Gravação de Intracavernosal pressão para avaliar a função erétil em roedores

Resumo

Gravação de pressão Intracavernosal (ICP) é um método importante para avaliar a função erétil de animais experimentais. Aqui, um protocolo detalhado é demonstrado para o procedimento de gravação do ICP catheterizing o pênis crura e então eletricamente estimulando os nervos cavernosos em ratos.

Resumo

Disfunção erétil (ED) é definida como a incapacidade de alcançar ou manter uma ereção do pênis, e isso se tornou um distúrbio sexual masculino predominante. Roedores são empregados por muitos estudos de investigação a fisiologia/patologia da função erétil. A função erétil em roedores pode ser avaliada medindo-se a pressão de intracavernosal (ICP). Na prática, o ICP pode ser monitorado após a estimulação elétrica do nervo cavernoso (CNs). A pressão arterial da artéria carótida (a pressão arterial média) é usada como referência para ICP. Usando ICP protocolos de gravação, muitos parâmetros-chave de função erétil podem ser medidos a partir da curva de resposta do ICP. A medição de ICP fornece mais informações do que o teste de ereção peniana induzida por apomorfina e é mais barata que o monitoramento Telemétrico do pênis corpus spongiosum, tornando este método esse mais popular para avaliar a função erétil. No entanto, em comparação com o teste realizado facilmente induzida por APO a função erétil, gravações bem sucedidas do ICP requerem atenção aos detalhes, prática e aderência ao método de operação. Neste trabalho, uma introdução à gravação de ICP em ratos é fornecida para complementar o procedimento de forma eficiente.

Introdução

ED é definido como a incapacidade de alcançar ou manter uma erecção do pénis e tornou-se um distúrbio sexual masculino comum¹. Animais experimentais são utilizados e fornecem modelos reprodutíveis para investigar a função erétil². Por um longo tempo, vários modelos animais maiores têm sido empregados para investigar a função erétil^3,4,5. Embora os roedores são relativamente pequenos em comparação com outros animais, eles também são usados para o estudo da disfunção erétil masculina devido exibindo várias vantagens⁶. Primeiro, as características sexuais morfológicas e funcionais dos seres humanos são recapituladas em roedores. Em segundo lugar, em comparação com animais maiores, utilizados nos estudos de ED, roedores são mais econômicos comprar, casa e manter. Modelos de roedores geneticamente modificados, terceiros fornecem vantagens em estudos comportamentais, bem como neurofisiológicos reprodutíveis e subsequentes. Portanto, roedores tornaram-se rapidamente os principais animais utilizados no estudo da disfunção erétil masculina.

Beneficiando de uma base genética pura e as condições de cultura consistente, modelos de roedores forneceram dados consistentemente reprodutível^5,6,7,8. Entre os numerosos estudos disponíveis relacionados a muitos aspectos das funções erétil, a apomorfina (APO)-teste de resposta erétil induzida e o teste de resposta do ICP induzido por estimulação elétrica são os métodos mais utilizados que reflectem fielmente erétil função^9,10,11,12. O teste de função erétil induzida por APO, desenvolvido por Heaton et al ¹³, é um bioensaio que utiliza o fenômeno que a administração da apomorfina para ratos provoca ereções e bocejos. Como um fácil, não invasivo e estável bioensaio para avaliar a função erétil, o teste de função erétil induzida por APO é amplamente utilizado em muitos estudos. No entanto, este ensaio não reflete adequadamente a qualidade das ereções ou as mudanças dinâmicas no fluxo sanguíneo associado com uma resposta erétil¹⁴. Medições de ICP foram inicialmente desenvolvidas pela Quinlan et al ¹⁵. neste método, um cateter é colocado na artéria carótida para medir a pressão arterial sistêmica, e outro cateter é inserido no corpo cavernoso crus para gravar o ICP. Antes ou durante o ICP de gravação, um agente vasoativas e/ou estimulação elétrica de campo do gânglio pélvica principal (MPG) ou NC muitas vezes foram dadas a ratos¹⁴. Este ensaio tem sido uma ferramenta confiável para avaliar as terapias e medicamentos para ED e provavelmente irá ser usado como um método de avaliação vital no futuro⁶.

Comparado com o teste realizado facilmente induzida por APO a função erétil, gravações de ICP sucesso requerem atenção aos detalhes, prática e aderência ao método de operação. Portanto, aqui, nós fornecemos uma descrição detalhada de como realizar a gravação do ICP.

Protocolo

Três meses e 18 meses de idade ratos Sprague-Dawley foram utilizados no presente estudo. Todos os animais foram tratados em conformidade com as diretrizes do NIH para o cuidado e o uso de animais de laboratório. Procedimentos envolvendo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de ética e local institucional Animal conta com um esforço para minimizar o sofrimento dos animais. Os protocolos foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) na Universidade de tecnologia de Nanquim (Nanjing, China) e institucional Cuidado Animal.

