Um ensaio de Blot Dot quantitativa para titulação de AAV e seu uso para avaliação funcional do vírus Adeno-associado Assembly-ativação de proteínas

Resumo

Este manuscrito detalha um ensaio de mancha de ponto simples para quantificação da concentração de vírus adeno-associado (AAV) e sua aplicação para estudar o papel da montagem-ativando proteínas (AAPs), uma classe nova de proteínas virais não estruturais encontrados em todos os vírus adeno-associados sorotipos, em promover a montagem de capsids derivado cognatos e heterólogos serótipos AAV.

Resumo

Enquanto o vírus adeno-associado (AAV) é amplamente aceita como um vetor atraente da terapia genética, serve também como um vírus de modelo para entender a biologia do vírus. A último aspecto, a recente descoberta de uma proteína não-estruturais AAV, denominada Assembleia-ativando proteína (AAP), tem lançar luz sobre os processos envolvidos na montagem das proteínas do capsídeo viral VP em um capsídeo. Embora muitos sorotipos de vírus adeno-associados exigem AAP para montagem, temos recentemente relatado que AAV4, 5, e 11 são exceções a essa regra. Além disso, temos demonstrado que AAPs e capsids montados de diferentes sorotipos localizar para diferentes compartimentos subcellular. Esta heterogeneidade inesperada na propriedades biológicas e funções funcionais da AAPs entre AAV diferente sorotipos sublinhados que a importância dos estudos na PittCon derivada de diversos sorotipos. Este manuscrito detalha um ensaio de mancha de ponto simples para quantificação de AAV e sua aplicação para avaliar a especificidade de dependência e sorotipo AAP no assembly do capsídeo. Para demonstrar a utilidade deste teste do borrão de ponto, partimos para caracterizar o conjunto de capsídeo e AAP dependência de AAV cobra, um réptil anteriormente descaracterizado AAV, bem como AAV5 e AAV9, que anteriormente foram mostrados para ser independente de AAP e dependente da AAP sorotipos, respectivamente. O ensaio revelou que o conjunto de capsídeo cobra AAV requer cobra AAP e não pode ser promovido por AAPs de AAV5 e AAV9. O ensaio também mostrou que, ao contrário de muitos o sorotipo comum PittCon que promovem Assembleia capsídeo heteróloga por Cruz-complementação, cobra AAP não promove Assembleia de AAV9 capsids. Além disso, mostramos que a escolha de nuclease afeta significativamente a leitura do ensaio de mancha do ponto, e assim, escolher uma enzima ideal é fundamental para o sucesso avaliação de títulos AAV.

Introdução

Vírus adeno-associado (AAV) é um pequeno, não-envelopado, single-stranded DNA vírus com um genoma de aproximadamente 4,7 kilobases (kb). O genoma do vírus adeno-associados contém quadros de leitura aberta (ORFs) para os genes rep e cap . Em 2010, uma proteína não-estruturais inédita codificada por um + 1 quadro-deslocados ORF dentro do gene do tampão de AAV2 foi descoberta por Sonntag et al e verificou-se que desempenham um papel fundamental na montagem de AAV2 proteínas do capsídeo VP monômero em um viral capsídeo¹. Esta proteína romance foi nomeada assembly-ativando proteína (AAP) após o papel que desempenha na promoção do capsídeo conjunto¹.

As ORFs para AAP foram identificado bioinformatically nos genomas dos parvovírus todos do género Dependoparvovirus, mas não dentro os genomas dos vírus de diferentes gêneros dos parvovírus família^1,2. Estudos funcionais desta proteína romance foram inicialmente focados no AAP do protótipo AAV2 (AAP2), que estabeleceu o papel essencial da AAP2 no direcionamento de proteínas de VP desmontadas para o nucléolo para sua acumulação e formação em totalmente montados capsids^1,3,4. A incapacidade dos capsids AAV2 a montar na ausência de expressão de AAP tem sido independentemente confirmada por vários grupos, incluindo a nossa,^1,2,3,4,5 . Estudos posteriores em serótipos AAV 1, 8 e 9 corroborou o papel crítico da AAPs no assembly do capsídeo, como proteínas de monômero VP3 de AAV1, 8, e 9 foram incapazes de formar um capsídeo totalmente montado na ausência de expressão co da AAP².

