Artigo de método

Deteção e quantificação de Plasmodium falciparum em aquosa glóbulos vermelhos por atenuadas Total reflexão espectroscopia de infravermelho e análise de dados multivariada

DOI:

10.3791/56797

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2 de novembro de 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Biospectroscopy, Monash University, 2Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Nursing and Health Sciences, Monash University, 3Centre for Biomedical Research, Burnet Institute, 4Department of Medicine, University of Melbourne

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um protocolo para a detecção e quantificação de Plasmodium falciparum em infectados aquosas glóbulos vermelhos usando um espectrômetro infravermelho de reflexão total atenuada e análise multivariada de dados.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vamos demonstrar um método de quantificação e detecção de parasitas em aquosas células vermelhas do sangue (hemácias) usando uma simples bancada espectrômetro atenuadas Total reflexão Fourier Transform Infrared (ATR-FTIR) em conjunto com a análise de dados multivariada ( MVDA). 3 7 por p. falciparum foram cultivadas para parasitas de palco 10% parasitemia anel e usado para spike hemácias do doador fresco isolado para criar uma diluição de série entre 0 – 1%. 10 µ l de cada amostra foram colocadas no centro da janela de diamante ATR para adquirir o espectro. Os dados da amostra foi tratados para melhorar a relação sinal / ruído e remover a contribuição da água, e então aplicou-se a segunda derivada para resolver características espectrais. Os dados foram então analisados usando dois tipos de MVDA: primeiro Principal componente análise (PCA) para determinar quaisquer valores atípicos e regressão de mínimos quadrados parciais (PLS-R) para construir o modelo de quantificação.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Malária está entre as doenças mais devastadoras do nosso tempo; mais de metade da população vive em risco em regiões endêmicas e encargos desproporcionalmente o pobre1,2,3,4. Uma grande parte da questão é a portadores assintomáticos e primeiros pacientes de palco que atuam como reservatórios para mosquitos vetores5, causando picos de infecção durante a época chuvosa e permitindo que persistem nas comunidades. A malária é causada por parasitas de Plasmodium cinco, é o mais mortal do que por p. falciparum , que faz com que a forma mais grave da doença2.

Atualmente, técnicas para o diagnóstico da malária são menos do que perfeito. Microscopia óptica, o atual padrão-ouro, pode somente detectar parasitas 62-88 / µ l dependendo do método usado6. Além disso, devido à intensidade e alta habilidade necessária, em muitas regiões microscopia diagnósticos errados > 50% dos casos, especialmente aqueles com baixa parasitemia níveis2, que pode ser directamente atribuída à falta de recursos na área e resultados em o uso indevido de drogas contra a malária. Outros 2 principais métodos de diagnóstico são testes de diagnóstico rápido (RDTs), que utilizam anticorpos para a detecção e ensaios de reação em cadeia da polimerase (PCR), que discriminam e quantificar parasitas de DNA. Atualmente, o RDTs só são capazes de detectar por p. falciparum e p. vivax de pelo menos 100 parasitas / µ l de sangue, resultando em formas mais raras da doença a ser tratada. 7 , 8 em contraste, os ensaios PCR discriminar e quantificar as diferentes espécies de Plasmodium em uma sensibilidade de 0,0004-5 parasitas / µ l de sangue. No entanto, isso requer habilidade técnica, os equipamentos e reagentes caros e, portanto, não é adequado para o campo de aplicação.

Uma técnica altamente sensível, confiável e acessível é essencial para melhorar os tempos de diagnóstico e melhorando os resultados dos pacientes e possibilitando a eliminação da doença. Atenuada espectroscopia de Total reflexão Fourier transform (ATR-FTIR) oferece uma solução para este problema em potencial. Trabalhos anteriores mostraram que era possível detectar e quantificar por p. falciparum em metanol fixada filmes de sangue atingir os limites de detecção de < 1 parasita / µ l de sangue (< 0,0002% parasitemia)9, que é comparável aos métodos PCR. Estudos recentes têm mostrado que é possível detectar e quantificar parasitas em amostras aquosas e, assim, eliminar a etapa de fixação. No entanto, fatores tais como o vapor de água, ruído espectral e tratamento de dados precisam ser tomadas em consideração para obter melhores resultados10.

