Summary
우리 생체 10 nm 금 나노 입자, 표면에 폴 리 에틸렌 글리콜을 코팅 하 여 공업화를 합성 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 입자 사용 생체 외에서 수 있으며 vivo에서 나노 세포와 세포 외 공간에 치료제를 제공에 대 한 기존의 나노 크기와 접근 하기 어려운.
Abstract
금 나노 입자 (AuNPs) 그들의 크기, 생체 적합성, 및 수정할 수 있는 표면 연구에 광범위 하 게 사용 되었습니다. 특정 대상 및 약물 전달이이 AuNPs 하지만 내 피 세포 외 매트릭스의 방어 속성 버들 고리 입자 통풍 관의 응용 프로그램의 일부입니다. 이 문제를 해결 하려면 사용자 정의 기능 그룹 및 추가 조정에 대 한 폴리머 길이 혈관 납품을 개선 하기 위해 ultrasmall 금 나노 입자 합성 방법을 설명 합니다. 프로토콜 수익률 2.5 nm AuNPs tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium 염화 (THPC)로 덮인. AuNP의 표면에 hetero-기능성 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)와 THPC의 교체 10.5에 유체역학 반경 증가 표면에 다양 한 기능 그룹을 제공 하면서 nm. 프로토콜의 마지막 부분에는 나노 통풍 관을 추적 하는 형광에서 시각을 AuNPs 있도록 fluorophore의 선택적 추가 포함 되어 있습니다. 투 석과 동결은 정화 하는 AuNPs 격리 사용 되었다. 이러한 형광 나노 입자를 구상 될 수 있다 때문에 생체 체 외에서 그리고 vivo에서 모두 실험에서 말뚝 코팅과 형광 프로브. 또한, 이러한 나노 입자의 크기 범위 렌더링 그들 이상적인 후보자는 glycocalyx 정상적인 맥 관 구조 기능, 향상 된 배달 및 치료제로 이어질 수 있습니다 방해 하지 않고 프로 빙에 대 한.
Introduction
나노 입자를 적용 한 약물 전달 및 관심1,2의 대상 영역을 신체를 통해 이동 하는 기능에 대 한 영상. 입자 새 맥 관 구조를 통해 종양 내 축적 또는 지역화 대상 ligand overexpressed입니다와 노출 수 있습니다. 금,은, 특히, 되고있다 일반적으로 사용 되는 나노 소재 운송 및 치료제3의 출시에 영향을 주는 그것의 독특한 화학 및 물리적 특성 때문에. 골드는 효과적인 나노 소재 표면 thiols에 바인딩할 수정할 수 있기 때문에 고 있다 높은 생체 적합성 때문에 그것의 낮은 독성4. AuNPs 대형 바이오 의약품의 되 고 할 수 있다 고 AuNPs2,4대상에 대 한 유리한 될 수 있도록 펩 티 드, 핵 산 및 단백질, 전달에 성공 했습니다.
불행 하 게도, 나노 약물 전달 효과 부정 청구 glycocalyx 대부분 포유류 세포의 막에 extracellular 코트 이며 최대 7 nm5,6의 기 공 크기는에 의해 방해 되어 있다. 이 기 공 크기는 대부분 나노 약물 사업자는 50-200 nm에서 배열 하는 전형적인 직경 보다 작은. 질병 조건 하에서 이러한 glycocalyx 모 될 큰 저하, 내 피 세포를 통해 침투성 증가 때문. 그러나, 대부분의 나노 입자는 glycocalyx에이 구조적인 변화를 최대한 활용 하기 위해 너무 큰 지금도. 이 크기 불일치에의 한 암시는 통상 크기의 입자 선 혈관 내 피 세포와 호의적으로 작용 하지 않습니다. 이 피에 정 맥으로 관리 입자의 배달에 영향을 하 고 또한 혈액 뇌 장벽7,8,,910통해 입자 전송의 라고 할 수 있다.
한 가지 방법은이 문제에 대처 하는 glycocalyx에 작은 구멍을 통과 하는 작은 입자를 활용 하는 것입니다. 여기, 우리는 10.5 nm ultrasmall 금 나노 입자, 일반적으로 그대로, 건강 glycocalyx에 의해 저지 해야 하는 음성 합성. glycocalyx 시작 되 면 노출 된 것으로,은 나노 해야 쉽게 증가 기 공 크기를 통해 셀을 관통 하 게 됩니다. 이 문서에서는 프로토콜의 ultrasmall 골드 PEG는 생체 적합성을 증가 하 고 조직의 허가4감소와 코팅 합성 자세히 설명 합니다. 못 포함할 수 있습니다 또한 여러 종류의 기능적인 그룹, ligands, fluorophores, 및 치료제를 대상으로의 활용을 위한도 열기. 이전 게시 결과 이러한 ultrasmall 나노 채택 될 더 호의 방해 내 피 glycocalyx 함수의 지역에4,11을 대상으로 하는 모든 활성 없이 하는 경향이 나타냅니다. 이 타당성과 배달 응용 프로그램에 대 한 정확한 크기의 입자를 활용의 중요성을 나타냅니다. 다음 프로토콜 기능 그룹 및 다른 응용 프로그램에 대 한 활용형을 조정 하기 위한 논의와 합성, 정화 및 나무 못 코팅 AuNPs (못-AuNP)의 특성을 선물 한다.
