Artigo de método

Mycobacterium tuberculosis em camundongos com fluorescência de enzima do repórter de imagem

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DOI:

10.3791/56801

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26 de fevereiro de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center, 2Tuberculosis Research Section, Laboratory of Clinical Infectious Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Descrevemos a imagem óptica de camundongos infectados com Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) usando fluorescência de enzima repórter (REF). Esse protocolo proporciona uma detecção sensível e específica de M. tuberculosis em modelos animais pré-clínicos para investigação patogenia, terapêutica e vacina.

Resumo

Fluorescência de enzima repórter (REF) utiliza substratos específicos para enzimas presentes em organismos alvo de interesse para a imagem latente ou detecção por fluorescência ou bioluminescência. Nós utilizamos BlaC, uma enzima constitutivamente expressada por todas as cepas de M. tuberculosis . REF permite rápida quantificação de bactérias nos pulmões de ratos infectados. O mesmo grupo de ratos pode ser fotografado em muitos pontos do tempo, extremamente reduzindo custos, enumerando as bactérias mais rapidamente, permitindo que novas observações em interações patógeno-hospedeiro e aumentar o poder estatístico, desde que mais animais de cada grupo são facilmente mantidos . REF é extremamente sensível devido à natureza catalítica do repórter enzimática BlaC e específicas devido à transferência de energia de ressonância de flourescence personalizado (FRET) ou fluorogenic carcaças usadas. REF não requer cepas recombinantes, garantindo interações patógeno-hospedeiro normal. Descrevemos a imagem latente da infecção por M. tuberculosis utilizando um substrato de traste com emissão máxima em 800 nm. O comprimento de onda do substrato permite que a imagem sensível tecido profundo em mamíferos. Nós irá delinear a infecção de aerossol de ratos com M. tuberculosis, anestesia de ratos, a administração do substrato REF e óptico de imagem. Este método tem sido aplicado com sucesso para avaliar interações patógeno-hospedeiro e a eficácia dos antibióticos visando o M. tuberculosis.

Introdução

A taxa de crescimento lento de M. tuberculosis é um obstáculo importante no diagnóstico rápido da tuberculose1,2,3. Enquanto a cultura com base em diagnóstico leva semanas para produzir resultados, esfregaço ácido-álcool resistentes tem limitações de diagnóstico4 em crianças de5 e pacientes co infectados com o vírus da imunodeficiência humana6,7. Tecnologias de imagem ópticas têm sido reconhecidas recentemente como uma alternativa aos tradicionais métodos de diagnóstico para tuberculose8,9. Fluorescência e bioluminescência podem ser usados para a imagem opticamente M. tuberculosis em animais vivos em tempo real10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19. Imagem latente ótica tem o benefício de uma avaliação rápida e específica de uma infecção com M. tuberculosis20,21,22.

Nós esboçamos detalhes para a imagem latente ótica de M. tuberculosis em ratos ao vivo usando REF. Este método é muito específico e sensível23,24 e, semelhante a outros métodos ópticos, é menos caro do que outros métodos de tuberculose (TB) de imagem25, incluindo tomografia computadorizada (CT)26, magnético ressonância de imagem (MRI)27e F-fluorodeoxyglucose a tomografia por emissão de pósitrons/CT (F-FDG PET-CT)28. REF utiliza personalizados substratos fluorescentes ou bioluminescentes que após clivagem por uma enzima bacteriana, produzir um produto fluorescente8,29. Portanto, tem a vantagem de não exigir uma estirpe de recombinantes repórter micobacteriana30,31. O substrato FRET descrito é composto por um fluorocromo e um quencher conectado por um anel β-lactâmico que é hidrolisado pela BlaC (β-lactamases), naturalmente constitutivamente expressado por tuberculose-complexo Mycobacterium8, 32. as bactérias diretamente geram sinal devido à atividade catalítica de REF que permite a amplificação por muitas ordens de magnitude e detecção sensível de M. tuberculosis.

O substrato REF utilizado neste estudo tem tecido excelente penetração em animais vivos e reduzido fundo devido ao seu longo comprimento de onda. Com esse substrato de longo comprimento de onda é possível alcançar um limite de detecção para M. tuberculosis de quase 100 formadoras de unidades (CFU) em vitro e < 1000 CFU nos pulmões de ratos na vivo (todo animal)8, 33. REF pode ser usado como uma ferramenta de diagnóstico para expectoração, materiais clínicos e até mesmo diretamente em pacientes com micro sistemas endoscópica16,32,33,34 devido a sua alta sensibilidade e especificidade. REF pode ser aplicado a qualquer tensão clínica de tuberculose, porque usa uma enzima bacteriana produzida naturalmente, BlaC, para a deteção presente em todas as estirpes. Estas características fazem REF imagem uma ferramenta valiosa na pesquisa pré-clínica tuberculose em geral para facilitar a terapêutica e avaliação de vacinas, bem como a análise de patogênese, mas também, em última análise, podem ser aplicadas ao diagnóstico de tuberculose pacientes.

