Um método eficiente em Vitro transposição por um sistema de beleza dormindo Transcriptionally regulado empacotado em um vetor de Lentivirus defeituoso de integração

Resumo

Este protocolo descreve um método para alcançar a integração estável de um gene de interesse no genoma humano pelo sistema transcriptionally regulado de Bela adormecida . Preparação da integração dos vetores de Lentivirus defeituosos, a transdução em vitro de células humanas e o ensaio molecular em células transduzidas são relatados.

Resumo

O transposon Bela adormecida (SB) é um sistema de integração não-virais com eficácia comprovada para transferência genética e genômica funcional. Para otimizar a maquinaria de transposon SB, uma transposase hiperativo transcriptionally regulado (SB100X) e baseada em T2 transposon são empregados. Normalmente, o transposase transposon providenciam e transitoriamente por transfeccao Plasmideo e SB100X expressão é impulsionado por um promotor constitutivo. Aqui, descrevemos um método eficiente para entregar os componentes SB em células humanas que são resistentes a vários métodos de Transfeccao de física e química, para controlar a expressão de SB100X e integrar estàvel um gene de interesse (GOI) através de um "cortar e colar" SB mecanismo. A expressão de transposase hiperativo é rigidamente controlada pela sistema de Tet-ON, amplamente utilizado para controlar a expressão do gene desde 1992. O gene de interesse é ladeado por repetições invertidas (IR) do transposon T2. Ambos os componentes do SB são embalados em integração defeituosos vetores Lentivirus transitoriamente produzidos nas células HEK293T. Células humanas, ou linhas de célula ou células primárias do tecido humano, estão em vitro transitoriamente transfectadas com vetores virais. Após adição de doxiciclina (dox, tetraciclina analógica) no meio de cultura, um ajuste fino de expressão transposase é medido e resulta em uma integração duradoura do gene de interesse no genoma das células tratadas. Este método é eficiente e aplicável para a linha de celular (por exemplo, as células HeLa) e células primárias (por exemplo, queratinócitos primárias humanas) e, portanto, representa uma ferramenta valiosa para a engenharia genética e a transferência do gene terapêutico.

Introdução

O hiperativo transposase SB100X acoplado ao transposon baseada em T2 já foi usado no gene pré-clínicos terapia aplicações^1,2,3, genoma modificações^4,5, e pluripotentes induzidas células-tronco (iPSC) reprogramação^6,7. Normalmente, os componentes de SB transitoriamente são fornecidos pelo transfeccao Plasmideo e um forte promotor constitutivo conduz a expressão do transposase. No entanto, apesar dos métodos aperfeiçoados de novos do transfection, entrega do doi....

Protocolo

1. os plasmídeos empregados

Nota: Plasmídeo pCCL-PGKrtTA2^S-M2 foi gentilmente fornecidas pelo Prof Zappavigna (Universidade de Modena e Reggio Emilia, Módena, Itália). O plasmídeo pCMVSB100X carregando a sequência de código de transposase hiperativo e plasmídeo de transposon de pT2/BH foram gentilmente cedidos pelo Prof Z. Ivics (Instituto de Paul Ehrlich, Langen, Alemanha) e Prof Z. Izvak (Max Delbruck centro de Medicina Molecular, Berlim, Alemanha).

1. Para todos os clonagem em Escherichia Coli (e. coli), siga a estratégia de clonagem do processo de escolha e a enzima de restrição ou amplificação por PC....

Resultados

Usar o procedimento apresentado aqui, três vectores IDLV, carregando os componentes SB regulamentados (SB100X, rtTA2^S-transposon M2 e T2-GFP) foram embalados e costumava entregar eficientemente e firmemente, regular o sistema de SB em células humanas. A figura 1A mostra um esquema para em vitro transdução de células HeLa, que foi realizado para avaliar o Regulamento transcriptional de transposase SB com a melhor combinação de dose de dois .......