Recentemente, através de abordagens que incluem o uso de ponto quantitativo borrão ensaios, investigamos a capacidade de AAV1 de 12 VP3 monômeros para montar em capsids na ausência de expressão de AAP e a capacidade de AAP1 a 12 para promover a montagem de VP3 monômeros de heterólogos serótipos. Este estudo revelou que AAV4, 5 e 11 VP3 monómeros podem montar sem AAP. Além disso, verificou-se que oito dos serótipos AAP doze nós examinamos (isto é, todos, mas AAP4, 5, 11 e 12) exibida uma ampla capacidade de suporte conjunto capsídeo de capsids de sorotipo heterólogos da AAV, enquanto AAP4, 5, 11 e 12 exibido um substancialmente capacidade limitada nesta consideração⁶. Estes quatro sorotipos são filogeneticamente distantes do outro AAP serótipos^2,3. Além disso, o estudo revelou significativa heterogeneidade em suas localizações subcellular de diferentes PittCon⁶. Além disso, o estudo tem sugerido que a associação apertada da AAP com capsids montados e o nucléolo, a marca da montagem do capsídeo AAV2, necessariamente não pode ser estendida para outros sorotipos incluindo AAV5, 8 e 9, que exibem nucleolar exclusão de capsids montados⁶. Assim, a informação adquirida com o estudo de qualquer sorotipo específico AAP não é amplamente aplicável para todos biologia AAP. Natureza tão intrigante da biologia AAP enfatiza a necessidade de investigar o papel e a função de cada AAP de canônicos e não-canônicos serótipos AAV.

O papel biológico da AAP no assembly do capsídeo pode ser avaliado, determinando que os títulos de partícula viral de AAV totalmente embalados produziram no rim embrionário humano (HEK) 293 células, a linha de celular mais comumente usados para produção de vetor de vírus adeno-associados, com ou sem proteína AAP expressão. Os métodos padrão para quantificação de AAV são PCR quantitativo (qPCR)-ensaios com base^7,8 e dot quantitativo baseado em blot ensaios⁹. Outros métodos para quantificação de partícula viral AAV como de^10,de ensaio enzima-lig da imunoabsorção¹¹ ou de medição de densidade óptica¹² não são ideais para amostras provenientes de muitos diferentes sorotipos de vírus adeno-associados ou amostras contaminado com impurezas (lysates bruto ou meios de cultura), que muitas vezes são as amostras utilizadas para pesquisa AAV. Atualmente, qPCR é mais amplamente utilizado para quantificação de vírus adeno-associados; no entanto, é necessário reconhecer potenciais advertências do ensaio qPCR-baseado, como o ensaio podem resultar em erros sistêmicos e título significativas variações^13,14. Ensaios baseados em PCR são afetados por uma série de confusão potencialmente fatores, tais como a presença de grampos de cabelo terminais fechados covalentemente em modelos PCR que inibem a amplificação¹³. Até mesmo um indivíduo experiente pode apresentar potencial fatores de confundimento em uma base qPCR inconscientemente ensaio¹³. Em contraste, os ensaios de mancha ponto quantitativos são uma técnica clássica de biologia molecular que não envolve a amplificação do genoma e usa um princípio muito mais simples com um risco mínimo de erros em comparação com ensaios baseados em qPCR. O método é menos tecnicamente desafiador; Portanto, os resultados do ensaio são razoavelmente reproduzíveis mesmo por pessoas inexperientes.

Neste relatório, descrevemos os detalhes metodológicos de um ensaio de mancha de ponto quantitativa rotineiramente usamos para quantificação de vetor de vírus adeno-associados e fornecer um exemplo de como aplicar o ensaio para estudar o papel de montagem-promoção da AAPs em comum sorotipos (AAV5 e AAV9) e uma anteriormente descaracterizada AAP de AAV cobra¹⁴. Na natureza, AAV VP proteínas e proteínas AAP são expressos em cis de um único gene (ou seja, VP-AAP cis-complementação), enquanto no ensaio descrito aqui, proteínas de VP e AAP são fornecidas em trans de dois plasmídeos separados (ou seja, VP-AAP trans-complementação). Desde que cada proteína VP ou AAP de sorotipos diferentes pode ser expressa de cada independente do plasmídeo, torna-se possível testar combinações de VP-AAP heterólogos para montagem do capsídeo (ou seja, VP-AAP Cruz-complementação). Brevemente, VP3 AAV de vários serótipos é expresso em células HEK 293 transfeccao de Plasmideo DNA de um genoma de vetor de vírus adeno-associados do pacote na presença ou ausência do sorotipo cognato AAP, ou na presença de um sorotipo heterólogo AAP. Após a produção, meios de cultura e lisados celulares são submetidos a um ensaio de mancha de ponto para quantificar o genoma viral dentro do shell do capsídeo. O primeiro passo do ensaio de mancha do ponto é tratar as amostras com uma nuclease para remover contaminantes DNAs plasmideo e genomas AAV não acondicionadas em amostras. A não observância aumentaria os sinais de fundo, em particular quando impuro amostras são doseadas. Esta é seguida por um tratamento de protease para quebrar capsids virais e liberam nuclease resistente genomas virais em soluções de amostra. Genomas virais, próximo são desnaturadas, destruídas em uma membrana e hibridizadas com uma sonda de DNA específico do genoma viral para quantificação. No ensaio exemplo relatado aqui, demonstramos que cobra AAV VP3 exige cobra AAP para montagem do capsídeo e que cobra AAP não promove a montagem de AAV9 capsids ao contrário de muitos as AAPs derivados de serótipos AAP-dependente que podem também promover a montagem de capsids do sorotipo heterólogo. Por último, relatamos uma ressalva importante para qPCR ou quantificação de AAV ponto baseado em blot ensaios que a escolha de nuclease afeta significativamente os resultados do ensaio.