Protocol
1. 준비 또는 재고 솔루션의 조달 (실내 온도에 저장 또는 사용까지 냉동)
- 400 mg, 실내 온도에 10 mL 초순에 NaOH를 용 해 하 고 잘 재료를 혼합 하 여 1 M 수산화 나트륨 (NaOH) 재고 솔루션을 준비 합니다.
참고: 초순 수 입자, 박테리아, nucleases, 이온, 생명체의 흔적 등 불순물 없이 물으로 정의 됩니다. 정화 시스템 초순, 최대 18.2 ㏁, 낮은 음이온 오염을 나타내는의 저항력에 결과 얻을 하는 데 사용 됩니다. 상업적으로 이용 가능한 생된 초순 수의 사용을 권장 하지 않습니다. 이제부터,이 초순 것입니다 라고 하 물, 별도로 지정 하지 않는 한. - 물 10 mL에 NaOH의 2.4 g을 용 해 하 여 6 M NaOH 재고 솔루션을 준비 하 고 실 온에서 솔루션을 저장할.
- 10.16 mL의 물에 말린된 HAuCl4 의 1 g을 용 해 하 여 chloroauric 산 (HAuCl4)의 250 m m 재고 솔루션을 준비 합니다. 250 mm HAuCl4 25 mM HAuCl4의 작업 농도를 9 mL 물 1 mL를 희석. 실 온에서 HAuCl4 솔루션을 저장 합니다.
- 물 10 mL에에서 84 mg 나트륨 중 탄산염 용 해 단계 1.2에서에서 6 M NaOH 추가 하 여 8.8에 pH를 조정 하 여 pH 8.8에서 0.1 M 탄산 버퍼를 준비 합니다. 실 온에서 탄산 버퍼를 저장 합니다.
- 20 mL tetrazolium의 안정화 에이전트, phenazine ethosulfate (PES) 화합물, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium 소금 (MTS), 믹스 ( 재료의 표참조). 어둠 속에서-20 ° c (최대 10 freeze-thaw 주기)에 대 한 aliquots에서 MTS/PES 혼합물을 저장 합니다.
2입니다. 금 나노 코어의 합성
- 80%의 12 µ L을 추가 하 여 희석된 THPC 솔루션 준비 물 실 온에서 microcentrifuge 튜브에서 물 1 mL에 THPC.
- 자기 저 접시의 센터를 통해 100 mL 둥근 바닥 플라스 크를 보호 합니다. 플라스 크에 물 45 mL를 붓고 하 고 작은 달걀 모양의 자석 저 어 막대를 사용 하 여 300 rpm에서 물을 저 어. 0.5 mL의 1 M NaOH와 희석된 THPC 솔루션의 1 mL를 추가 합니다. 계속 5 분 동안 적극적으로 반응 혼합물을 저 어.
- 혼합 교 반 계속 하 고 25 mM HAuCl4 솔루션의 2 개 mL를 추가 합니다. 혼합물의 색 초 이내에, THPC의 대형 덮인 AuNPs 네거티브 차지 나타내는 어두운 갈색 노란색에서 변경 됩니다. 골드 코어의 완전 한 형성에 대 한 수 있도록 추가 15 분을 위한 혼합물을 저 어.
3. 금 나노 입자 주위 폴리머 코로나의 추가
- 2.3 단계에 설명 된 15 분 기간 동안 준비 못 솔루션 4 mL 유리 튜브에 1 mL 물에 다음의 각각을 용 해 하 여: 30 mg NH2-말뚝-쉬; 7.5 mg m-못-쉬; 7.5 밀리 그램 COOH 못 쉬입니다.
참고: 결과 농도 8.8 M NH2이어야 한다-말뚝-SH, 3.75 M m-못-SH, 그리고 3.75 M COOH-말뚝-SH. - 100 rpm을 둥근 바닥 플라스 크에 솔루션의 교 반 속도 줄여, THPC의 솔루션을 페그 솔루션 출장 AuNPs dropwise 추가 합니다. 계속 THPC의 효율적인 제거 및 말뚝에 의해 대체 되도록 실 온에서 부드럽게 하룻밤, 혼합물을 저 어.
- 다음 72 h에 대 한 12-14 kDa 분자량 컷오프 셀 루 로스 멤브레인을 사용 하 여 60 rpm을 내면서 물의 4 L 물통에 대 한 흔들된 혼합물을 dialyze. 투 석 클립에 의해 세포 막의 끝 고 피 펫을 통해 솔루션을 전송.