Discussão

Aqui, descrevemos uma metodologia amplamente acessível para integrar estàvel um GOI no genoma das células alvo por Bela adormecida-mediada por transposição. Embora o sistema SB foi desenvolvido para fornecer um método nonviral para edição de genoma, entrega eficiente da maquinaria integração (transposase e T2 transposon) é obrigatória. Portanto, para usar o sistema SB dificilmente transfectable as células primárias, uma viral entrega de componentes de SB foi perseguida nos últimos anos¹⁰<.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Dulbecco' s Águia modificada' s meio com 4,5g/L de glicose sem L-Glutamina	Lonza	BE12-614F	Meio de cultura celular.
HyClone Fetal Bovine Serum (EUA), caracterizado	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.03	Soro usado HEK293T cultura de células para produção de partículas lentivirais.
Penicilina 10.000 UI/ml Estreptomicina 10.000 UI/ml	Lonza	DE17-602E	Reagentes para meio de cultura celular.
L-Glutamina 200mM	Lonza	BE17-605E	Reagente para meio de cultura celular.
Reagente de cloreto de sódio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	para preparação HBS 2X.
Tampão HEPES, estoque de 1M em solução salina normal	Lonza	BE17-737E	Reagente para preparação HBS 2X.
Hidrogenofosfato dissódico di-hidratado (Na2HPO4· 2H2O), reagente 99,5%	Merck	106580	para preparação HBS 2X.
Ácido clorídrico - Reagente ACS 37% (HCl)	Reagente 320331 Sigma-Aldrich		para preparação HBS 2X.
Água estéril para injeção	Fresenius Kabi-Reagent		para preparação HBS 2X.
0,45 µ m Filtro PESS	Whatman	10462100	Filtros usados para remover detritos celulares do sobrenadante viral.
Tubos de Beckman polialômeros	Beckman Coulter	326823	Tubos para concentração de vetores IDLV por ultracentrifugação.
PBS-1X sem Ca, Mg	Lonza	BE17-516F	Tampão para lavagem celular e ressuspensão de partículas lentivirais.
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	(opcional) Tampão para ressuspensão de partículas lentivirais.
Kit de imunocaptura HIV-1 Gag p24	Kit de NEK50001KT Perkin Elmer		para titulação de partículas IDLV.
Reagente de 107689 Polybrene	Sigma-Aldrich		para aumentar a eficiência da transdução.
Tripsina (10X) 2,5% em HBSS sem Ca, Mg	GIBCO	BE17-160E	Reagente para separar células HeLa (solução estoque, a ser diluída).
Sal dissódico do ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)	100938B	Reagente AnalaR BDH	para preparação de solução de trabalho de tripsina.
0,5% de tripsina-EDTA, sem vermelho de fenol (10X)	GIBCO	15400-054	Reagente para separar queratinócitos (solução estoque, a ser diluída).
Soro bovino doador, origem neozelandesa	GIBCO	16030-074	Soro para cultura de células 3T3-J2 de camundongo suíço (camada alimentadora).
Presunto' s Meio F12	GIBCO	21765	Meio para queratinócitos.
Soro fetal bovino	Lonza	DE14-801F	Soro para meio de cultura de células HeLa.
Soro bovino fetal, qualificado, origem australiana	GIBCO	10099-141	Soro para meio de cultura de queratinócitos primários humanos.
Insulina do pâncreas bovino	Reagentes Sigma-Aldrich	I5500	para crescimento de queratinócitos.
Adenina	VWR	1152-25	Reagentes para o crescimento de queratinócitos.
Reagentes de hidrocortisona	VWR	3867-1	para crescimento de queratinócitos.
Toxina da cólera de Vibrio cholerae	Sigma-Aldrich	C8052	Reagentes para crescimento de queratinócitos.
Triiodotironina	Sigma-Aldrich	T5516	Reagentes para crescimento de queratinócitos.
biológicos	GF-010-9	EGF	para o crescimento do queratinócito.
Anticorpo monoclonal APC-conjugado do anti-alimentador do rato	Miltenyi Biotech	130-096-099	Para rotular a camada do alimentador.
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	Kit de purificação de RNA.
SuperScript III Transcriptase reversa	Life Technologies	18080051	kit de transcriptase reversa.
