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Expressão gênica em camadas de aleurona cevada bombardeado com maior Throughput de medição

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DOI:

10.3791/56728

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30 de março de 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Colby College

Neste artigo

Resumo

Um protocolo melhorado é apresentado para a medição transitória da expressão do gene do repórter construções nas células de aleurona de cevada após o bombardeio de partículas. A combinação de grãos automatizado moagem com ensaios enzimáticos de placa de 96 poços fornece alto throughput para o procedimento.

Resumo

A camada de aleurona de grãos de cevada é um importante modelo sistema para expressão gênica hormônio-regulada em plantas. Nas células de aleurona, genes necessários para a germinação ou desenvolvimento inicial de plântulas são ativados por Giberelina (GA), enquanto os genes associados com respostas de estresse são ativados pelo ácido abscísico (ABA). Os mecanismos de sinalização GA e ABA podem ser interrogados por introduzir construções de gene repórter em células de aleurona através do bombardeamento de partículas, com a expressão transitória resultante medida através de ensaios enzimáticos. Um protocolo melhorado é relatado que parcialmente automatiza e agiliza a etapa de homogeneização de grão e os ensaios enzimáticos, permitindo que a taxa de transferência significativamente mais do que os métodos existentes. Homogeneização das amostras de grãos é realizada usando um homogeneizador de automatizado, e ensaios de GUS (β-glucuronidase) são realizados através de um sistema de placa de 96 poços. Resultados representativos, usando o protocolo sugerem que a atividade da fosfolipase D pode desempenhar um papel importante na ativação da expressão do gene HVA1 pela ABA, através do fator de transcrição TaABF1.

Introdução

A camada de aleurona de cevada é um sistema bem estabelecido de modelo para o estudo da expressão gênica de hormônio-regulada em plantas1. Em particular, um número de genes necessários para a germinação ou desenvolvimento inicial de plântulas é ativado por Giberelina (GA), enquanto os genes associados com respostas de estresse são ativados pelo ácido abscísico (ABA). O GA e ABA vias de sinalização estão interligados, como a expressão de alguns genes GA-ativado é inibida pela ABA e vice-versa1.

Uma estratégia valiosa para a compreensão que do papel dos actores particulares na GA/ABA sinalização foi a introdução das construções de gene effector através do bombardeamento de partículas, seguido pela expressão transiente de construções de repórter que permitem que o efeito resultante na expressão do gene a jusante para ser determinado. O uso de genes repórter como GUS (β-glucuronidase) ou Luciferase permite a medição quantitativa e sensível da expressão do gene especificamente dentro das células que receberam a construção effector. Por exemplo, a introdução de uma construção effector codificação o fator de transcrição TaABF15,6 estabeleceu que genes induzida por ABA como HVA1 são induzidos por TaABF1, enquanto genes GA-induzido, como Amy32b são reprimidos. Bombardeio de partículas como uma estratégia experimental serviu por vários laboratórios para investigar os diversos aspectos de sinalização GA/ABA. Esse trabalho levou à identificação de elementos do promotor importantes para a ativação de GA-induzido2 e genes induzida por ABA3e a descoberta de proteínas quinases4 e fatores de transcrição5 que regulam o expressão destes genes.

O existente protocolos2,3,4,5,6 para o bombardeamento de partículas e mensuração subsequente da expressão do gene transiente são bastante trabalhoso, como cada conjunto de bombardeados mal de grãos é homogeneizado à mão em um almofariz e um pilão e os ensaios enzimáticos são realizados individualmente. Este manuscrito relata um protocolo melhorado que parcialmente automatiza e agiliza a etapa de homogeneização e o GUS ensaios para permitir que a taxa de transferência significativamente mais, permitindo um maior número de tratamentos a ser testado no mesmo experimento, e/ou a inclusão de mais repetições para cada tratamento obter mais resultados estatisticamente robustos. Resultados representativos são mostrados para a expressão de construções HVA1 e Amy32b do repórter, regulados pelo factor de transcrição TaABF1, bem como pelo GA, ABA e outras moléculas reguladoras.