Protocolo

Nota: Receitas para as soluções e buffers necessários para este protocolo são fornecidas na tabela 1. O protocolo descrito abaixo é para o ensaio de mancha de ponto de cruz-complementação VP-AAP estudar as funções das proteínas no assembly do capsídeo AAP. O método para o ensaio de mancha ponto quantitativos mais genérico para titulação de vetor AAV purificada é explicado na seção de Resultados de representante .

1. construção de VP3, AAP e AAV2 Rep expressando plasmídeos

1. Construção de pCMV-AAVx-VP3 (x = sorotipos)
   1. PCR-amplificar o inteiro VP3 ORF (1,6 kb) usando um polymerase do DNA de alta fidelidade e o seguinte par de primer: VP3 avanço, CTAA-RE1-CACC-N₂₅ (os primeiros 25 nucleotídeos de ORF VP3); VP3 reversa, TCTT-RE2-N₂₅ (os última 25 nucleotídeos de ORF VP3).
      Nota: RE1 e RE2 são locais para enzimas de restrição (REs) para clonagem. CTAA e TCTT são o terminal 5' e 3' tetranucleotides adicionadas para facilitar a digestão da enzima de restrição perto do final do DNA dupla-hélice. CACC é uma sequência de consenso Kozak.
   2. Clone os produtos de PCR RE-digested entre o correspondente RE sites de um vetor de expressão dos mamíferos que usa o citomegalovírus humano imediatamente-início (CMV-IE) potenciador-promotor para expressão de alto nível.
      Nota: Para clonagem molecular, digeri a 5 µ g de DNA do plasmídeo espinha dorsal com uma restriction enzyme(s) em uma concentração de 4 U / µ g DNA para 1 h com uma temperatura ideal. Para fragmentos PCR, aumente as unidades de enzimas utilizadas (por exemplo, 10 U / µ g do produto do PCR de ORF VP3 1,6 kb) e um tempo de incubação (por exemplo, 4 h) devido ao aumento do número de sites de reconhecimento da enzima de restrição por unidade de comprimento. Informações úteis em biologia molecular enzimas e clonagem procedimentos, incluindo a transformação bacteriana podem ser encontradas em outro lugar^15,16,17.
2. Construção de pCMV-bandeira-AAPx (x = sorotipos)
   1. PCR-amplificar o inteiro AAP ORF (0,6 kb) exceto para o primeiro aminoácido usando um polymerase do DNA de alta fidelidade e o seguinte par de primer: AAP avanço, CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N₂₅ (25 nucleotídeos dos 4 nucleotídeos na AAP ORF); AAP reversa, TCTT-RE2-N₂₅ (os última 25 nucleotídeos da AAP ORF).
      Nota: GACTACAAGGACGACGATGACAAA códigos de uma marca de bandeira, que tem sido mostrada para ter nenhum efeito nocivo^4,5 , mas pode ser omitida se desnecessários.
   2. Clone os produtos de PCR RE-digested entre os sites correspondentes de um vetor de expressão mamíferos com o CMV-IE potenciador-promotor^15,16,17.
3. Construção de pHLP-Rep
   1. Digest 5 µ g do plasmídeo pAAV-RC2 (7,3 kb) com 20 unidades cada de Xho I e Xcm e purificar o DNA usando um kit de purificação de DNA comercial ou por extração de fenol-clorofórmio.
      Nota: Remoção de 1,8 kb Xho eu-Xcm que eu fragmento de 7,3 kb pAAV-RC2 plasmídeo resultados em perda da expressão de proteínas do capsídeo VP preservando a expressão da proteína Rep.
   2. Contundente o DNA termina com 6 unidades de T4 DNA Polymerase, agarose gel-purificar o fragmento de DNA de 5,5 kb e self ligate o fragmento purificado usando 50 a 100 ng de DNA e 400 unidades de T4 DNA ligase de acordo com recomendação^{15 as indicações do fabricante}.
   3. Siga o procedimento de transformação bacteriana padrão referenciado na etapa 1.1.2 nota.
4. Verifique se que o plasmídeo constrói por digestão enzimática de restrição e sequenciamento de^15,18.
5. Execute minipreps plasmídeo ou maxipreps usando kits comercialmente disponíveis para obter uma quantidade suficiente de plasmídeo para os experimentos de produção de vírus adeno-associados a jusante.