Protocolo

Estudos em animais foram realizados em conformidade com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê de Texas A & M University. Revisão e aprovação de um oficial de segurança de risco biológico ou comitê em sua instituição podem ser necessárias.

Atenção: Todos os procedimentos requerem BSL3 contenção. Os funcionários são obrigados a usar equipamentos de proteção individual em todos os momentos. Todas as manipulações são executadas dentro do gabinete de biossegurança (BSC) e todos os farelos são descartados em recipientes para objectos cortantes. BSC e superfícies de trabalho são limpas com álcool etílico fenol e 70% tamponado antes de iniciar o trabalho e depois do trabalho. Procedimentos normalmente seria feitos no nível de biossegurança 3 com Mycobacterium tuberculosis, mas para fins de filmagens e ilustração, os autores demonstram esses procedimentos no nível de biossegurança 2 com bactérias menos virulentas.

1. cepas e as condições de cultura

Nota: Cepa de M. tuberculosis CDC1551 é utilizada neste estudo, mas qualquer estirpe de M. tuberculosis pode ser usado da mesma maneira.

  1. Crescem as bactérias em M-OADC-TW (7H 9 caldo suplementado com 0,5% de glicerol, ácido oleico de 10% dextrose complexo da catalase e 0,05% Tween-80) médio pé a 37 ° C para uma OD600 de 0.5 (~ 0.2 x 107 UFC).
  2. Diluir a cultura em M-OADC-TW (série de 01:10 diluições das bactérias). As diluições das bactérias da placa (105, 106, 107, 108) em triplicado em seletiva placas de 11 7 H para permitir a determinação de UFC.
  3. Incube as placas durante quatro semanas a 37 ° C ou até colônias podem ser contadas com precisão.
  4. Centrifugue o inóculo bacteriano a 8.534 x g por 5 min obter uma pelota. Lave o pellet uma vez com 10 mL de solução salina (0,9% NaCl) e ressuspender o sedimento em 15 mL de solução salina (0,9% NaCl).

2. infecção de aerossol de ratos utilizando uma câmara de Madison

  1. Permitir que os ratos se adaptar ao novo ambiente por uma semana.
  2. Pese os ratos antes de carregá-los para a câmara.
  3. Ligue os cabos de três para a faixa de poder: o poder da câmara principal, bomba de vácuo e o compressor de ar, nessa ordem.
  4. Cuidadosamente desparafuse o frasco de vidro. Trazer o frasco de vidro para a biossegurança do armário e adicionar o inóculo de desafio suspendido em 15 mL de solução salina (0,9% NaCl) para alcançar ~ 104 - 106 UFC de bactérias nos pulmões.
  5. Feche a tampa da jarra de vidro no armário a biossegurança. Anexar o frasco para a unidade de nebulização e ajustar o tubo vertical de aço inoxidável, de modo que a extremidade inferior (ingestão) é cerca de um quarto de uma polegada abaixo do nível do líquido no frasco.
  6. Carregar todos os animais que precisava para a experiência (a câmara pode conter até 90 ratos) na câmara e feche todas as travas na porta.
  7. Verifique a principal (quarto) medidor de fluxo de ar. Certifique-se de que o centro da boia (bola) funciona cerca de 50 L/min, medida na escala à esquerda.
  8. Pressione o botão Start no painel de controle da câmara. Defina a taxa de fluxo de ar através do medidor de fluxo de ar do compressor (o menor medidor no canto esquerdo) como 4 L/min na escala. Verificar visualmente para garantir que o inóculo de desafio é ser nebulizado.
  9. Depois de 15 min, quando a luz vermelha na parte frontal do painel de controle aparece, e um sinal sonoro indica o final da corrida, pressione o botão Reset no canto inferior direito do painel de controle para redefinir o timers.
  10. Mantenha pressionado o botão vermelho pequeno na porta da câmara para liberar o vácuo.
  11. Abra a porta da câmara e remover os animais. Coloque os ratos volta em suas gaiolas.
  12. Retire o copo do nebulizador e coloque em um recipiente de transporte selado, à prova de vazamentos. Coloque o recipiente dentro do armário de bio-segurança e descarte a suspensão de desafio dentro de um recipiente de recolha designado.
  13. Coloque o frasco nebulizador usado dentro de um saco de risco biológico e selar o saco para o transporte para a autoclave.
  14. No final do processo de infecção, pulverizar o interior da câmara com fenol e 70% de etanol tamponada e permitir que a câmara se sentar por 10 min.
  15. Em seguida, limpe todas as superfícies interiores acessíveis muito cuidadosamente. Elimine todas as toalhas de papel contaminadas, etc. para o lixo de risco biológico. Autoclave o lixo, recipiente de resíduos e utilizados frascos de nebulização.
  16. Coloca os animais na sala de contenção até o tempo-ponto de imagem.
  17. No dia da imagem latente, transferi os animais em um recipiente secundário para a sala da imagem latente.