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Protocolo

1. preparação do efetor e Gene repórter constrói

  1. Construa construções efetoras que empregam um promotor constitutivo (por exemplo, milho ubiquitin, UBI) a expressão de unidade de um frame de leitura aberto desejado. Por exemplo, construa um plasmídeo que contém UBI::TaABF1 a expressão constitutiva forte de unidade de TaABF15.
  2. Construa construções de repórter que incluem o promotor, cuja actividade está a ser medido, colocados a montante de um frame de leitura aberto, tais como GUS. Por exemplo, construa um plasmídeo que contém HVA1::GUS para medir a expressão do promotor HVA1 2,5.
  3. Construir uma construção de controle interno (por exemplo, UBI::luciferase).
  4. Usando uma coluna de ligação de sílica protocolo (consulte Tabela de materiais), preparar o plasmídeo de alta qualidade para cada uma das construções de gene necessário. Usando espectroscopia ultravioleta (veja a Tabela de materiais), cuidadosamente medir a concentração de cada preparação do plasmídeo.

2. preparação de grãos de cevada para bombardeio

  1. Configurar uma planilha (ver Figura 1 para obter um exemplo) indicando o plasmídeo que será bombardeado, os tratamentos hormonais adequados e outras informações relevantes para cada tratamento que farão parte do experimento.
  2. Usando uma placa de corte e uma lâmina de barbear estéril, cortar os embriões a partir de grãos de cevada Himalaya (40 para cada tratamento incluído no experimento). Exclua os grãos que são descoloridos ou substancialmente menor do que a média.
  3. Coloque todos os grãos de embryoless em um tubo de 50 mL. Adicione 40 mL de água e pedra por 10 minutos.
  4. Despeje a água com cuidado (para evitar a perda de grãos) e adicionar 40 mL de água sanitária 10%. Rocha por 20 minutos.
  5. Deite fora a água sanitária e adicionar 40 mL de água estéril. Pedra por 5 minutos. Repeti esta lavagem de água estéril quatro vezes mais.
  6. Adicionar 40 mL de solução de absorver (succinato de sódio de 20 mM, 20 mM de cloreto de cálcio, pH 5,0) e 40 μL de solução cloranfenicol (10 mg/mL).
  7. Transferência da solução (com cloranfenicol) absorver a maioria do tubo em uma placa de Vermiculite (ver Tabela de materiais). Depois transferi os grãos para a superfície do papel filtro molhado na placa de vermiculita. Espalhe os grãos uniformemente. Despeje em suficiente imbibing solução para manter os grãos parcialmente (mas não completamente) submerso. Coloque a tampa na parte superior da placa de vermiculita.
  8. Incube os grãos de embryoless a 24 ° C, durante cerca de 48 h com iluminação fluorescente. Adicione solução absorvendo adicionais conforme necessário.
  9. Abrir-se um prato de petri de plástico 90mm e despeje 20 mL da solução de absorver para o prato em si e 20 mL a tampa invertida. Adicione 20 μL de cloranfenicol (10 mg/mL) a cada um. Esterilize dois pares de pinças de ponta fina, mergulhando-os em álcool.
  10. Coloque alguns grãos de embryoless na tampa da caixa de Petri. Usando a pinça, remova suavemente a camada de sementes (transparente) de cada grão. Ao remover o revestimento de semente do lado liso do grão, não danificam células subjacentes (aleurona). Transfira o grão descascado para a placa de Petri contendo solução absorvendo.
  11. Depois de descascar o revestimento de semente de todos os grãos, devolvê-los à placa de vermiculita. Incube os grãos descascados embryoless a 24 ° C por 16-20 horas.
  12. Imediatamente antes de usar os grãos para bombardeio, remova a umidade da superfície sacudindo-os entre papéis de filtro em um prato de petri.

3. preparação do ADN do plasmídeo para bombardeio

  1. Rotule um tubo de 1,5 mL para cada tratamento que será incluído no experimento de bombardeio. A cada tubo, adicionar 2,5 µ g de UBI:: plasmídeo de controle interno deluciferase , 2,5 µ g de um plasmídeo do repórter GUS e a quantidade desejada (normalmente 0,025 µ g de 2,5 µ g) de um plasmídeo effector. Adicione água para trazer o volume total de 5 µ l.
  2. Prepare-se 1,6 µm ouro microcarriers (ver Tabela de materiais) seguinte publicado protocolos6.
  3. Para cada tratamento, adicione 50 µ l de suspensão microcarriers no tubo de 1,5 mL contendo Plasmídeo. Revesti o microcarriers com o plasmídeo de acordo com o protocolos6 do fabricante.
  4. Na etapa final, quando os plasmídeo-revestido microcarriers são suspensos em 48 µ l 100% de etanol, pipetar 8 μL da suspensão microcarriers para cada um dos cinco macrocarriers e deixe-os ao ar seco.