2. produção de AAV no HEK 293 células por transfecção de DNA do plasmídeo (Cross-complementação do ensaio)

1. Cultura de células HEK 293 em de Dulbecco modificado águia médio (DMEM)-glicose alta (4,5 g/L) suplementado com 10% soro bovino fetal (FBS), 1%, penicilina e estreptomicina Mix e 1 mM L-glutamina, uma incubadora de 37 ° C com 5% de dióxido de carbono (CO₂).
   Nota: Títulos AAV variam significativamente dependendo da fonte de células HEK 293.
   Atenção: Embora o AAV pode ser manipulado em Biossegurança nível 1 (BSL1) contenção, BSL2 contenção é recomendada para trabalhos de células HEK 293.
2. Dia -1 (24 h antes do transfection), placa 6 – 7 x 10⁵ HEK 293 células/poço em 2 mL do meio de completo descrito no passo 2.1 em um s 6-poços. Este geralmente alcança a confluência do ~ 90% no dia seguinte.
3. Dia 0: Transfection
   1. Preparação para transfeccao de DNA
      1. Certifique-se que as células chegaram a confluência ~ 90%.
      2. Aquecer DMEM suplementado com 1% penicilina e estreptomicina Mix e 1 mM L-glutamina mas sem 10% FBS (isto é, livre de soro médio) em banho maria a 37 ° C.
      3. Permitir que a solução o polyethylenimine (PEI) para atingir a temperatura.
   2. Preparação da mistura de DNA plasmídeo
      1. Misture os plasmideos em 96 µ l de solução salina tampão fosfato (PBS) sem CaCl₂ ou MgCl₂ em tubos de microcentrifuga estéril 1,5 mL conforme indicado na tabela 2. A quantidade total de DNA é de 2 µ g/bem.
         Nota: Os volumes de solução de DNA de plasmídeo podem ser desconsiderados, se eles são nominais. Ajuste do volume é recomendado se o volume total das soluções de DNA de plasmídeo é ≥ 10 µ l.
   3. Transfecção de PEI
      1. Adicione 4 µ l da solução de PEI (1 mg/mL) para a mistura de PBS-Plasmídeo (preparada como acima). O volume final é aproximadamente 100 µ l (5% de volume de meio de cultura). Vórtice brevemente os tubos e incube a mistura de DNA: PEI durante 15 minutos à temperatura ambiente.
      2. Enquanto espera para a incubação de 15 min completar, substitua o meio de cultura com meio livre de soro escaldado, descrito na etapa 2.3.1.2.
      3. Uma vez a 15min a incubação do DNA: mistura de PEI está completa, brevemente girar os tubos com microcentrifuga para coletar o líquido para o fundo dos tubos e adicione a mistura de DNA: PEI gota de meio de cultura em cada poço da placa de cultura de HEK 293. Suavemente agitar as placas e devolvê-los para uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO₂.
      4. Manter as células neste meio de transfeccao até a colheita no dia 5 (nenhuma mudança média é necessária).
4. No dia 1 e dia 2, observe células transfectadas com plasmídeo pCMV-GFP sob um microscópio de fluorescência invertido para avaliar a eficiência do transfection.
   Nota: para a microscopia de fluorescência, aqui um 10x / 0.25 objectivo de abertura numérica em combinação com uma ocular de 10 × foi usado, e 450-490 nm excitação bandpass filtro e filtro de emissão 515 – 565 nm bandpass foram empregados. A condição acima normalmente rende mais do que a eficiência de 70% do transfection. As células podem apresentar algumas alterações morfológicas (por exemplo, células tornaram magro), devido à condição livre de soro.
5. Nos dias 3-5, continue a cultura de células transfectadas em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO₂.
6. No dia 5, colete células e médio contendo vírus em polipropileno tubos cônico de 15 mL pipetando para cima e para baixo ou por raspagem com uma espátula de célula.
7. Armazene as amostras a-80 ° C até o uso.