참고: 12-14 kDa 차단 막으로 투 석 과정이만 제거 됩니다 unreacted 말뚝, THPC, 및 다른 화학 반응 물 농도 기온 변화도 따라서 유포에 의해. - 높은 농도 기온 변화도 유지 하 고 지속적인 보급 촉진, 물 매 2 첫 번째 6 h h 고 나머지 66 h에 대 한 모든 6-12 h을 변경 합니다.
참고:이 물 변경 일정의 목적은 샘플 내에서 처음 높은 농도 때문에, 초기에 나타나는 급속 한 확산에 맞게. 투 석 과정 위에서 설명한 잎 반 정화, 나노 솔루션은 나노 입자, 침전, 집계 및 기타 대형 불순물을 12-14 kDa 차단 막의 숨 구멍을 통해 전달할 수 없습니다 있기 때문에. - 나머지 침전, 집계 및 기타 대형 불순물을 제거 하는 0.2 µ m 주사기 필터를 사용 하 여 50 mL 원뿔 튜브에 세미 정제 나노 솔루션을 필터링 합니다.
- -80 ° C 냉동 고에 원뿔 튜브를 놓고 약 5 h에 대 한 동결을 순화 PEGylated AuNP (못-AuNP) 솔루션을 허용 합니다.
- 동결 건조 기를 사용 하 여 정화 못 AuNP을 lyophilize.
- 건조 하 고, 순화 된 말뚝-AuNP 4 ° C에서 사용까지 저장 합니다.
4. 동산 Fluorophores 못 AuNP에 NH2 그룹에 N-hydroxysuccinimide (NHS) 에스테 르를 사용 하 여
- 자기 저 접시의 센터를 통해 50 mL 둥근 바닥 플라스 크를 보호 합니다. 물 18 mL로 플라스 크를 물 자석 저 어 달걀 모양의 막대를 사용 하 여 100 rpm에서 저 어.
- 높은 정밀도 벤치탑 규모를 사용 하 여 4 mL 원뿔 튜브에 동결 건조 된 말뚝 AuNP의 2 밀리 그램 무게. 정전기와 튜브 표면에 못 AuNP 분말의 집착을 제거 하는 정전기 방지 총을 사용 합니다. 튜브에 물의 2 개 mL를 추가 합니다. 물 20 mL의 총에 추가 재구성의 둥근 바닥 플라스 크에 2 mL 못 AuNP 솔루션을 부 어. 계속 자기 저 어 달걀 모양의 막대를 사용 하 여 100 rpm에 혼합물을 저 어.
- 0.1 m M의 1 mL을 추가, pH 8.8 탄산염 20 mL 둥근 바닥 플라스 크에 포함 된 재구성된 AuNP에 버퍼. 계속 저 어.
- 디 메 틸 sulfoxide에 10 mg/mL 형광 NHS 에스테 르의 5 µ L를 추가 합니다.
참고: 모든 형광 성 염료는이 과정에서 사용할 수 있습니다. 밤새 형광 못 저 어. 실내 온도에 그것을 유지 하 고 호 일에 커버. - 다음 72 h에 대 한 초과 fluorophores 단계 3.3에에서 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 제거 합니다. 간단히, 흔들된 혼합 물, 12-14 kDa 분자량 컷오프 셀 루 로스 멤브레인의 4 L 물통을 사용 하 여 dialyze. 첫 번째 6 h에 대 한 모든 2 h 고 나머지 66 h에 대 한 모든 6-12 h 물을 변경 합니다.
- 아래 섹션 5에에서 설명 된 특성에 사용할 순화 형광 못 AuNP 솔루션의 1 mL를 얻을. 동결 하 고 단계 3.5-3.7에서에서 설명한 대로 4 ° C에서 스토리지에 대 한 가루 형태로 형광 나노 입자를 얻기 위해 나머지 솔루션을 lyophilize.
- 0.2 µ m 주사기 필터를 사용 하 여 소독 하 고 모든 잠재적인 침전 한 번 셀 문화 응용 프로그램에 대 한 재구성을 제거.
5입니다. 형광 PEGylated 금 나노 입자의 특성
- 전송 전자 현미경 (TEM)를 사용 하 여 골드 나노 코어를 시각화 하 고 크기를 측정 하
- 카본 코팅 메쉬 가장 격자에 순화 된 형광 못 AuNP 솔루션의 10 µ L을 드롭.
- 5 분 후 필터 종이 조각을 사용 하 여 신중 하 게 못 AuNPs 남겨진 형광을 포함 하는 영화까지 가장 격자의 가장자리에서 멀리 초과 액체를 심지.
- 80에서 형광 못 AuNPs 보기 kV와 50000-150, 000의 확대. 디지털 사진의 찍을.
