaterial de laboratório geral
Toalhas de papeln/aSuprimentos gerais de laboratório
Água destilada/deionizadan/aSuprimentos gerais de laboratório

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. American College of Rheumatology. Position Statement. Methodology of testing for antinuclear antibodies. , Available from: https://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/Methodology%20of%20Testing%20Antinuclear%20Antibodies%20Position%20Statement.pdf (2011).
  2. Meroni, P. L., Schur, P. H. ANA screening: an old test with new recommendations. Ann Rheum Dis. 69 (8), 1420-1422 (2010).
  3. Agmon-Levin, N., et al. International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies. Ann Rheum Dis. 73 (1), 17-23 (2014).
  4. Chan, E. K., et al. Report of the First International Consensus on Standardized Nomenclature of Antinuclear Antibody HEp-2 Cell Patterns 2014-2015. Front Immunol. 6, 412(2015).
  5. Malyavantham, K., Suresh, L. Analysis of DFS70 pattern and impact on ANA screening using a novel HEp-2 ELITE/DFS70 knockout substrate. Auto Immun Highlights. 8 (1), 3(2017).
  6. Sperotto, F., Seguso, M., Gallo, N., Plebani, M., Zulian, F. Anti-DFS70 antibodies in healthy schoolchildren: A follow-up analysis. Autoimmun Rev. , (2017).
  7. Ayaki, M., et al. Detection of cytotoxic anti-LEDGF autoantibodies in atopic dermatitis. Autoimmunity. 35 (5), 319-327 (2002).
  8. Ochs, R. L., et al. Autoantibodies to DFS 70 kd/transcription coactivator p75 in atopic dermatitis and other conditions. J Allergy Clin Immunol. 105 (6 Pt 1), 1211-1220 (2000).
  9. Watanabe, A., et al. Anti-DFS70 antibodies in 597 healthy hospital workers. Arthritis Rheum. 50 (3), 892-900 (2004).
  10. Yamada, K., et al. Humoral immune response directed against LEDGF in patients with VKH. Immunol Lett. 78 (3), 161-168 (2001).
  11. Seelig, C. A., Bauer, O., Seelig, H. P. Autoantibodies Against DFS70/LEDGF Exclusion Markers for Systemic Autoimmune Rheumatic Diseases (SARD). Clin Lab. 62 (4), 499-517 (2016).
  12. Ochs, R. L., et al. The significance of autoantibodies to DFS70/LEDGFp75 in health and disease: integrating basic science with clinical understanding. Clin Exp Med. 16 (3), 273-293 (2016).
  13. Bizzaro, N., et al. Specific chemoluminescence and immunoasdorption tests for anti-DFS70 antibodies avoid false positive results by indirect immunofluorescence. Clin Chim Acta. 451 (Pt B), 271-277 (2015).
  14. Bizzaro, N., et al. Antibodies to the lens and cornea in anti-DFS70-positive subjects. Ann N Y Acad Sci. 1107, 174-183 (2007).
  15. Daniels, T., et al. Antinuclear autoantibodies in prostate cancer: immunity to LEDGF/p75, a survival protein highly expressed in prostate tumors and cleaved during apoptosis. Prostate. 62 (1), 14-26 (2005).
  16. Dellavance, A., et al. The clinical spectrum of antinuclear antibodies associated with the nuclear dense fine speckled immunofluorescence pattern. J Rheumatol. 32 (11), 2144-2149 (2005).
  17. Gundin, S., et al. Measurement of anti-DFS70 antibodies in patients with ANA-associated autoimmune rheumatic diseases suspicion is cost-effective. Auto Immun Highlights. 7 (1), 10(2016).
  18. Kang, S. Y., Lee, W. I. Clinical significance of dense fine speckled pattern in anti-nuclear antibody test using indirect immunofluorescence method. Korean J Lab Med. 29 (2), 145-151 (2009).