3. dot Blot ensaio para quantificação de AAV

1. Recuperação de partículas virais
   1. Descongele rapidamente os tubos congelados em banho maria a 37 ° C. Vórtice os tubos vigorosamente durante 1 minuto maximizar a recuperação de AAV de células.
   2. Granule os detritos de células por centrifugação a 3.700 x g a 4 ° C por 10 min. Tome 200 µ l do sobrenadante de cada tubo e transferi-lo para um tubo de microcentrifuga rotulado com uma tampa de rosca para o ensaio de mancha de ponto.
      Nota: Alíquota do sobrenadante restante em microcentrifuga tubos e armazená-los congelados a-80 ° C para uso futuro. Aqui, os tubos de polipropileno microcentrifuga anexado com tampas de rosca e um-Ring foram usados. Vedação é necessária para evitar derramamentos de AAV e fenol-clorofórmio.
2. Tratamento com endonucleases de Serratia marcescens
   1. Prepare a mistura A e B de mistura reagentes (tabela 3). Adicione 10 µ l da mistura A e 10 µ l da mistura B em cada tubo. Vórtice os tubos por 5 s, brevemente, girar os tubos para coletar o líquido para o fundo do tubo e incubar os tubos a 37 ° C pelo menos durante 1 h.
      Nota: Mix A contém NaOH e otimiza o pH para tratamento com S. marcescens endonuclease. B Mix suplementos de magnésio. Concentração de endonuclease S. marcescens em estoques de enzima comercialmente disponíveis pode variar. O volume de S. marcescens endonuclease precisa ser ajustada para fazer 200 U/mL após a adição de mistura A e B de Mix para tubos em passo 3.2.1.
      Nota: Um tempo de incubação, acima de 4h, pode diminuir sinais de fundo.
   2. No final da incubação, gire rapidamente os tubos com uma centrífuga de bancada para coletar condensação e solução da parte superior e os lados dos tubos.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. As amostras podem ser armazenadas congeladas a-20 ° C ou -80 ° C.
3. Tratamento de proteinase K
   1. Prepare o reagente C Mix (tabela 3). Adicione 180 µ l do Mix C em cada tubo. Vórtice os tubos por 5 s, brevemente, gire os tubos e incubar os tubos a 55 ° C, durante 1 h.
      Nota: O EDTA no Mix C reagente quelatos íons de magnésio livre e inactivates S. marcescens endonuclease.
   2. No final da incubação, permitir que as amostras atingirem a temperatura e brevemente, girar os tubos com uma centrífuga de bancada para coletar condensação e solução da parte superior e os lados dos tubos.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. As amostras podem ser armazenadas congeladas a-20 ° C ou -80 ° C. Para retomar o protocolo, incube os tubos a 55 ° C, durante 5 a 10 min dissolver os cristais de SDS contidos no buffer completamente.
4. Precipitação de extração e etanol de fenol-clorofórmio
   1. Adicione 200 µ l de fenol-clorofórmio para as amostras e o vórtice-los por 1 min. giram as amostras em um microcentrifuge no ≥16, 100 g de x para ≥ 5 min à temperatura ambiente.
      Atenção: O fenol-clorofórmio deve ser tratada em uma coifa química com equipamento de protecção adequado (EPI; ou seja, luvas de nitrila, óculos ou protetor facial e jaleco com mangas compridas).
   2. Transferência de 320 µ l da camada aquosa (160 µ l duas vezes com uma pipeta P200) para um novo tubo de microcentrifuga padrão (80% do volume de fluido aquoso).
      Nota: É extremamente importante levar o mesmo volume de solução aquosa entre amostras, caso contrário o ensaio perde precisão quantitativa.
   3. Prepare o reagente de mistura D (tabela 3). Adicione 833 µ l do Mix D em cada tubo. Vórtice os tubos por 5 s e incubar os tubos a-80 ° C para ≥ 20 min.
      Nota: Mix D é uma mistura de etanol, acetato de sódio e glicogênio para precipitação do álcool etílico conveniente do DNA. As amostras podem ser armazenadas a-80 ° C a esta etapa e o protocolo pode ser retomado mais tarde.
   4. Amostras de centrífuga com microcentrifuga no ≥16, 100 x g a 4 ° C ≥ 15 min. decantar o sobrenadante e borre uma vez em uma toalha de papel limpo. Coloque aproximadamente 500 µ l de etanol a 70% em cada tubo, vórtice os tubos durante 5 s e centrifugar os tubos com microcentrifuga bancada no ≥16, 100 x g a 4 ° C para ≥ 5 min.
   5. Decantar o sobrenadante e borre-se uma vez em uma toalha de papel limpo. Pelotas secas a 65 ° C; pelotas podem ser secadas completamente.