Este protocolo tem como objetivo mostrar novos usuários como adquirir espectros de FTIR-ATR e preparar um modelo de regressão para a detecção de p. falciparum de amostras aquosas glóbulos vermelhos (RBC)10.

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Protocolo

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Por favor, consultar apropriado folhas de dados de segurança Material (MSDS) e buscam a formação adequada do nível de biossegurança 2 (BSL-2). Todas as etapas de cultivo devem ser feitas em um gabinete de BSL-2 usando uma técnica asséptica, ou seja, há um risco de exposição à radiação UV prejudicial de medidas de descontaminação, ferimentos de agulha e exposição potencial biológica e infecção, se a cultura de parasita entra em todos os ferimentos. Além disso, o sangue das ações de bancos de sangue é somente selecionados para certas doenças e o potencial de propagação de doenças de sangue é um risco potencial. Procure ajuda médica imediata na ocorrência de lesões.

1. preparação e medição de 7 3 séries de diluições de parasita Plasmodium falciparum

Nota: Plasmodium SP. cultura é altamente sensível. Usar reagentes frescos/prescrita e alimentar os parasitas regularmente, alterando os meios de comunicação. Alimentar as culturas abaixo de 5% parasitemia cada segundo dia; alimentação de culturas entre 6-10% parasitemia uma ou duas vezes por dia; e alimentar de culturas entre 11-20% até 4 vezes por dia. Parasitas que estão começando a passar fome perderá sua forma e começam a se contrair. Nesse caso, alimentar e diluir imediatamente alterando os meios de comunicação e adicionar estoque RBCs. coletar o sangue do doador em tubos de colheita de sangue contendo heparina como anticoagulante e medida dentro as primeiras 6 horas.