Mistura de desoxinucleotídeos, 10 mM (dNTP)	Sigma-Aldrich	D7295	para PCR semiquantitativo.
Água destilada (qualquer) sem DNase / RNase ultrapura			- reagente para PCR semiquantitativo e para qRT-PCR.
GoTaq G2 Polimerase de Partida a Quente	Promega	M740B	Taq polimerase.
Agarose, para biologia molecular	Reagente Sigma-Aldrich	A9539	para eletroforese em gel de agarose.
Tampão TBE UltraPure, 10X	Invitrogen	15581028	Reagent para eletroforese em gel de agarose, a ser diluído (1X) em ddH2O.
Sigma-Aldrich	E1510	de brometo de etídio	para eletroforese em gel de agarose.
Doxiciclina	Sigma-Aldrich	D-9891	medicamento para induzir a expressão de transposase em células HeLa e em queratinócitos
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystem	4304437	TaqMan Universal PCR Master Mix incluindo primers e sonda.
Tubo de centrífuga de polipropileno de alta clareza de 15mL, fundo cônico, com tampa de rosca de vedação de cúpula,	de 352096	Falcon Corning	para coleta de células e preparação de diluição vetorial.
Placa de cultura de células tratada com TC de 150 mm com grade de 20 mm, Placa de	estéril Falcon Corning	353025	para produção viral.
Placa de cultura de células multipoços tratadas com TC de fundo plano transparente de 6 poços, com tampa, embalada individualmente, placa de	de	de 353046 falcão	para HeLa e transdução de queratinócitos primários humanos.
Tubos de microcentrífuga Safe-Lock, volume 1,5 mL	Eppendorf	0030 120.086	Tubos para preparação de diluição.
Tubos de microcentrífuga Safe-Lock, volume 2 mL	Eppendorf	0030 120.094	Tubos para preparação de diluição.
Tubos de PCR de 0,2 ml com tampas planas, RNase, DNase, DNA e inibidores de PCR (	qualquer)	-	tubos para PCR semiquantitativo.
Placa de reação óptica rápida de 96 poços MicroAmp com código de barras, 0,1 mL	Applied Biosystem	4346906	96 poços para qRT-PCR.
Tubo de poliestireno de fundo redondo de 5mL, sem tampa	BD Falcon	352052	Tubes para aquisição de citometria de fluxo.
Pipetas sorológicas descartáveis, poliestireno, embaladas individualmente, estéreis (diferentes volumes)	(qualquer)	-	pipetas para aplicações de cultura de tecidos estéreis.
Pontas de filtro, estéreis e livres de RNase, DNase, DNA e pirogênio (diferentes volumes)	(qualquer)	-	Pontas de filtro para colture de tecido estéril e aplicações de biologia molecular.
Medidor de pH	(qualquer)	-	Equipamento para medição de pH HBS 2X.
Termociclador PCR	(qualquer)	-	Equipamento para PCR semiquantitativo.
Equipamento de eletroforese em gel de agarose	(qualquer)	-	Equipamento para eletroforese em gel de agarose de PCR semiquantitativo.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2	BD	citômetro de	fluxo.
Sistema de PCR em tempo real rápido 7900HT	Equipamento aplicado Biosystem	7900HT	para qRT-PCR.
Centrífugas de bancada para processamento eficiente de amostras em aplicações de cultura de células, refrigeradas, com baldes de microplacas.	(qualquer)	-	Centrífuga para processamento de cultura celular e inoculação.
Ultracentrífuga Optima L-90K equipada com rotor SW32TI	Beckman Coulter-Ultracentrifuge		para produção de partículas lentivirais.
Equipamento para laboratório de cultura celular e biologia molecular (por exemplo, capela de fluxo laminar Classe II projetada para trabalhos envolvendo materiais BSL2, incubadora de cultura de células, refrigeradores e freezers (+4 ° C, -20 ° C, -80 & C), micropipetas e pipetas).
Jalecos de proteção de laboratório, luvas, proteção facial de acordo com as regras e regulamentos do Instituto, em particular para produção e transdução de partículas lentivirais.

Reagentes humanos de Austral Reagente Reagente tubos estéreis cultura de células cultura células estéril