O ovário de Drosophila é um sistema excelente modelo para estudar o desenvolvimento de nicho de células-tronco. Embora métodos para dissecando larvas e adultos ovários foram publicados, dissecções de ovário pupal requerem diferentes técnicas que não tenham sido publicadas em detalhe. Aqui nós esboçamos um protocolo para dissecar, coloração e montagem ovários pupal.
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Artigo de método
Dissecção e coloração dos ovários Pupal drosófila
Neste artigo
Resumo
Resumo
Ao contrário de ovários de Drosophila adultos, pupal ovários são relativamente difíceis de acessar e examinar devido a suas pequenas tamanho, translucidez e encerra dentro de um caso de pupa. O desafio de dissecação pupal ovários também reside na sua localização física dentro a pupa: os ovários estão rodeados por células de gordura corporal dentro do abdômen pupal, e essas células de gordura deve ser removidas para permitir a adequada anticorpos. Para superar estes desafios, este protocolo utiliza personalizadas pipetas Pasteur para extrair células de gordura corporal do abdome pupal. Além disso, uma lamela septada é usada no lugar de um tubo de microcentrifugadora durante o processo de coloração para melhorar a visibilidade das pupas. No entanto, apesar de estas e outras vantagens das ferramentas utilizadas no presente protocolo, execução bem sucedida destas técnicas ainda pode envolver vários dias de prática devido ao pequeno tamanho dos ovários pupal. As técnicas descritas neste protocolo poderiam ser aplicadas para experimentos de curso do tempo em que os ovários são analisados em vários estágios de desenvolvimento pupal.
Introdução
Investigação em células estaminais usando Drosophila ovários expandiu-se, amplamente, desde a primeira documentação de uma célula-tronco nicho1,2,3,4. Acompanhar o desenvolvimento de ferramentas de genética linhagem rastreamento, ovário de Drosophila dissecções foram comumente usadas para estudar as linhagens de células-tronco e sinalização de vias que regulam a manutenção de células-tronco, proliferação e destino no nicho de células-tronco. Conhecimento destas vias de sinalização pode produzir insights sobre causas potenci....
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Protocolo
1. ovíparos
- Combine-se aproximadamente dez do sexo masculino e 15 feminino adulto drosófila moscas do genótipo desejado em um frasco normal alimentos ricos em voar suplementados com levedura. Para evitar a superlotação do frasco, permitem que as fêmeas acasaladas para pôr ovos para não mais de 2 – 4 h14.
- Transferi os adultos do frasco para um frasco novo tocando o frasco abertura contra um frasco diferente com comida de mosca. Permitir que os ovos desenvolver-se em larvas em temperatura ambiente por 3 – 4 dias.
2. seleccionar as larvas femininas
- Usando um pincel fino úmido....
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Resultados
Execução bem sucedida deste procedimento deve resultar na mancha do anticorpo claro que revela a estrutura e organização celular de um ovário pupal da drosófila . Imuno-histoquímica descrita no presente protocolo pode ser usado para identificar tipos de células, comumente manchados em ovários de larvas e adultos. As células do caule pupal derivado enxame células18 (esboçado por Fasciclin III em branco) são mostrados na Figura 3
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Discussão
A etapa mais crítica e difícil do presente protocolo envolve a preparação de pupa ovários antes da fixação. Para garantir que os ovários, pequenos e enterrados por células de gordura corporal dentro do abdômen pupal, estão manchados suficientemente com anticorpos, é importante não só rasgar uma abertura grande no saco abdominal com fórceps, mas também extrair as células de gordura corporal que obstruem o ovários de anticorpos. Execução bem sucedida dessa etapa requer a aplicação de pressão sutil sobre o bulbo de pipeta P.......
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Divulgações
Os autores têm sem conflitos de interesse para declarar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada pelo National Institutes of Health (RO1 GM079351 de D.K.). Agradecemos Dorothea Godt dela conselhos úteis sobre dissecações de ovário pupal, baseado no seu protocolo original. Agradecemos também a Amy Reilein por sua assistência e comentários sobre o manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Dumont #5 Fórceps, biologia | Fine Scientific Tools | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| Microscópio de dissecação | Nikon | SMZ-10A | |
| Microscópio Confocal | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Software de análise | Carl Zeiss | Zen | |
| 9 Placas de Vidro para Depressão | Pyrex | 7220-85 | |
| Pipeta Pasteur | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Bulbo de pipeta Pasteur | Vários fornecedores | ||
| Bico de Bunsen | Vários fornecedores | ||
| Lâminas de Microscópio Fosco Premium Fisherfinest Thermo | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 22 x 22 mm lamínulas de vidro No 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Fita dupla face | Scotch | ||
| Nutator | Clay Adams | ||
| Pincel fino #0, #3-#5 | Vários fornecedores | ||
| Gilson Pipetman Starter Kit | Thomas Scientific | F167300 | Contém p20, p200, p1000 pipetadores |
| 16% Paraformaldeído | Microscopia Eletrônica Sciences | 15710 | Diluir para 4% de paraformaldeído em 1x PBS |
| Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | Diluir para 1x PBS Soro |
| de cabra normal | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | Diluir para 10% de soro de cabra normal em PBST com concentração |
| de 0,5% de TritonAnticorpos primários (no protocolo: 7G10 anti-Fasciclin III diluído 1:250, anti-fosfohistona H3 de coelho diluído 1:1000) | Vários fornecedores (no protocolo: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Diluir em PBST com concentração de 0,5% de Triton | |
| Anticorpos secundários (no protocolo: Alexa-546, soro anti-coelho conjugado com FITC) | Vários fornecedores (no protocolo: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Diluir em PBST com concentração de 0,5% de Triton | |
| Frascos para moscas | Denville Scientific | V9406 | |
| Bolas de algodão, para frascos largos | Genesee Scientific | 51-102W | |
| Yeast, Bakers Dry | Active MP Biomedicals | 101400 | |
| Alimento para moscas | Produzido em laboratório | Mistura de água, levedura de cerveja, fubá, melaço, ágar, EtOH, penicilina, metil 4-hidrobenzoato e ácido propiônico | |
| Moscas machos e fêmeas Drosophila (genótipo usado no protocolo: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Centro de Estoque |
Referências
- Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation. Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
- Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).
- Dansereau, D. A., Lasko, P.
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Reimpressões e permissões