4. partícula bombardeio de grãos de cevada Embryoless

  1. Configurar o aparelho de bombardeio de partículas (ver Tabela de materiais)6.
  2. Coloque um disco de ruptura de 1550 psi na retenção PAC e montá-lo no instrumento.
  3. Coloque um macrocarrier que contém a combinação desejada de plasmídeo (juntamente com uma tela de parar) o assembly de lançamento de microcarrier. Introduza o conjunto na ranhura superior da câmara de bombardeio. Definir a distância entre o disco de ruptura, mantendo a tampa e a tampa de cobertura macrocarrier à distância padrão (6 mm) e coloque o suporte de tela de parar na posição do meio (padrão), permitindo uma distância de viagem macrocarrier de 11 mm (Figura 2A).
  4. Arrume 8 grãos embryoless em um padrão radial apertado (com as extremidades mais finas, apontando para dentro) em um círculo de papel de filtro que está pregado no chão para a tampa de um prato de petri de 90 mm (ver Figura 2B).
  5. Coloque o prato com os grãos dentro da câmara de bombardeio, a uma distância de 6 cm a partir da tela de parar.
  6. Evacuar a câmara de bombardeio para 95 kPa e então bombardeia a amostra.
  7. Depois de lançar o vácuo, transferi os grãos bombardeados para um prato de petri 60mm etiquetados contendo 4 mL de solução absorvendo contendo 1 mg/ml de cloranfenicol.
  8. Repita até que todos os bombardeamentos foram concluídos. Incube (em uma plataforma de agitação a 100 rpm) a 24 ° C por 24 horas.

5. extração de proteína solúvel de grãos bombardeados

  1. Usando a pinça, remova os 8 grãos bombardeou um prato de petri 60mm e exterminá-los seco sobre papel absorvente. Divida os grãos em dois tubos etiquetados 2,0 mL (4 grãos por tubo) cada um contendo 800 μL tampão de moagem (100mm at fosfato pH 7,2, 5 mM DTT, 10 µ g/mL leupeptin, 20% de glicerol) e um grânulo de aço inoxidável de 5mm. Repita este processo para todos os de grãos bombardeados.
  2. Coloque os dois racks de homogeneizador do grânulo (até 48) tubos de 2,0 mL (ver Tabela de materiais). Monte as prateleiras do homogenizador.
  3. Agite as amostras em 30 Hz durante 3 minutos.
  4. Retire os cestos homogenizador do homogenizador e colocá-los no gelo (5 min) para re-fixe as amostras.
  5. Monte os racks volta do homogenizador - na orientação oposta. Agite as amostras novamente a 30 Hz durante 3 minutos.
  6. Legal os racks no gelo, em seguida, repita passos 5.3 a 5.5. Isto irá adicionar um total de 12 minutos de agitação.
  7. Centrifugue os extratos de grão a 16.000 x g a 4 ° C por 10 minutos.
  8. Imediatamente após a centrifugação, decantar os sobrenadantes claros em um segundo conjunto de tubos do microcentrifuge. Dar a cada tubo um vórtice rápido. Armazene os tubos em gelo.
  9. Depois de transferir o sobrenadante, recupere as esferas de aço de pelotas para que eles podem ser lavados e reutilizados.

6. medida da atividade de Luciferase de extratos de grão

  1. Para cada tubo de extracto de grãos a ser analisada, prepare um tubo de ensaio de vidro 12 x 75 mm contendo 200 μL de mistura de ensaio Luciferase (45 mM Tris sulfato de pH 7,7, 15 mM MgCl2, 20 mM DTT, 1,5 mM EDTA, Luciferina de 1 mM, 1 mM ATP).
  2. Adicione 100 μL do primeiro extracto de grãos para o primeiro tubo de ensaio. Vórtice rapidamente para misturar bem. Imediatamente , coloque o tubo no suporte do tubo do luminómetro e feche a porta. Quando a medição estiver concluída, retire o tubo do luminómetro – deixando a porta aberta para a colocação do tubo próxima.
  3. Repita este processo até que todas as amostras foram medidas.