      Nota: Não use uma pipeta para retirar o excesso etanol que permanece após a mancha os tubos. Pelotas também podem ser secadas em temperatura ambiente durante a noite. O protocolo pode ser pausado aqui e pelotas secas de DNA podem ser armazenadas à temperatura ambiente durante vários dias com a tampa do tubo fechada.
5. Ressuspensão de DNA viral em tampão TE
   1. Dissolva as pelotas de DNA em µ l 120 cada debuffer TE sacudindo cada tubo por 30 min a 1 h à temperatura ambiente.
6. Borrão de ponto
   1. Preparação de padrões de DNA do plasmídeo
      1. Dilua a AAV vector genoma ADN do plasmídeo para 10 ng / µ l em água ou em tampão Tris-HCl (10 mM, pH 8.0). Pegue 25 µ l desta diluição e digerir com uma enzima de restrição apropriada por 1h linearizar o plasmídeo de DNA, num volume de reação de 50 µ l.
         Nota: Nós fazemos um conjunto duplicado de digestão (consulte a etapa 3.6.4.1). A enzima apropriada deve ser aquele que corta o DNA do plasmídeo fora da região de sonda-vinculação do ponto do borrão. Para sua conveniência, o Plasmídeo diluído pode ser aliquotadas (25 µ l/tubo) e armazenado congelado a-20 ° C para uso futuro. Digeri o ADN do plasmídeo, enquanto os tubos estão tremendo na etapa 3.5.1. Não digeri excesso o plasmídeo de DNA padrão.
      2. Adicione 450 µ l de água ou TE ao tubo contendo o plasmídeo digerido DNA padrão e misture bem. Transfira 70 µ l desta mistura para um novo tubo de microcentrifuga de 1,5 mL com 1.330 µ l de água ou TE tornar um plasmídeo diluído padrão (25 pg / µ l).
      3. Siga a tabela 4 para criar um conjunto de diluições em série dupla (600 µ l/tubo). Homogeneizar as diluições vortexing por 5 s.
   2. Desnaturação dos padrões e amostras de ADN virais
      1. Adicione 600 µ l de solução alcalina de 2x para cada diluição padrão. Misture bem por num Vortex para 5 a 10 s. Incubar à temperatura ambiente por 10 min.
      2. Adicione 120 µ l de solução alcalina de 2x para cada amostra de DNA viral. Misture bem por num Vortex para 5 a 10 s. Incubar à temperatura ambiente por 10 min.
   3. Configurando o aparelho de borrão do ponto
      1. Usando a tesoura, corte uma membrana mancha (por exemplo, zeta-sonda) para um tamanho adequado para o número de amostras e padrões. Embeba a membrana com água durante 10 minutos antes de colocá-lo em um aparelho de borrão do ponto. Cobrir os poços não utilizados em cima do aparelho de membrana.
         Nota: Lidar com a membrana com uma pinça limpa. Para cobrir os poços vazios, a folha de proteção azul luz que vem com a membrana pode ser usada. Não permita que a membrana secar antes da ligação de amostras e padrões. Para mais detalhes sobre a montagem e utilização do aparelho, por favor consulte o manual do utilizador¹⁹.
      2. Adicione água aos poços para o qual as amostras serão carregadas. Aplica vácuo e puxe a água através dos poços para verificar se há erros e reteste quando fixo. Voltar a apertar os parafusos durante a aplicação de vácuo para garantir a vedação.
         Nota: Selagem incompleta pode causar vazamento de amostra entre os poços.
      3. Uma vez que a água é completamente puxada através de, liberar o vácuo completamente (ou seja, o distribuidor de vácuo deve ser aberto a pressão do ar).
   4. Carregar padrões e amostras ao aparelho de borrão de ponto
      1. Aplicar 400 µ l de cada padrão de ADN do plasmídeo diluído a cada poço e executar quatro pistas de diluições padrão. Use duas alíquotas distintas de digerir o padrão e carregar cada uma em duplicado. Aplicam-se 200 µ l/poço de cada amostra de DNA viral.
         Nota: Usando o restante µ l ~ 40 amostras desnaturado, amostras diluídas podem ser preparadas (por exemplo, 10 vezes amostras diluídas usando 20 µ l de amostra mais 180 µ l de solução alcalina de 1x) e destruídas se necessário.
      2. Aplica o vácuo suave para puxar as soluções de DNA através do poço.
         Nota: Vácuo pressão precisa ser ajustado abrindo parcialmente uma válvula de três vias, para que a pressão do vácuo é aplicado para o dot blot aparelhos, bem como a atmosfera (ou seja, com os braços de torneira posicionado em um ângulo de aproximadamente 45 ° onde ele faz um ruído mais alto de aspiração).
      3. Uma vez que todos os poços de tem esvaziado, libere o vácuo, ajustando a válvula de três vias. Adicione 400 µ l de solução alcalina de 1x a cada poço que continha normas e amostras. Espere por 5 min antes de re-aplicar vácuo para esvaziar os poços.
      4. Re-aplicar o vácuo da mesma forma (consulte a etapa 3.6.4.2).