Os ratos foram divididos em dois grupos de acordo com sua idade e desempenho preliminar no teste de função erétil induzida por APO antes da gravação do ICP: o jovem normal (grupo YN) e disfunção erétil envelhecido grupo (grupo AE)¹⁰.

1. preparação antes da cirurgia

1. Fazer manualmente um par de eletrodos bipolares para a gravação do ICP (Figura 1). Ligeiramente dobrar as extremidades dos eletrodos e ajustar a distância entre dois eletrodos para 1-2 mm de largura, como mostrado na figura 1A.
2. Conecte os eletrodos do estimulador usando duas pinças crocodilo (figura 1AB).
3. Montar o sistema de cateter: Primeiro, conecte uma agulha hipodérmica de 23G para uma torneira de 3 vias com tubulação e, em seguida, ligue a torneira para o transdutor de pressão. Em seguida, anexe uma seringa de 10 mL para o terceiro participante da torneira para fornecer solução salina de heparina.
4. Verifique cuidadosamente para detecção de fugas depois de todo o sistema de enchimento com heparina soro fisiológico (200 U/mL). Em seguida, vire a torneira de 3 vias para fechar o canal de seringa ou o canal de transdutor de pressão (Figura 1).
5. Levante a agulha 20 cm acima do nível do forro de madeira. Então calibrar a pressão gravação sistema a 20 cm H₂O. Depois disso, mova a altura da agulha para verificar a precisão do sistema de gravação. Repita a calibração até que a precisão foi confirmada.
6. Transferir os ratos da instalação de animais para a sala de cirurgia e permitir que eles se acostumaram à sala de cirurgia para pelo menos 30 min.
7. Os instrumentos esterilizados são pulverizados com etanol a 70% antes da cirurgia

2. procedimento de cirurgia

1. Anestesiar o rato com uma injeção intraperitoneal de pentobarbital de sódio na dose de 45 mg/kg de peso corporal e esperar 5-10 min. beliscar os dedos para confirmar uma anesthetization adequada.
2. Raspar a pele do abdômen e pescoço com um barbeador elétrico e coloque o rato sobre as costas de uma almofada de aquecimento.
3. Limpe a área de cirurgia com bolas de algodão embebida de solução iodo-povidona 10% seguidas de bolas de algodão embebido de etanol a 70%. Além disso, aplica a pomada oftálmica para impedir que os olhos sequem.
4. Cateterismo da artéria carótida esquerda.
   1. Segure a pele do pescoço com a pinça e fazer uma incisão horizontal no meio do pescoço. Entalha os músculos, cuidadosamente expor a artéria carótida esquerda e isolar uma seção de 5 mm do navio.
   2. Cuidadosamente separar a artéria carótida do nervo vago usando fórceps, desenhar uma sutura seda sob a artéria carótida e colocar uma gravata solta na extremidade caudal da embarcação, então faça outro nó apertado na extremidade cranial do navio.
   3. Caudalmente prenda o navio com uma pinça de buldogue acima da sutura para parar o fluxo de sangue.
   4. Cuidadosamente com tesoura microcirúrgica, fazer uma incisão no navio e inserir o cateter arterial para o coração, com o auxílio do gancho e pinça microdissecando.
   5. Apertem a ligadura caudal solta em volta do cateter para fixá-la. Remova a braçadeira de buldogue para recuperar o fluxo de sangue.
5. Isolar o CN e coloque o eléctrodo
   1. Levante a pele e o músculo do abdômen com um par de pinças. Com a tesoura de dissecação, corte o abdômen inferior ao pénis tornar-se uma incisão mediana.
   2. Empurre suavemente o intestino com cotonete na parte superior da cavidade abdominal.
   3. Segure a bexiga com um par de pinças e puxe a bexiga da cavidade abdominal. Expor os lóbulos ventrais da próstata, que está localizado na porção ventral da uretra.
   4. Retire os lóbulos ventrais da próstata, vesículas seminais e deferente para expor o lobo dorsal da próstata. Encontre o ponto de aderência dos canais deferentes e próstata.
   5. Separe o espaço entre a próstata e o canal deferente. Expor cuidadosamente a cápsula fibrosa, que situa-se posterior ao ponto de junção da próstata e ducto deferente. Em seguida, encontre o gânglio pélvico principal (Figura 2).
      Nota: O gânglio pélvico principal e nervos cavernosos podem ser vistos na superfície da próstata.
   6. Área CN cuidadosamente seca com um cotonete estéril. Cuidadosamente, isolar e gancho do nervo cavernoso bem com os eletrodos bipolares.
6. Cateterismo da Crura esquerdo
   1. Corte uma pequena incisão na pele do pênis com uma tesoura dissecação e então cuidadosamente DDE a pele do eixo do pênis.
   2. Disse a musculatura estriada do pênis. Encontre o ramo superior do osso púbis.
   3. Expor o músculo bulbospongiosus, que cobre a lâmpada spongious.
   4. Divida o músculo bulbospongiosus do músculo isquiocavernoso usando pinça curvada.
   5. Cuidadosamente, isolar o músculo isquiocavernoso com pinça curvada e em seguida, corte o músculo isquiocavernoso para expor a branca túnica albugínea do corpo cavernoso crus.
   6. Seguindo a direção anatômica do corpo cavernoso crus, cuidadosamente Insira a agulha no corpo cavernoso crus através da branca túnica albugínea.
      Nota: Este é um passo crucial para o sucesso cateterismo. Pode ser injectada uma pequena quantidade de soro fisiológico heparinizado, e uma ligeira tumescência peniana deve ser observada, se a agulha foi inserida corretamente.
   7. Com cuidado, solte a agulha e evitar qualquer deslizamento da agulha ou ruptura do tubo de ligação. Verifique se há algum vazamento.

