Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

Resumo

Apresentamos um método combinando dois fotões de imagem para gravar transientes de Ca^{2 +} em dendritos neuronais em fatias cerebral aguda e gravações de células inteiras remendo-braçadeira.

Resumo

Imagem de cálcio (Ca^{2 +}) é uma poderosa ferramenta para investigar a dinâmica spatiotemporal de Ca^{2 +} sinais intracelulares em dendritos neuronais. Flutuações de CA^{2 +} podem ocorrer através de uma variedade de mecanismos intracelulares e membrana e desempenham um papel crucial na indução de plasticidade sináptica e regulação da excitabilidade dendrítica. Portanto, a capacidade de gravar diferentes tipos de Ca^{2 +} sinais em ramificações dendríticas é valiosa para grupos estudando como dendrites integram informações. O advento da microscopia de dois fotões tenha facilitado tais estudos significativamente, resolvendo os problemas inerentes à imagem latente no tecido vivo, tais como a dispersão da luz e Fotodano. Além disso, através da combinação de técnicas eletrofisiológicas convencionais com dois fotões Ca^{2 +} imagem, é possível investigar o local Ca^{2 +} flutuações nos dendritos neuronais em paralelo com as gravações de atividade sináptica em soma. Aqui, descrevemos como usar esse método para estudar a dinâmica do locais transientes de Ca^{2 +} (gatos) em dendritos de interneurônios inibitórios gabaérgica. O método pode ser aplicado também ao estudo dendríticas Ca^{2 +} sinalização em diferentes tipos neuronais em fatias cerebral aguda.

Introdução

A contribuição de um neurônio para atividade da rede é largamente determinada pela natureza dinâmica das entradas sinápticas que recebe. Tradicionalmente, o método predominante de caracterizar a atividade sináptica nos neurônios baseou-se em gravações somática célula inteira remendo-braçadeira de correntes pós-sinápticas evocadas pela estimulação elétrica de axônios de passagem. No entanto, única atividade de sinapses proximalmente localizadas com sinceridade é relatada neste caso¹. Além disso, para avaliar os mecanismos específicos de sinapse, gravações de pares de neurônios e de dendrites num local específico têm sido utilizadas para atingir ....

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes de bem-estar dos animais do Comitê de proteção Animal de Université Laval e o Conselho canadense no cuidado Animal.

1. preliminar preparação (opcional: Prepare-se 1 dia de antecedência)

1. Prepare três tipos de solução artificial líquido cefalorraquidiano (ACSF) (Normal, sacarose e soluções de recuperação, 1L cada; ver tabela 1). Ajustar a pressão osmótica das soluções para 300 ± 10 mOsm²⁵ e esfriar a ACSF-sacarose até um ponto perto de congelamento (0-4 ° C).
   Nota: O uso de uma solução de corte baixo teor de sódio (AC....

Resultados

Usando o protocolo aqui apresentado, obtivemos gatos evocados por injeção atual somática e por estimulação elétrica em dendritos de oriens/alveus interneurônios na área CA1 do hipocampo. Depois de remendar um neurônio, identificado com base em sua forma e posição, adquirimos linescans através de um dendrite proximal em vários pontos no dado as distâncias do soma (figura 1A). Observamos uma diminuição da amplitude dos gatos induzido por backpropagating APs com.......

Discussão

O método mostrado aqui demonstra como a combinação de dois fotões Ca^{2 +} imagem e Eletrofisiologia do remendo-braçadeira pode ser usada para estudar dendríticas Ca^{2 +} sinalização nos dendritos neuronais em fatias cerebral aguda. Esse método permite o monitoramento de ambos as locais Ca^{2 +} elevações evocadas pela AP elétrica de estimulação ou backpropagating em segmentos dendríticas e resposta somática da célula. Isso torna uma excelente ferramenta para estudar como várias partes da árvore .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Linhagem Animal: Camundongo CD1	Charles River	022
Isoflurano	AbbVie Corporation	0B506-099
CGP 55845 cloridrato	Abcam	ab120337
Cloreto de cálcio	Sigma-Aldrich	C4901
D-(+)-Glicose	Sigma-Aldrich	G8270
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Cloreto de magnésio	Sigma-Aldrich	M8266
Sulfato de magnésio heptahidratado	Sigma-Aldrich	230391
Paraformaldeído em pó, 95%	Sigma-Aldrich	158127
Cloreto de potássio	Sigma-Aldrich	P3911
Gluconato de potássio	Sigma-Aldrich	P1847
Azida sódica	Sigma-Aldrich	S2002
Bicarbonato de sódio	Sigma-Aldrich	S8875
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	S5886
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
Triton X-100	Base Sigma-Aldrich	T9284
Trizma	Sigma-Aldrich	T1503
	Sigma-Aldrich	T3253
Fosfato de sódio dibásico di-hidratado	Sigma-Aldrich	71643
Fosfato de sódio monobásico monohidratado	Sigma-Aldrich	S9638
Biocytin	Sigma-Aldrich	B4261
Alexa Fluor 594 Hydrazide	ThermoFisher Scientific	A10438
SR95531 (Gabazine)	Abcam	ab120042
Trifosfato de adenosina (ATP)-Tris	Sigma-Aldrich	A9062
Guanosina (GTP)-Na+	Sigma-Aldrich	G8877
Oregon Green BAPTA-1	ThermoFisher Scientific	O6812
Sal de fosfocreatina di(tris)	Sigma-Aldrich	P1937
Alexa-546	ThermoFisher Scientific	S11225
Patch Capilares de Vidro de Borosilicato	World Precision Instruments	1B100F-4
Theta Capilares de Vidro de Borosilicato	Instrumento Sutter	BT-150-10
P-97 Extrator de Micropipeta Flamejante/Marrom	Instrumento Sutter
TCS SP5 Microscópio Confocal Multifotônico	Leica Microsystems
Chameleon Ultra II Ti:Laser multifotônico de safira	Software de
	Controlador de temperatura Leica Microsystems
TC-324B	Warner Instruments
Amplificador MultiClamp 700B Molecular	Devices
Digidata 1440A Digitizer	Molecular Devices
Confocal Tradutor	Siskiyou
Micromanipulador	Siskiyou
pClamp Software de Aquisição de Dados	Molecular Devices
A365 Isolador de Estímulo de Corrente Constante	World Precision Instruments
Vibraplane Optical Table	Kinetic Systems

Cloridrato de Trizma aquisição de imagens LAS AF coerente