  19. Lee, H., Kim, Y., Han, K., Oh, E. J. Application of anti-DFS70 antibody and specific autoantibody test algorithms to patients with the dense fine speckled pattern on HEp-2 cells. Scand J Rheumatol. 45 (2), 122-128 (2016).
  20. Mariz, H. A., et al. Pattern on the antinuclear antibody-HEp-2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear antibody-positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases. Arthritis Rheum. 63 (1), 191-200 (2011).
  21. Marlet, J., et al. Thrombophilia Associated with Anti-DFS70 Autoantibodies. PLoS One. 10 (9), e0138671(2015).
  22. Mercado, M. V., et al. Detection of autoantibodies to DSF70/LEDGFp75 in Mexican Hispanics using multiple complementary assay platforms. Auto Immun Highlights. 8 (1), 1(2017).
  23. Muro, Y., Sugiura, K., Morita, Y., Tomita, Y. High concomitance of disease marker autoantibodies in anti-DFS70/LEDGF autoantibody-positive patients with autoimmune rheumatic disease. Lupus. 17 (3), 171-176 (2008).
  24. Muro, Y., Sugiura, K., Nakashima, R., Mimori, T., Akiyama, M. Low prevalence of anti-DFS70/LEDGF antibodies in patients with dermatomyositis and other systemic autoimmune rheumatic diseases. J Rheumatol. 40 (1), 92-93 (2013).
  25. Mutlu, E., Eyigor, M., Mutlu, D., Gultekin, M. Confirmation of anti-DFS70 antibodies is needed in routine clinical samples with DFS staining pattern. Cent Eur J Immunol. 41 (1), 6-11 (2016).
  26. Okamoto, M., et al. Autoantibodies to DFS70/LEDGF are increased in alopecia areata patients. J Autoimmun. 23 (3), 257-266 (2004).
  27. Pazini, A. M., Fleck, J., dos Santos, R. S., Beck, S. T. Clinical relevance and frequency of cytoplasmic and nuclear dense fine speckled patterns observed in ANA-HEp-2. Rev Bras Reumatol. 50 (6), 655-660 (2010).
  28. Schmeling, H., et al. Autoantibodies to Dense Fine Speckles in Pediatric Diseases and Controls. J Rheumatol. 42 (12), 2419-2426 (2015).
  29. Wiik, A. S., Hoier-Madsen, M., Forslid, J., Charles, P., Meyrowitsch, J. Antinuclear antibodies: a contemporary nomenclature using HEp-2 cells. J Autoimmun. 35 (3), 276-290 (2010).
  30. Mahler, M., Fritzler, M. J. The Clinical Significance of the Dense Fine Speckled Immunofluorescence Pattern on HEp-2 Cells for the Diagnosis of Systemic Autoimmune Diseases. Clin Dev Immunol. 2012, 494356(2012).
  31. Mahler, M., et al. Anti-DFS70/LEDGF Antibodies Are More Prevalent in Healthy Individuals Compared to Patients with Systemic Autoimmune Rheumatic Diseases. J Rheumatol. 39 (11), 2104-2110 (2012).
  32. Conrad, K., Rober, N., Andrade, L. E., Mahler, M. The Clinical Relevance of Anti-DFS70 Autoantibodies. Clin Rev Allergy Immunol. , (2016).
  33. Miyara, M., et al. Clinical Phenotypes of Patients with Anti-DFS70/LEDGF Antibodies in a Routine ANA Referral Cohort. Clin Dev Immunol. 2013, 703759(2013).
  34. Bizzaro, N., Tonutti, E., Villalta, D., et al. Recognizing the dense fine speckled/lens epithelium-derived growth factor/p75 pattern on HEP-2 cells: not an easy task! Comment on the article by Mariz et al. Arthritis Rheum. 63 (12), 4036-4037 (2011).

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Pontilhado Fino Denso 70Substrato HEp 2Imunofluoresc ncia IndiretaPadr es Monoespec ficosPadr es MistosMicroscopia FluorescenteAnticorpos AntinuclearesDist rbios Autoimunes

Artigos relacionados