참고:만 금 코어 표시 됩니다 때문에 못 전자 밀도 가장에. - 측정 소프트웨어를 사용 하 여 눈금 막대를 측정 비율을 설정 합니다. 약 20 골드 코어의 직경을 계산 하 고 평균 금 코어 직경을 결정 합니다.
참고: 가장 이미징 시스템 자동 디지털 사진에 눈금 막대를 배치합니다.
- 동적 산란 (DL)을 사용 하 여 유체 나노 크기의 측정
- 4.2 단계에서 설명한 방식을 사용 하 여 microcentrifuge 관으로 동결 건조 된 THPC 코팅 AuNPs의 1 밀리 그램을 전송 합니다. 별도 튜브에 동결 건조 된 말뚝 AuNP의 1 밀리 그램을 전송 합니다. 각 관에 물 1 mL를 추가 하 고 투명 한 플라스틱 1 mL에 각 AuNP 솔루션을 전송.
- DL 악기에는 베트를 놓고 DLS 시스템에 내장 된 입자 분석기 소프트웨어를 사용 하 여 구형 유체역학 직경을 측정 합니다.
- 히스토그램 형식을 사용 하 여 측정 된 유체역학 직경을 플롯 합니다.
참고: 막대 그래프는 크기에 의해 나노 입자 그룹. 나노 입자의 가장 큰 그룹이이 프로토콜에 합성 AuNPs의 크기를 가장 잘 설명 하는 직경을 명확히 것 이다.
- Fluorometric 형광 확인
참고: 동일한 샘플 및 단계 5.2에서에서 베트는 형광 신호를 측정 하기 위해 사용할 수 있습니다.- DL에서는 베트를 제거 하 고는 spectrofluorometer에 삽입. 650-800 nm의 파장 범위에 따라 여기 파장 633 nm 고 읽기 내보낸된 형광 신호를 설정 합니다.
- 확인 하는 최대 약 665 nm, 보 건국에 대 한 방출 피크에 연결 합니다.
주: 여기 및 방출 파장 fluorophore 과정에 사용에 따라 조정 됩니다.
- MTS11 생체 적합성을 평가 하기 위해 시험
- 치료 96 잘 명확한 아래 살 균 조직 문화에서 접시, Dulbecco의 수정 독수리의 매체의 100 µ L 플라스틱 (DMEM; 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 페니실린/스 보충) 및 3.2 x 103 셀 각 우물에.
참고:이 연구에서 쥐 지방 패드 내 피 세포는 사용 됩니다. 21 우물의 총 각 (단계 5.4.3 관심의 특정 농도 대 한 참조) 7 다른 나노 입자 농도의 3 복제 수 있도록 데 사용 됩니다. - 37 ° C11에서 습도 5% CO2 제어 incubators에 confluency 성장 세포 허용.
- 다양 한 농도의 나노 입자와 DMEM의 300 µ L 각 개별 microcentrifuge 튜브 준비. 이 연구 해야 다음 못 AuNP 농도 DMEM의 7 다른 튜브: 0 µ g/mL, 10 µ g/mL, 50 µ g/mL, 100 µ g/mL, 250 µ g/mL, 500 µ g/mL, 및 1000 µ g/mL.
- 튜브에서 DMEM 발음 0, 10, 50, 100, 250, 500, 또는 AuNP의 1000 µ g/mL를 포함 된 DMEM 미디어 100 µ L로 3 중에서 우물을 채우십시오.
- 세포와 나노 입자 시간, 여기에 16 h의 미리 결정 된 길이 대 한 공동 품 어를 하실 수 있습니다.
- 잠복기의 끝부분 1.5 단계에서 MTS/PES 혼합물을 녹여.
- 부 화, 후 발음 된 DMEM과 우물에서 일시 중단 됨, 느슨하게 연결 된 나노 입자. DMEM 제조 업체의 프로토콜에 따라 비율을 1:5 MTS/PES를 MTS/PES 해결책의 20 µ L 함께 신선한 DMEM의 100 µ L를 추가 합니다. 2 h 37 ° C에서 MTS/PES와 셀을 품 어.
참고:이 2 h 외피 내 피 세포의 대사 활동에 의해 결정 됩니다 시간과 다른 세포 유형 4 h까지를 증가 시킬 수 있다. 기간 내에 2 h는 MTS는 DMEM 믹스 컬러 formazan으로 내 피 세포에 의해 대사는. 못 AuNP의 생체 적합성 및 세포 생존 능력의 가능성 더 색된 formazan와 시연 됩니다. 못 AuNP와 세포는 죽어가 고 기회의 독성 보다 적게 강렬한 색상으로 표시 됩니다. - 492에서 흡 광도 읽어서 각의 색도계 분석 수행 호환 플레이트 리더 nm.