  1. Cultura um total de 30 mL de 3-7 estirpe parasitas Plasmodium falciparum de acordo com o protocolo padrão até a parasitemia atinge 10% anéis.
  2. Sincronização de parasitas
    1. 11 h após shizogeny no ciclo de vida do parasita, Ressuspender a cultura e transferir para um tubo cônico de 50 mL com uma pipeta automática.
    2. Centrifugar a cultura de 300 – 400 x g e condições padrão de laboratório (25° C e 100 kPa) por 5 min.
    3. Retire o sobrenadante por desenhá-lo com uma pipeta ou com uma pipeta Pasteur anexada a um vácuo sem perturbar o sedimento. Descarte resíduos de mídia em uma solução 10%.
    4. Lentamente, adicionar 12 – 15 mL de solução a 4% sorbitol ao pellet usando uma pipeta automática e misturar a cultura por tampando e inversão do tubo até que a cultura é homogênea.
    5. Incube a cultura a 37 ° C por 15 min.
    6. Centrifugar a cultura de 300 – 400 x g e condições padrão de laboratório por 5 min.
    7. Remova o sobrenadante conforme descrito na etapa 1.2.3.
    8. Adicionar 10 a 15 mL de soro fisiológico a 0,9% para a pelota e misturar a solução por tampando e inversão do tubo até que a cultura é homogênea.
    9. Repita as etapas 1.2.6–1.2.8 mais duas vezes para lavar todos os vestígios de sorbitol.
  3. Preparação da série de diluição de parasitemia
    1. Lave o estoque RBCs como em passos 1.2.6–1.2.9.
    2. Centrifugar a cultura em condições de laboratório padrão, estoque hemácias em 300 – 400 x g durante 5 min e descartar o sobrenadante como na etapa 1.2.3.
    3. Rotular microcentrifuga tubos como 0%, 0,010%, 0,025%, 0.075%, 0,100%, 0,250%, 0.750% e 1.000% e adicionar 0 µ l, 1 µ l, 2,5 µ l, 7,5 µ l, 10 µ l, 25 µ l, 75 µ l e 100 µ l de cultura respectivamente, usando uma pipeta de µ l de 0.2-20.
    4. Adicione 100 µ l µ l 99, 97,5 µ l, 92,5 µ l, 80 µ l, 75 µ l, 0 e 25 µ l de estoque hemácias ao tubos rotulados 0%, 0,010%, 0,025%, 0.075%, 0,100%, 0,250%, 0.750% e 1.000%, respectivamente.
    5. Centrifugue o fresco dador de sangue colhida em tubos anticoagulantes em 1.200 x g e condições padrão de laboratório para 10 min.
    6. Remova o plasma por desenhá-lo com uma pipeta e descartando conforme descrito na etapa 1.2.3.
    7. Adicionar 900 µ l de hemácias isoladas em cada tubo microcentrifuga e homogeneizar por inversão x 10.
  4. Aquisição de espectral
    1. Usando o programa de aquisição espectral que acompanha, clique em "Configuração do instrumento" e definir os parâmetros de coleta de dados para o seguinte: 128 varreduras para plano de fundo; 32 varreduras para amostra; e resolução de 8/cm sobre o intervalo de amostra máxima do instrumento.
    2. Regule a temperatura do espectrómetro ATR-FTIR por recomendação do fabricante ou durante a noite.
    3. Limpe o cristal esfregando suavemente em movimentos circulares usando algodão livre lenços umedecido com água ultrapura. Em seguida, seque cuidadosamente usando outra limpeza livre de fiapos.
    4. Tome uma medida de fundo do ar, clicando em "Medição de fundo". Cada 20 min, limpe o cristal como na etapa 1.4.3 e repita essa medição.
    5. Abra a visualização ao vivo clicando em "Visualizar". Observe uma linha de base plana, horizontal que indica que o cristal está limpo.
    6. Pipete 10 µ l de água desionizada directamente para o meio do cristal e clique em "Amostra de medida". Repita esta medição de água após cada amostra quinta.
    7. Seque o cristal usando uma limpeza livre de fiapos e suaves movimentos circulares.
    8. Pipete 10 µ l de amostra e clique em "Amostra de medida".
    9. Limpe o cristal entre as amostras como na etapa 1.4.3.
    10. Repita até 3 repetições são adquiridas, certificando-se de embaralhar a ordem de ambas as amostras e as repetições.

2. análise de dados multivariada (MVDA)

Nota: Tratamento de dados deve ser feito ao longo de todo o conjunto de dados a fim de evitar o ruído e a adição de picos de origem não biológica. Em contraste, analisar sobre as regiões biologicamente relevantes: 2980-2800/cm e 1750-850/cm.