7. medição de GUS atividade de extratos de grão

  1. Adicione 200 μL de tampão de ensaio de GUS (50mm at fosfato pH 7,2, 2,5 mM 4-methylumbelliferyl - D-glicuronídeo, 10 mM DTT, 2 mM EDTA, 10 µ g/mL leupeptin, 20% de metanol, 0,02% de azida de sódio) para cada poço de uma placa bem 96.
  2. Colocar 50 μL de cada extrato de grão para a correspondente bem. Misture com a ponta após a adição. Sele o topo com película de vedação.
  3. Incube a placa bem 96 a 37 ° C, no escuro por 20 horas.
  4. Centrifugue a placa bem 96 a 4.000 x g a 4 ° C durante 10 minutos e coloque-o no gelo.
  5. Adicione 250 μL de 0,2 M Na2CO3 para cada poço de uma placa bem preto 96.
  6. Adicionar 6,25 μL de cada mistura de ensaio centrifugada GUS para a correspondente bem (contendo 0,2 M Na2CO3) do negro 96 placa bem. Misture com a ponta após a adição. Inclua poços com 6,25 μL de 10 μM 40 μM e 100 μM 4-methylumbelliferone como padrões.
  7. Coloque a placa preta em um dados de placa e ler a fluorescência de methylumbelliferone. Fazer as leituras em um comprimento de onda de excitação de 360 nm e um comprimento de onda de emissão de 460 nm. Defina o ganho do instrumento tal que um bem contendo 6,25 μL de 40 μM 4-methylumbelliferone e 250 μL de 0,2 M Na2CO3 dão uma leitura de 1000 unidades de fluorescência.

8. análise de dados

  1. Insira os valores para a luciferase e ensaios de GUS em uma planilha. Exclua da consideração qualquer amostra com uma leitura do luciferase inferior a luminescência relativa de 20.000 unidades de s-1, já que indica que as construções do gene não foram entregue com êxito para as células de aleurona.
  2. Para cada grão bombardeado com sucesso o extrato (representando um grupo de quatro grãos embryoless), calcular a expressão de GUS normalizada a partir dos dados brutos de GUS e luciferase como segue: normalizado GUS = [(expressão de GUS - GUS em branco) x (2.000.000)] / (luciferase expressão – luciferase em branco).
    Nota: Isto normaliza a quantidade de atividade de GUS, o que poderia ter sido observado em um bombardeio que deu uma leitura de luciferase de 2.000.000.
  3. Relatar o nível relativo de expressão de uma construção de repórter especial na presença de construções de efetor ou tratamentos hormonais, sendo testados, comparando o nível de expressão na ausência de efetores ou hormônios.

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Resultados

A técnica descrita aqui pode ser usada para introduzir qualquer teste de construção de gene em células de aleurona de grãos de cevada. O nível de expressão do gene de teste pode então ser convenientemente medidos (Figura 2). O protocolo de taxa de transferência superior descrito aqui grandemente aumenta a eficiência da moagem de sementes e etapas de ensaio enzima. Este método tem sido usado para avaliar a capacidade da transcrição fator TaABF1