- 각 나노 입자 농도 triplicate 흡 광도 값에서 평균 흡 광도 계산 합니다. 0 µ g/mL 나노 입자를 포함 하는 우물에서 흡 광도 평균에서 얻은 값으로 평균 흡 광도 나눕니다.
참고: 아무 AuNPs를 포함 하는이 우물 나노 치료 다른 우물에 관리에 대 한 응답 비율 세포 생존 능력 계산 컨트롤 역할을 합니다.
- 치료 96 잘 명확한 아래 살 균 조직 문화에서 접시, Dulbecco의 수정 독수리의 매체의 100 µ L 플라스틱 (DMEM; 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 페니실린/스 보충) 및 3.2 x 103 셀 각 우물에.
- 그대로 또는 역 기능 glycocalyx11 부착 내 피 세포에 나노 통풍 관의 형광 confocal 현미경 검사 법 평가
- 씨 1.0 x 104 셀/cm2 쥐 지방 패드 살 균 12 m m 유리 coverslips에 내 피 세포 그리고 DMEM 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 페니실린/스와 셀 피드. 약 3 일에 대 한 습도와 37 ° C에서 CO2 제어 incubators 전체 confluency에 성장 셀 수 있습니다.
- 해당 되는 경우는 glycocalyx 수정 치료를 추가 합니다. 예를 들어 2.5 x 10-6 IU heparinase III 효소 배양된 내 피 세포의 2 h 치료 특히 고착 heparan 황산 염 구성으로는 glycocalyx를 저하 됩니다.
참고: 건강 glycocalyx 저하 효소의 추가 없이 5.5.1 단계에서 설명한 대로 내 피 세포를 성장 하 여 모델링할 수 있습니다. - 내 피 glycocalyx 그대로 또는 렌더링 기능 장애와 16 h 550 µ g/l 또는 다른 원하는 시간에 형광 AuNPs와 내 피 세포를 품 어.
- 부드럽게 37 ° C 1% 소 혈 청 알 부 민에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS, 100 mg/L 칼슘 및 마그네슘 100mg/L 포함)의 2 개 mL로 세포 세척. 2% paraformaldehyde 2 mL에 셀과, PBS에 0.1%도 물속에 넣으십시오 고 실 온에서 30 분에 대 한 해결 하기 위해 셀 수 있습니다.
- 알데하이드 고정 솔루션을 제거 하 고 3 5 분 주기 위한 실내 온도 PBS로 세포를 씻어.
- 1 차적인 항 체 신청, 이전 비 특정 바인딩 사이트 차단에 실 온에서 30 분 PBS에 2% 염소 혈 청 내 피 세포를 노출 합니다. 셀 완전 차단 솔루션으로 적용 해야 합니다.
- 하룻밤 2% 염소 혈 청에서 PBS는 glycocalyx의 heparan 황산 염 구성 요소를 4 ° c에서에서 1% 안티-heparan 황산 염 주 항 체와 내 피 세포를 품 어. 고정된 셀 항 체 솔루션 문의 완벽 하 게 인지 확인 합니다.
- 다음 날, 실내 온도 PBS와 항 체 3 10 분 사이클 세척 한다.
- 어두운 또는 알루미늄 호 일로 덮여에 실 온에서 30 분에 대 한 적절 한 형광 이차 항 체의 1:1,000 희석과 내 피 세포를 품 어.
- 3 10 분 사이클 실내 온도 PBS와 이차 항 체 세척 한다.
- 반대로 페이드 장착 매체 포함 4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) 핵 얼룩을 사용 하 여 현미경 슬라이드에 coverslip을 탑재 합니다. 매니큐어를 사용 하 여 하는 coverslip의 가장자리를 밀봉 하십시오.
- 이미지 형광 immunostained 내 피 세포와 confocal 현미경 검사 법, 시각화는 핵, heparan 황산 glycocalyx, 나노 입자, 각각을, 녹색, 파란색과 빨간색까지 채널을 사용 하 여 샘플링 합니다.
Representative Results
THPC 또는 나무 못 코팅 합성된 AuNPs (그림 1A 및 그림 1B, 각각), 가장와 입자 크기는 사용 하 여 DL 하 고 가장 적절 한 나노 입자 크기 분포 측정 군데. 그림 2 는 THPC AuNP 샘플의 TEM 이미지 80 kV 및 150000 x 확대. THPC-AuNP 입자 이르기까지 가장 이미지에 보정 바에 따라 2-3 nm의 직경. 이 THPC AuNP 크기는 또한에서 분명 DL 크기 측정 히스토그램 그림 2에 표시 하는 THPC 코팅 AuNP 표시 됩니다 2.5에서 피크를 nm. 고분자는 전자 밀도 PEGylation 가장 아래 표시 되지 않습니다. 못 AuNP 샘플의 TEM 이미지는 단순히 못 폴리머 코로나는 나노 입자 주위 집계의 예방에 도움이 있기 때문에 예상 되는 개별 분산된 입자의 존재를 확인. 이러한 페그 AuNP 샘플에 대 한 DL 크기 측정 히스토그램에서는 변화는 피크, 약 10.5는 DL에 nm. 첨부 파일 추가 ligands 또는 기능 그룹에 약물의 뿐만 아니라, 나노 입자의 크기에 영향을 미칠 것입니다 그리고 직경을 측정할 때 고려해 야.