3. estimular o CN

1. Abra o programa de software para a gravação do sinal de pressão e iniciar a gravação do sinal de pressão.
2. Definir os parâmetros da estimulação: 15 Hertz, largura de pulso de 5 milissegundos, 5 volts e uma duração de 60 s. Estimule a CN em uma frequência de 15 Hz com uma largura de pulso de 5 ms.
   Nota: Um aumento acentuado do ICP pode ser observado durante a aplicação da estimulação elétrica.
3. Permita um intervalo de descanso de 30 minutos entre estímulos. O máximo de estimulação consecutivo em cada animal é três vezes.

4. pôr fim ao regime

1. Depois da gravação, administre eutanásia injetando uma overdose de pentobarbital de sódio na dose de 150 mg/kg de peso corporal. Confirme a morte de ratos, verificando a sua pressão arterial. Remover os ratos e limpar as ferramentas de cirurgia.

5. análise de dados

1. Salvar e exportar os dados a partir do software. A resposta é comumente expressa como a relação do ICP para sistêmica pressão arterial média (mapa). A relação do pico ICP/mapa foi calculada para avaliar a função erétil.
2. Dados da piscina de pelo menos cinco ratos e analisar com software estatístico. As diferenças são consideradas estatisticamente significativas quando p < 0.05, usando o teste t de Student.

Resultados

Numerosos estudos têm demonstrado que a disfunção erétil em idade machos está se tornando um problema comum. No entanto, tratamento médico é limitado na gestão de relacionadas ao envelhecimento ED¹⁶. Em modelos de roedores de ED relacionadas ao envelhecimento, muitas terapias são testadas na função erétil de ratos envelhecidos. Conforme apresentamos acima, o teste de gravação do ICP pode ser usado para distinguir os animais ED da população total de animais experime...

Discussão

Como uma medida direta da função erétil, o ICP é um método confiável de¹⁴. Isso permite a aquisição de dados na ICP basal, pico ICP, planalto ICP, tempo de ereção e detumescence tempo, duração da resposta, etc. Além destes direcionar parâmetros medidos, existem alguns outros parâmetros de índice: (1) "T80", o tempo para chegar a 80% do pico ICP; (2) "D20", a hora de diminuir para 20% do pico ICP; (3) "ΔT80", a taxa de aumento da pressão (por segundo) em T80; e (4) "ΔD20", a taxa de diminu...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Animal
Ratos			Linhagem: Sprague-Dawley Idade: 2-3 meses
Ratos			Tensão: Sprague-Dawley Idade: 15-18 meses
Nome	Empresa	Número de Catálogo	Comentários
Reagentes
Salino	Sigma-Aldrich, S7653		dissolver 8,5 gramas de cloreto de sódio em água destilada
Solução de pentobarbital sódico	Sigma-Aldrich, P3761		dissolver 1 grama em 100 ml de solução salina
Povidona-iodo	BTP Pharmaceutical Co. Limited		10% (V/V)
Etanol	China National Pharmaceutical Group Corporation (SINOPHARM)		70% (V/V)
Heparina	Sigma-Aldrich, H3149		dissolve a heparina 20000U em 100 ml de solução salina
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Materiais
Agulha hipodérmica	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd.	Seringa 23G
	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd	10 ml
Torneira de três vias Fábrica de	Chengdu	TSK 01
Eletrodo Fábrica de	instrumentos de Chengdu	JST-1
Tubo de cateter	Fábrica de instrumentos de Chengdu	PE-10, PE-50
Tesoura de operação Equipamento de	operação de Xangai fábrica	J22010, J22020
tesoura de operação oftálmica	Shanghai fábrica de equipamentos de operação	Y00010, Y00020
pinça oftálmica	fábrica de equipamentos de operação de Xangai	JD1010, JD1020
MicroScissors	World Precision Instruments	WAA260
sutura de seda	Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd.	5-0
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Equipamento
Estimulador	Nanjing medease science and technology co. ltd (modelo 4C501H)		15 Hz, pulso de 5 ms, 5 V, duração de 60 s e intervalo de 5 minutos
Sistema de processamento de coleta de sinal multicanal	Nanjing medease science and technology co., ltd (modelo 4C501H)		Modelo de pressão
arterial Transdutor de pressão	Beijing Xin Hang Xing Ye Technology Trading Company Limited (modelo YP100)		40KPa