      5. Desmontar o aparelho de borrão ponto sob vácuo, remover a membrana e enxaguá-lo com 2 x SSC. Coloque uma toalha de papel limpa com o lado de DNA-limite para cima, para remover o excesso 2 a membrana x SSC.
      6. UV-crosslink o borrado DNA para a membrana com um apropriado agente reticulante UV; a membrana está agora pronta para a hibridação.
         Nota: As membranas molhadas podem ser usadas para reticulação de UV. O UV-quitosana membranas secas, podem ser armazenadas à temperatura ambiente. Mais informações podem ser encontradas na Tabela de materiais.
7. Hibridação e lavagem
   1. Aquecer o tampão de hibridização em um banho de água de 65 ° C.
   2. Enzimaticamente rotular uma sonda de DNA com radioativo α -³²P dCTP e purificá-la usando kits comercialmente disponíveis de acordo com a recomendação do fabricante.
      Nota: Utilizamos uma sonda de 0.5-2.0 kb em tamanho de uma região de potenciador-promotora ou uma sequência de proteínas no genoma viral. Embora este protocolo utiliza ³²P-rotulado sondas radioactivas para detecção do sinal, não-radioativo sondas quimioluminescente ou fluorescentes também podem ser usadas (por favor, consulte a seção de discussão ).
   3. Coloque a membrana em uma garrafa de hibridação com o lado de DNA-limite, enxágue a membrana com 5 mL pré-aquecido tampão de hibridização e descartar o buffer. Em seguida, adicionar 10 mL de tampão de hibridização escaldadas e coloque a garrafa em um forno de hibridização rotativo definido a 65 ° C. Gire para ≥ 5 min.
   4. Calor-desnaturar 20 µ l de arenque de 10 mg/mL distorcido ou solução de DNA de esperma de salmão e a sonda ³²P-rotulado (≥ 10⁷ cpm) por 5 min, colocando os tubos em um conjunto de bloco térmico a 100 ° C. Então snap-chill-los no gelo para ≥2 min, rotação brevemente e manter no gelo até o uso.
      Cuidado: Para sondas de DNA radioativas, tubos de 1,5 mL com tampa de rosca e o-Ring devem ser usados.
   5. Adicione rapidamente o DNA de esperma desnaturado e sonda radioativa para o Buffer de hibridação em hibridação da frasco e agite bem o frasco para 10 s para misturar. Retornar o frasco para o forno de 65 ° C e incubar a garrafa com rotação a 65 ° C para ≥4 h.
   6. Uma vez que a hibridização é completa, parar a rotação, retire a garrafa de hibridação e então despeje a solução sonda radioativa em um tubo cónico de 50 mL com um tampão de selo plug estanques. Loja da sonda em um recipiente apropriado colocado no frigorífico designado para materiais radioactivos.
      Nota: Usado tampão de hibridização com uma sonda que é armazenada em 4 ° C pode ser re-usado pelo menos 5 vezes, colocando o tubo cónico de 50 mL com um tampão de selo plug estanques que contém o tampão de hibridização em um banho de água de 100 ° C por 5 min.
   7. Lavar a membrana com amortecedor da lavagem aquecida a 65 ° C. Adicionar 20 a 30 mL de tampão de lavagem para a garrafa de hibridação e rodar por 5 min. Repita este lavar 2 vezes mais.
      Nota: Medir a radioactividade das soluções de lavagem e gravá-la se necessário pelo Instituto local.
   8. Enquanto lavava a membrana, coloque um fósforo de imagem tela em uma borracha de imagem por 5 min.
   9. Após a terceira lavagem, remover a membrana da garrafa de hibridação, remover excesso tampão na membrana com toalhas de papel e colocar a membrana em um suporte de papel plástico transparente. Verifica sinais radioativos na membrana usando um contador Geiger. Expor a tela de fósforo apagados de imagem para a membrana durante 10 minutos durante a noite, dependendo da intensidade do sinal.
   10. Varredura de tela usando uma imagem de fósforo sistema de digitalização e obter os dados sobre a intensidade do sinal de cada ponto.
8. Análise de dados
   1. Desenhe uma curva de calibração usando software de análise dados e planilha (por exemplo, Excel).
      Nota: Regressão linear Log-log era usado para desenhar uma curva padrão.
   2. Determine o equivalente nanograma (ng-eq) para cada uma das amostras de DNA virais por interpolação. O ng-eq é a quantidade do plasmídeo de DNA usado para desenhar uma curva padrão que é equivalente ao número de moléculas de DNA virais. Quando o comprimento do ADN do plasmídeo é 8.000 bp, 1 ng-eq do ADN viral, single-stranded AAV corresponde a 2.275 x 10⁸ partículas.
      Nota: O ng-eq pode ser convertido para o número de partículas virais pelas seguintes equações:
      