Fluorophore 추가 (그림 1C)는 그림 3에서 보듯이 나노 입자, 샘플에서 형광 신호를 측정 하는 fluorometer를 사용 하 여 확인 됩니다. 로 파장 633 nm, 방출은 660와 672 nm, 665에 최대 방출의 제조 업체의 제품 정보는 사이 최대 측정 nm. 다른 형광 프로브 부착 형광 응답을 보장 하기 위해 유사한 방식으로 검사 되어야 한다.
입자와 관련 된 세포 생존 능력의 생체 적합성은 나노 입자의 다양 한 농도와 16 h 배양 후 MTS의 상대 셀 대사 확인 MTS 분석 결과 사용 하 여 평가 됩니다. fluorophore 활용된 PEGylated AuNPs 1 mg/mL (그림 4A)까지 모든 농도에서 세포 생존 능력의 유사한 수준으로 표시 된 대로 더 중대 한 독성을 보여 줍니다. 이 생체 적합성 치료 또는 사용자 지정 입자를 나머지 기능 그룹에 연결 된 ligand 변경 될 수 있습니다. 마약 첨부 파일, 독성을 증가 하는 경향이 하지만 작업 농도 따라 그것은 수에 영향을 주지는 생존 중요 한 방식으로.
형광, 부착 세포에 의해 PEGylated AuNPs (그림 1C)의 손상 또는 역 기능 glycocalyx (그림 4B)와 교양된 쥐 지방 패드 내 피 세포를 사용 하 여 평가 이다. 역 기능 glycocalyx 조건 문화에 heparinase III 효소를 추가, heparan 황산 glycocalyx 구성 요소의 저하를 매트릭스12손상에 의해 달성 된다. 그림 4B 대표 내 피 세포의 횡단면 보기에 빨간 점으로 못 AuNPs의 이해의 다른 레벨을 보여줍니다. 건강 한 glycocalyx 이러한 금 나노 입자의 통풍 관을 deters 하지만 상당한 증가 관찰 때 효소 고용된11. 이 결과 glycocalyx 건강을 기반으로 하는 고유한 상호 작용에 의해 제어 되는 방식으로 내 피 세포에 치료제를 제공 하는이 ultrasmall 나노 입자의 잠재력을 강조 한다.
그림 1: 골드 나노 설계도. (A) THPC 말뚝 교체 전에 AuNP 나노 코팅. (B) PEGylated AuNP 못 종단, COOH, NH2, 채널3등의 3 종류. 푸른 파도 폴리머를 나타냅니다. (C) 형광 이미징 위한 나노 입자를 활용. 붉은 별 표시 fluorophores NH2 기능적인 그룹을 활용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 금 나노 입자의 측정 크기. 왼쪽: 80에서 말뚝의 추가 전에 금 나노 입자의 TEM kV 및 150000 X 확대, 눈금 막대 표시와 함께. 오른쪽: 나노 크기의 막대 그래프 (AuNP) 전에 DL로 측정 및 말뚝 (말뚝-AuNP)는 THPC 교체 후. THPC 코팅 AuNP에 대 한 DL 결과 계량 무슨 가장에 의해 시각 이다. DLS 못 입히는 AuNP 결과 때문에 안 되는 전자 밀도가 고분자 가장 하 여 못을 시각화 하는 무 능력의 도전을 극복. 한 가장의 말뚝-AuNP와만 코어 골드 나노 입자 표시 됩니다 THPC 출장 AuNP으로 동일을 볼 것 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 형광 못 AuNP의 형광 데이터. 667 nm 경기 못 AuNP에 활용 된는 fluorophore의 방출에 형광 피크. 거리: 임의 단위입니다.