  1. Tratamento de dados
    Nota: Dois software, por exemplo, Matlab (doravante referido como software 1) e The Unscrambler X (doravante referido como software 2) são utilizados como exemplos para MVDA. 1 o software tem a capacidade de executar MVDA sem a adição de uma interface de usuário gráfica (GUI). No entanto, é aconselhável comprar um GUI (Tabela de materiais). As instruções a seguir quando se referindo ao software 1 assumirá que é em conjunto com a caixa de ferramentas GUI disponível comercialmente, e o script de tratamento de dados de exemplo foi anexado.
    1. Abra o software de análise de dados multivariada apropriado, clique em "Importar dados" e selecione o tipo de arquivo para análise.
      1. Em software 1, entrada "Análise" na janela de comando para abrir o GUI. Botão direito do mouse na caixa de X para encontrar "Importar dados".
      2. Em 2 de software, clique na guia "Arquivo" para encontrar a "Importação".
    2. Importar os espectros de amostra, a água e a linha de base como conjuntos de dados na área de trabalho selecionando todos os espectros em cada conjunto separadamente e clicando em "Abrir" e dar a cada conjunto um nome curto, por exemplo, 'wat' para conjunto de dados de espectros de água.
    3. Selecione a nova tabela/matriz, clicando em "nova matriz/vetor" e gerar um vetor n × 1, onde n é o número de amostras. A parasitemia de cada amostra de entrada e dê o vetor o nome 'Parasitemia'.
      1. Em software 1, clique em "Nova variável" na janela de comando.
      2. Em 2 de software, clique no ícone "Nova matriz".
    4. Plotar os dados clicando no "plotar dados ícone". Inspecione os espectros para efeitos de vapor de água clicando em "Zoom" e zoom em 1800-1400/cm; mais claramente observado como picos curtos, afiados, estreitos ao longo das encostas de Amida eu e Amida bandas II.
    5. Em casos extremo de vapor de água, abra a guia Editar/pre-process de dados e selecione "Smoothing". Reduzir o ruído e/ou contribuições de vapor de água forte, alisando os espectros de amostra e água usando até 25 pontos de suavização ou usar um método de correção de vapor de água.
    6. Correta não horizontais linha de base usando o algoritmo de correção de base, se for o caso, sob a guia de edição/pre-process dados mesmo na etapa 2.1.4.
    7. Média água espectros e copie as linhas em uma matriz de m × n equivalente para o conjunto de dados de amostra e reduzi-la a intensidade de 70%, multiplicando-o por 0,7.
      1. Em software 1, fazê-lo na janela de comando inserindo o seguinte script "AverageWater=mean(WaterDataset)". Em seguida, copiar e colar as linhas para coincidir com o conjunto de dados de amostra. Para reduzir a intensidade, a entrada "AverageWater70 = AverageWater * 0.70".
    8. Subtrai os espectros de água média de cada espectro da amostra.
      1. Em software 1, fazê-lo na janela de comando inserindo o seguinte script "WaterCorrectedData = SampleDataset-AverageWater70".
    9. Abra a guia Editar/pre-process dados para aplicar uma segunda função de derivativos e em seguida normalizar os dados, selecionando a função única normal variada (SNV) e dados do centro.
      1. Em software 1, fazê-lo de uma só vez. Primeiro, selecione "Derivativos" e entrados 25 pontos de suavização, ordem polinomial de 3 e derivado ordem na amostra definida usando uma função de Savitzky-Golay e 25 pontos de suavização. Em seguida, selecione "SNV" e "Quer dizer centro". Clique em "Okey/aplicar".
    10. Abra a guia Editar/pre-process de dados e na "Coluna variáveis", selecione 2.980 – 2.800/cm e 1.750 – 850/cm, certificando-se que apenas suas caixas estão marcadas.
  2. Análise de dados
    1. Análise de componentes principais (PCA)
      1. Clique em "análise | Decomposição"e selecione PCA.
        1. Em 1 de software, clique em "Construir o modelo".
        2. Em software 2, os PCA métodos de entrada. -No presente trabalho, 7 - o número ideal de componentes principais (PCs) de entrada e um máximo de 100 iterações e selecione a validação cruzada para o método de validação. Clique em "Executar".
      2. Observe o limite de confiança de 95%, o anel tracejado, sobre a trama de escores entre PC1 e PC2.
      3. Marca os espectros de amostra com pontuações que ocorrem fora do limite como outliers potenciais usando a "ferramenta de espectros selecione".
      4. Se os espectros marcados tem alto Hotellings T2 valores e altos resíduos Q excluem-los de uma análise mais aprofundada.
    2. Regressão de mínimos quadrados parciais (PLS-R)
      1. Clique em "análise | Regressão"e selecione"PLS-R".
        1. Em software 1, clique direito Y bloco e selecione o vetor "Parasitemia | Construa o modelo".
        2. Em software 2, os PLS-R métodos de entrada. Selecione o vetor "Parasitemia" como a referência de"Y" e o conjunto de dados de amostra como "X conjunto dados" e selecione a validação cruzada como o método de validação. Clique em "Executar".
      2. Analise o modelo de regressão. Valores de2 R acima de 0,80 e raiz quadrada erro de validação cruzada (RMSECV) valores de menos de 0,1% parasitemia são modelos aceitáveis.
      3. Analisar o vetor de regressão e identificar as bandas biológicas.