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Discussão

A introdução do gene effector constrói através do bombardeamento de partículas, seguido pela expressão transiente de construções de repórter é uma estratégia valiosa para dissecar o papel dos actores particulares na GA/ABA sinalização e no gene resultante hormônio-regulada expressão.
No entanto, os protocolos existentes para a realização de tais experiências em cevada aleurona células2,3,4,5...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores Obrigado Greyson Butler e Margaret Barrett para ajudar na realização dos experimentos, Judy Stone para aconselhamento sobre homogeneização de grão e Lynn Hannum para aconselhamento sobre fluorometry. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation (IOB 0443676), por um prêmio de desenvolvimento institucional (ideia) do Instituto Nacional de General Medical Ciências, dos institutos nacionais de saúde, sob número de concessão P20GM0103423 e por concessões do a divisão de Colby College de ciências naturais.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Kit Maxiprep de plasmídeo HP GeneElute SigmaNA0310-1KT
UV-vis espectrofotômetroNanodropND-1000
grãos de cevada do Himalaia//Uma variedade de cevada sem casca (armazene no escuro a 4° C)
succinato de sódioSigmaS2378Reagente para solução de absorção
de cloreto de cálcio (di-hidratado)FisherC79-500para solução de absorção
Solução de absorção caseira/20 mM de succinato de sódio, 20 mM de cloreto de cálcio, pH 5,0. Esterilize em autoclavagem antes de usar.
cloranfenicolSigmaC0378Prepare uma solução estoque de 10 mg / mL em etanol a 70%.
vermiculitaFisherNC0430369Usado para placas de vermiculita.
círculos de papel de filtro (90 mm)Whatman1001 090Usado para vermiculita e para preparação de grãos pré-bombardeio
Placas de vermiculitacaseiras/Adicione 50 mL de vermiculita a uma placa de Petri de vidro. Coloque um círculo de papel de 90 mm em cima da vermiculita. Autoclave.
fórceps (fino apontado)Fisher13-812-42Usado para remover o tegumento de grãos de cevada.
fórceps (ponta ultrafina)Fisher12-000-122Usado para remover o tegumento de grãos de cevada.
microportadores de ouro (1,6 μ m)BioRad1652264
macrotransportadoresBioRad1652335
cloreto de cálcio (di-hidratado)FisherC79-500Prepare uma solução estoque de 2,5 M e armazene alíquotas de 1 mL a -20 graus C.
espermidinaSigmaS0266Prepare uma solução estoque de 100 mM e armazene 500 μ L alíquotas em -20° C (uso dentro de 2 meses).
discos de ruptura (1550 psi)BioRad1652331
telas de parada BioRad1652336
suportes de macroportadoresBioRad1652322
Sistema de entrega de partículas biolísticasBioRadPDS-1000/He
fosfato de sódio monobásico monohidratadoSigmaS9638Reagente para fosfato de sódio 1M pH 7,2
fosfato de sódio dibásicoSigmaS9763Reagente para fosfato de sódio 1M pH 7,2
1M fosfato de sódio pH 7,2caseiroCombine 6,9 g de fosfato de sódio monobásico monohidratado com 7,1 g de fosfato de sódio dibásico. Adicione água a 100 mL. Adicione NaOH para obter pH 7,2.
ditiotrietólito (DTT)Sigma43819Dissolver em água a 1 M. Armazenar a -20° em alíquotas de 1 mL.
leupeptinaSigmaL2884Dissolver em água a 10 mg/ml. Armazene a -20°
C.glicerolSigmaG5516Prepare uma solução a 50% em água.
Tampão de moagemcaseiro/Combine 10 mL de fosfato de sódio 1 M pH 7,2, 500 μ L de 1 M TDT, 100 μ L de 10 mg/mL de leupeptina e 40 mL de glicerol a 50%. Adicione água a 100 mL.
contas de aço inoxidável (5 mm)Qiagen69989
Tubos de 2,0 mLEppendorf22363352Este modelo específico de tubo é recomendado para uso com o homogeneizador.
homogeneizador de esferas (TissueLyser)Qiagen85210
Tubos de ensaio de vidro de 12 mm x 75 mmFisher
luciferinaGoldbioLUCK-100Prepare uma solução estoque de 25 mM e armazene alíquotas de 1 mL a -20 graus C.
ATPSigmaA7699Prepare uma solução de estoque de 100 mM e armazene 250 μ L alíquotas em -20°  C.
SigmaT1503de base Trispara sulfato de Tris 1M pH 7,7.
ácido sulfúricoSigma258105Reagente para 1M Tris sulfato pH 7,7.
1M Tris sulfato pH 7,7caseiroDissolva 12,1 g de base Tris em 100 mL de água. Ajuste o pH para 7,7 com ácido sulfúrico.
cloreto de magnésioSigmaM9397Dissolver em água a 2 M.
Tampão de Ensaio de Luciferase (LAB)feito em casa/Combine 3 mL de 1 M Tris sulfato pH 7.7, 500 μ L de cloreto de magnésio 2 M, 1 mL de 1 M DTT e 200 μ L de 0,5 M EDTA. Adicione água a 50  Ml.
Mistura de Ensaio de Luciferasefeita em casa/Combine 15 mL de LAB, 800 μ L de 25 mM de luciferina, 200 μ L de 100 mM de ATP e 4 mL de água. Isso faz uma mistura de ensaio suficiente (20  mL) para 100 ensaios de luciferase.
luminômetro (Sirius)Berthold/
4-metilumbeliferil-β-D-glucuronídeo (MUG)GoldbioMUG1Dissolver em DMSO a 100 mM.
azida de sódioSigmaS8032Prepare uma solução estoque a 2% em água e armazene alíquotas de 1 mL a -20 graus C.
Placas de 96 poços (padrão)Tampão
GUSfeito em casa/Combine 2,5 mL de MUG, 5 mL de fosfato de sódio 1 M pH 7,2, 400 μ L de 0,5 M EDTA, 1 mL de 1 M DTT, 100 μ L de 10 mg/ml de leupeptina, 20 mL de metanol e 1 mL de azida sódica a 2%. Adicione água a 100 mL.
Filme de vedação TempPlateUSA Scientific2921-1000
placas de 96 poços (preto)Costar3916
carbonato de sódioSigmaS7795Prepare uma solução de 200 mM em água.
4-metilumbelliferonaSigmaM1381Prepare um 100 μ M em água. Congele alíquotas de 1 mL a -20°  C.
leitor de fluouresence de microplacasBio-TekFLX-800
Reagente /Reagente / de ensaio Fisher 12565501

Referências

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