그림 4: 형광 못 AuNP와의 상호 작용을 세포. (A) 쥐 지방 세포 생존 (MTS 대사) 플롯 형광 못 AuNP와 16 h 공동 부 화 후 내 피 세포를 패드. (B) 공초점 단면 이미지 고정된 쥐 지방의 내 피 세포 핵 (파란색)와 heparan 황산 염, glycocalyx 구성 요소 (녹색)에 대 한 항 체에 대 한 DAPI 물 패드. 건강 한 glycocalyx 상단 이미지 하단 이며 저하 glycocalyx 레이어; 저하 glycocalyx와 샘플에서 나노 입자에서 훨씬 더 많은 붉은 형광이 있다. 눈금 막대는 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
이 기술은 사용자 정의 ultrasmall 나무 못 코팅 AuNPs 합성을 위한 효과적인 방법 이다. 이 절차의 중요 한 부분이 이다 THPC의 초기 형성 출장 금 나노 입자, 노란색을 갈색에서 색깔 변화에 의해 확인 될 수 있다 HAuCl4 둥근 바닥 플라스 크 (프로토콜 단계 2.3)에 내용에 추가 된 후 발생 합니다. 색상 변화 없음 나타냅니다 없는 나노 입자 형성은 초기 단계 체크 하 고 계속 하기 전에 반복 해야 합니다. 와인 레드 등 회색 갈색 이외의 색 변경 하는 경우에서 결과 입자 가능성이 됩니다 대상 2.5 nm 주위 하 고 새 일괄 처리도 여야 한다.
골드 코어의 형성, 고 정화 절차에 대 한 THPC의 교환 프로토콜의 성공적인 완료에 대 한 몇 가지 주요 단계가 포함 됩니다. 혼합 하룻밤 교체 반응 완료로 이동에 대 한 수 있습니다. 실패 한 정화 투 석 물 된 주파수와 함께 변경 되지 않은 경우 발생할 수 있습니다. 집계 및 강 수 입자의 경우 입자는 72 h에 대 한 투 석에서 발생할 수도 있습니다. 다른 잠재적인 문제는 동결 건조 하는 동안 관찰 될 수 있었다. Ultrasmall 나무 못 코팅 AuNP 솔루션은 완전히 동결 되지 나는 lyophilizer 올바르게 설정 되지 않은 경우 샘플 손실 될 수 있습니다. 일부 장비는 다른 샘플 준비 해야 하는으로 lyophilizer 설명서를 참조 하십시오.
합성의 용이성 및 결과 입자의 생체 적합성 이러한 페그 AuNPs를 사용 하 여 이점을 나타냅니다. 또한, 이러한 나노 입자 같이 이러한 나노 입자의 의해 저하 glycocalyx를 식별 하는 기능에 의해 나노 세포 구조와 상호 작용 할 수 있는 이점이 있다. 이 장점은 새로운 동맥 경화 치료 및 예방 조치의 개발에 대 한 활용 될 수 있습니다. 무엇 우리 여기에 제시,이 프로토콜의 또 다른 장점은 외는 그것은 입자의 광범위 한 사용자 지정에 대 한 수로 연결 thiol4골드 나노 입자 PEG를 포함 하 여 안정성과 스토리지 기능을 증가입니다. PEG 사슬의 다른 끝 모든 기능 그룹에 포함 될 수 있습니다 그리고 분자의 무수 한 해당 그룹에 활용 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서 모든 3 개의 일반적인 기능적인 그룹 연결 (메 틸, carboxyl, 그리고 아미노산). 못의 비율은 형광 탐지를 먼저 우선 순위를 선택한 다음 보조 대상 moiety carboxylic 산 그룹을 사용 하 여 통합 하는 기능입니다. 이 그룹의 비율은 응용 프로그램에 따라 조정 될 수 있습니다 그리고 중합체의 모양과 길이 또한 조정 될 수 있다.
측정 입자 통풍 관, 우리 기능 그룹 중 하나에 형광 프로브 활용. 그것은 우리가 무엇을 설명 해야 넘어 어떤 활용은 나노 입자의 표면 특성의 변화를 발생 합니다 주목 해야한다. 추가 구성 요소 및 활용 반응 나노 입자의 각 반복은 원하는 속성에 대 한 테스트 해야 합니다.
이 방법은 저해 통상 크기의 나노 입자의 내 피 세포 외 glycocalyx의 방어 속성을 극복 하기 위한 ultrasmall 금 나노 입자를 생성 합니다. 그러나, 작은 크기 이미징 및 마약 측면 로드에 어려움을 준다. 이 입자는 전형적인 나노 크기 범위 보다 훨씬 작습니다 그리고 결과적으로 치료제와 moieties 타겟팅의 첨부 파일에 사용할 수 있는 노출 영역 크게 감소. 이 confocal 이미지와 같이 입자의 클러스터 수 아직도 쉽게 확인 될, 이미징 응용 프로그램에서 개별 신호를 따기 어려움이 발생할 수 있습니다. Ligands 및 치료제 표적으로 하기의 첨부 파일에 대 한 감소 된 표면 대상 복용량 요구 사항을 달성 하기 위해 관리에 더 많은 입자를 필요할 수 있습니다. 그러나, 더 작은 입자는 glycocalyx 고려 때 배달에 더 효율적인 있을 것입니다.