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Resultados

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Plotagem de mínimos quadrados parciais (PLS-R) e seu vetor de regressão associado, Figura 1a e 1b respectivamente, mostram que o sinal dos parasitas são bastante distintas de hemácias que podem ser usados para formar uma regressão linear do modelo a ser usado para o Previsão de parasitas em futuros conjuntos de dados.

Um modelo robusto, linear de PLS-R foi gerado com um valor de R-q...

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Discussão

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PLS-R modelo é um método multivariado supervisionado que encontra uma relação linear, Y = bX + E, entre as variáveis preditivas X (aqui, a absorvância a cada número de onda) e uma variável Y contínua (aqui, o nível de parasitemia). Em suma, o modelo combina as variáveis em X para criar um novo conjunto de variáveis latentes (LVs) que captam a variação no X correlacionada com Y e calcula um vetor de regressão (b) que multiplicado por um novo resulta de espectro na estimativa do valor y. A força do modelo pode ser tomada a...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Financiamento para os autores foi fornecido pelo Conselho australiano de pesquisa (futuro Fellowship FT120100926 a BRW), nacional de saúde e médico pesquisa Conselho da Austrália (programa grant e bolsa de pesquisa sênior para JGB; Bolsas de carreira precoce JSR; Infraestrutura para pesquisa institutos de concessão de regime de apoio ao Instituto Burnet), e a infra-estrutura operacional de governo de Victorian estado apoiar Grant ao Instituto de Burnet. Reconhecemos o Sr. Finlay Shanks para apoio instrumental.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Sangue do doador-Deve ser coletado por um médico treinado
Sangue de estoqueCruz Vermelha Australiana '-
3D7 Plasmodium falciparumA cepa do BurnetInstitute-Laboratoryequivalente ao tipo selvagem
RPMI-1640 mídia com L-hepes sem bicarbonato de sódioSigma AldrichR6504
Albumax (Gibco)ThermofisherE003000PJAlíquota em tubos de falcão de 50 mL e armazenar no freezer
Bicarbonato de sódioSigma AldrichS5761
Giemsa StainSigma Aldrich48900
SorbitolSigma AldrichS1876Deve ser filtrado antes do uso em cultura
Tubos de coleta de sangue (Vacutainers)Becton, Dickonson and Company367671
Óleo de imersãoThermofisherM3004
50 mL placas de culturaFalcon353025
pontas de pipeta de 25mLFalcon357515
pontas de pipeta de 10mLFalcon357530
Lâminas de microscópioSigma AldrichS8902
Tubos de centrífuga 50 mLSigma AldrichT2318
Controlador de pipeta automatizadoIntegra-biosciences155 015
Centrífuga Sorvall Legend X1RThermofisher75004260
Forma™ 310 Incubadoras de CO2 de Calor DiretoThermofisher310TS
Nikon Eclipse E-100 Microscópio BinocularNikon InstrumentsE100_2CE-MRTK-1Ao comprar, certifique-se de que a lente 100x é um óleo lente de imersão
Espectrômetro Bruker Alpha Ft-IR com Acessório ATR Quick SnapBruker9308-3700 Certifique-sede solicitar o acessório "Eco-ATR" ao comprar
software de análise de dados multivariadosMatlabMathworks Inc
O Unscrambler XCAMOSoftware de análise de dados multivariados
PLS-ToolboxMathworks, Inc.GUI para Matlab
o

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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