      
      O número de partículas AAV convencionalmente é expressos como "vg" (vetor genomas) ou "DRP" (partículas de DNase eu-resistente).
   3. Calcule as concentrações de AAV das matérias-primas. Porque o DNA viral tricaína representa 66,7% do DNA viral nas matérias-primas, 1 ng-eq corresponde a 1,7 x 10⁹ partículas/mL .
      Nota: Esta correção não é necessária se todo o DNA viral contido em matérias-primas é borrado em uma membrana sem perda (ver Figura 1).

Resultados

Um resultado representativo de borrões ponto quantitativa para quantificação das existências de vetor AAV purificadas produzido em larga escala é mostrado na Figura 1. Com este ensaio de mancha de ponto, determinou-se o título de um estoque de vetor de AAV2G9-CMV-GFP de dupla-hélice. O vetor foi purificado por duas rodadas de cloreto de césio (CsCl) gradiente de densidade ultracentrifugação seguida de diálise como descrito anteriormente,²⁰

Discussão

Neste relatório, a utilidade dos ensaios de borrão ponto quantitativa para estudar AAV AAPs e seu papel na montagem do capsídeo é descrita. Conhecimentos adquiridos com estes estudos podem fornecer insights detalhadas sobre as diferenças inatas no processo de montagem de capsídeo do vírus adeno-associados e o papel funcional da AAPs entre diferentes sorotipos. A este respeito, o ponto de cruz-complementação de AAV VP3-AAP blot revelou que cobra AAV VP3 exibido uma dependência estrita a expressão co seu cognato AAP para m...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Benzonase	milliporeSigma	1016970001	Referido como endonuclease Serratia marcescen no texto principal.
DNase I	Roche	4716728001	referida como DNase I Enzima A no texto principal.
DNase I	Invitrogen	18047019	referida como DNase I Enzima B no texto principal.
DNase I	New England Biolabs	M0303L	Referido como DNase I Enzima C no texto principal.
Tubos de Microcentrífuga com Tampa de Rosca O-Ring Anexado de 1,5 mL	Corning	430909
Tubos de Microcentrífuga de 1,5 mL	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
Tubo Cônico de Polipropileno de 15 mL	Corning	352097
3 M Acetato de Sódio	Teknova	S0298
Tubo Cônico de Polipropileno de 50 mL	Corning	430291
Células AAV-293	Agilent	240073	linha celular HEK-293 otimizada para o empacotamento de vírions AAV.
AccuGENE 0,5 M EDTA Solução	Lonza	51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8,0	Lonza	51238
AccuGENE 10% SDS	Lonza	51213
AccuGENE 1X TE Buffer	Lonza	51235
Bio-Dot Aparelho	Bio-Rad	1706545
Soro Bovino Albumina	MilliporeSigma	A3294
DNA Clorofórmio	MilliporeSigma	372978
Cell Lifter	Corning	3008
	Wako Pure Chemical Industries	295-50201	Isso é usado para manchas de pontos quantitativas em vírus purificados. Usamos apenas metade do volume de todos os reagentes em cada etapa recomendada para o Esquema de Protocolo 2 no manual fornecido pelo fabricante.
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4,5 g/L)	Lonza	12-614F
ElectroMAX DH10B Cells	Thermo Fisher Scientific	18290015
Ethanol 200 Proof	Decon Labs	2716
Fetal Bovine Serum	VWR	1500-500
Ficoll 400	Alfa Aesar	B22095	Referido como Polysucrose 400.
Microscópio de fluorescência	Zeiss	Axiovert 40 CFL
Glicogênio	Roche	10901393001
Arenque Esperma DNA	Invitrogen	15634-017
Tubos de hibridização	Thermo Fisher Scientific	13-247-150
ImageQuant TL	GE Healthcare Life Sciences	ImageQuant TL
L-glutamina 200 mM	Lonza	17-605E
Cloreto de Magnésio Hexahidratado	MilliporeSigma	M0250
MicroPulser Electroporator	Bio-Rad	1652100
Mini Quick Spin DNA Columns	MilliporeSigma	11814419001
pAAV-RC2 Vector	Cell Biolabs Inc	VPK-422
Penicilina/Estreptomicina 10K/10K	Lonza	17-602E
Fosfato Tamponado Salino	Lonza	17-516F
de Exposição à Fosforimagem	GE Healthcare Life Sciences	Várias
Telas de Fosforografia	GE Healthcare Life Sciences	Vários
Plasmídeos Maxi Kit	QIAGEN	12162
Platinum Pfx DNA Polimerase	Invitrogen
Polietilenimina	Polysciences Inc	23966-2
Polivinilpirrolidona	MilliporeSigma	P5288
Prime-It II Kit de Rotulagem de Primer Aleatório	Agilent Technologies	300385
Primer AAP Forward (N25 nucleotídeos do 4º nucleotídeo no AAP ORF, RE1 é um local de enzima de restrição para clonagem): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA CGACGATGACAAA-N25	MilliporeSigma	Custom Primer
AAP Reverse (N25 são os últimos 25 nucleotídeos da AAP ORF, RE2 é um local de enzima de restrição para clonagem): TCTT-RE2-N25	MilliporeSigma	Custom Primer
Primer VP3 Forward (N25 os primeiros 25 nucleotídeos do VP3 ORF, RE1 é um local de enzima de restrição para clonagem): CTAA-RE1-CACC-N25	MilliporeSigma	Custom Primer
Primer VP3 Reverse (N25 são os últimos 25 nucleotídeos do AAP ORF, RE2 é um local de enzima de restrição para clonagem): TCTT-RE2-N25	MilliporeSigma	Custom Primer
Proteinase K Solution	Invitrogen	25530-049
Enzimas de Restrição	New England Biolabs	Vários
DNA de esperma de salmão	Invitrogen	15632011
Pipetas sorológicas Thermo	Fisher Scientific	13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
Cloreto de Sódio	Thermo Fisher Scientific	S271-10
Citrato de Sódio Tribásico Dihidratado	MilliporeSigma	C8532
T4 DNA Polimerase	New England Biolabs	M0203L
Termociclador	Eppendorf	6321000515
Placa de 6 poços tratada com cultura de tecidos	Corning
Tris Base	Thermo Fisher Scientific	BP152-5
Typhoon FLA 7000	GE Healthcare Life Sciences	28955809
UltraPure Buffer-Saturated Phenol	Invitrogen	15513-047
UV Crosslinker	Spectroline	XLE-1000	O modo de reticulação ideal é usado, fornecendo uma dosagem de energia UV de 120 mJ/cm2.
Membrana Zeta-Probe	Bio-Rad	162-0165