이러한 소설 ultrasmall 입자는 어려운에 배달의 수는 microenvironment의 중단을 최소화 하면서 체 내의 나노 영역에 도달. 못의 증가 생체 적합성과 다양 한 응용 프로그램에 대 한 입자의 무거운 사용자 지정에 대 한 기능 그룹을 제공 합니다. 일반적인 나노 입자에 비해 작은 크기 몇 가지 단점이 함께 제공 하지만 ultrasmall 입자, 복잡 하 고 깨지기 쉬운 glycocalyx 혈관에 침투 하기 어려운의 숙박 시설에 대 한 유망한 접근은 전략적으로 개발 하는 경우 타겟팅 및 약 납품입니다.
Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
이 작품은 노스 이스턴 대학교 화학 기술 부에 의해 지원 되었다, 시작 펀드와 북동부 대학 학장 사무실, NIH K01 HL125499, 및 NSF IGERT에서 계층 1 파일럿 연구 부여 NSF/DGE-096843를 부여 합니다. 저자는 또한 토마스 J. 웹스터와 그들의 원조로 Nanomedicine 과학 및 기술 센터와 노스 이스턴 대학에서 제약 과학 부서에 대 한 그의 연구실을 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 795429 | |
| Gold (III) Chloride trihydrate (HAuCl4.3H2O) | Sigma Aldrich | 520918 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Tetrakis (hydroxymethyl) phosphnium chloride | Sigma Aldrich | 404861 | |
| Mono-functional mPEG-thiol | Layson Bio Inc. | MPEG-SH-2000-1g | Mw: 2,000 Da |
| hetero bi-functional anime-PEG-thiol | Layson Bio Inc. | NH2-PEG-SH-3400-1g | Mw: 3,400 Da |
| Carboxymethyl-PEG-thiol | Layson Bio Inc. | CM-PEG-SH-2000-1g | Mw: 2,000 Da |
| Cellulose dialysis membrane (12-14 kDa) | Sigma Aldrich | D9777 | |
| Zerostat anti-static instrument | Sigma Aldrich | Z108812 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) carboxylic acid succinimidyl ester | Fisher | A20006 | Fluorophore |
| Fisherbrand Qualitative Grade Plain Filter Paper Circles - P5 grade | Thermo Fisher Scientific | 09-801-B | |
| Transmission electron microscopy | JEOL USA | JEOL JEM-1000 | TEM |
| Dynamic Light Scattering | Brookhaven Instruments Corporation | Brookhaven 90 Plus Particle Size Analyzer | DLS |
| Fluorometer | Horiba Scientific | Jobin Yvon Fluromax 4 | Fluorometer |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 | MTS |
| Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M4 | Plate reader |
| 10E4 epitope HS mouse monoclonal IgM antibody (primary antibody) | Amsbio | 370255 | Primary antibody |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (secondary antibody) | Thermo Fisher Scientific | R37120 | Secondary antibody |
| VECTASHIELD mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | With DAPI |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss Meditex AG | Zeiss LSM 700 | Confocol microscopy |
References
- Veiseh, O., Gunn, J., Zhang, M. Design and fabrication of magnetic nanoparticles for targeted drug delivery and imaging. Adv. Drug Deliv. Rev. 62 (3), 284-304 (2010).
- Feng, X., et al. Conjugated polymer nanoparticles for drug delivery and imaging. ACS Appl. Mater. Interfaces. 2 (8), 2429-2435 (2010).
- Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M.
- Kumar, R., et al. Third generation gold nanoplatform optimized for radiation therapy. Transl. Cancer Res. 2 (4), 1-18 (2013).
- Tarbell, J. M., Ebong, E. E. The endothelial glycocalyx: a mechano-sensor and -transducer. Sci. Signal. 1 (40), (2008).
- Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454 (3), 345-359 (2007).
- Becker, B. F., Jacob, M., Leipert, S., Salmon, A. H., Chappell, D. Degradation of the endothelial glycocalyx in clinical settings: searching for the sheddases. Br. J. Clin. Pharmacol. 80 (3), 389-402 (2015).
- Muzykantov, V., Muro, S. Targeting delivery of drugs in the vascular system. Int. J. Transp. Phenom. 12 (1-2), 41-49 (2011).
- Simone, E., Ding, B. -S., Muzykantov, V. Targeted delivery of therapeutics to endothelium. Cell Tissue Res. 335 (1), 283-300 (2009).
- Lockman, P. R., Mumper, R. J., Khan, M. A., Allen, D. D. Nanoparticle technology for drug delivery across the blood-brain barrier. Drug Dev. Ind. Pharm. 28 (1), 1-13 (2002).
- Cheng, M. J., Kumar, R., Sridhar, S., Webster, T. J., Ebong, E. E. Endothelial glycocalyx conditions influence nanoparticle uptake for passive targeting. Int. J. Nanomedicine. 11, 3305-3315 (2016).
- Fels, J., Jeggle, P., Liashkovich, I., Peters, W., Oberleithner, H. Nanomechanics of vascular endothelium. Cell Tissue Res. 355 (3), 727-737 (2014).