3. animal anestesia

  1. Anestesia os ratos com isoflurano, usando um sistema de anestesia de gás personalizado.
  2. Pese cada uma cuba do filtro carvão dois, localizado no topo da unidade de anestesia.
  3. Substitua com um novo cilindro se o peso é de 50 g acima do peso inicial.
  4. Verificar se a unidade de vaporizador para garantir isoflurano suficiente para o procedimento.
  5. Coloque o suporte do cone de nariz dentro da câmara de imagem. Coloque o número de cones de nariz, necessário para o procedimento e selar as aberturas restantes com bloqueadores de cone de nariz.
  6. Ligue o fornecimento de oxigênio do cilindro de alta pressão e defini-lo em 55 libras por polegada quadrada.
  7. Ligue a bomba de evacuação, localizada em frente a unidade de anestesia e configurá-lo para 8 L/min.
  8. Ative a alternância de oxigênio localizada na frente da unidade de anestesia.
  9. Liga o fluxo de gás para a câmara de indução da anestesia para definir o fluxo de gás em vez de 1,5 L/min, o fluxo de gás fora.
  10. Liga o fluxo de gás para a câmara de imagem para definir o fluxo de gás em vez de 0,25 L/min, o fluxo de gás fora.
  11. Ligue o vaporizador de isoflurano e configurá-lo de 2-2,5%. Ajuste o nível de isoflurano, de acordo com o número e o peso dos animais sendo utilizados para o experimento, girando o dial sobre o vaporizador de isoflurano (2-2,5% para um mouse pesando ~ 20 g; 4% para um porquinho da Índia, pesando 300 g).
  12. Coloque os ratos na câmara de anestesia e feche a tampa. Liga o fluxo de gás para a câmara de indução da anestesia.
  13. Deixe os ratos na câmara de indução de anestesia, por 5-10 min até completamente anestesiada.
  14. Uma vez que os ratos são anestesiados, aplica uma pomada ótica para os olhos para protegê-los enquanto imagem.
  15. Coloque os ratos em prostração ventral ou esternal, tal que seus narizes são colocados no nariz cone para facilitar a anestesia de ratos durante o procedimento da imagem latente.

4. imagens de fluorescência (REF) enzima repórter

  1. Injete o substrato (20 µM, 2,5 µ l/g de peso) por injeção intraperitoneal para os infectados, bem como os ratos controle. Os ratos estão sob anestesia no interior da câmara de imagem por menos de 1 min.
  2. Inicie o sistema da imagem latente.
  3. Inicialize o sistema, clicando em Initialize. Espere até que a barra de temperatura se transforma em verde.
    Nota: A câmara de imagem consiste em uma plataforma aquecida para manter a temperatura corporal do animal enquanto imagem.
  4. Para configuração de aquisição de imagem, selecione fluorescente | Trans-iluminação para todo animal ou para os tecidos do pulmão, estrutura e sobreposição no painel de controle de aquisição de Epi-iluminação.
  5. Definir campo de visão de B para único rato e nível de lâmpada de alta.
  6. Definir o tempo de exposição para auto, binning médio, 2-3 para o f/stop e filtro de excitação em 745 filtros nm e emissão de 780 nm a 840 nm.
  7. Para configuração de sequência, clique em sequência de instalação, selecione 9-12 pontos de Trans-iluminação na área de pulmão.
  8. Clique em Acquire para aquisição de imagens.
  9. Coloque o mouse para a pós-imagem gaiola.
  10. Monitorar os ratos até totalmente recuperada ou sacrificar para quantificar o UFC se de imagem em um tempo-ponto do experimento. Execute uma pontuação de Karnofsky modificada para monitorar o bem estar dos ratos pós-imagem latente.

5. análise de REF de imagem

  1. Abra o software de imagem.
  2. Carrega arquivos de imagem clicando no ícone procurar.
  3. Para desagregação espectral, clique em desfazer espectral na paleta de ferramentas e clique em espectros de necessário para atrás. Clique em Iniciar desagregação.
  4. Para reconstrução da superfície óptica, clique na topografia de superfície.
  5. Selecione a orientação para dorsal, objecto de rato de peles e, clique em gerar superfície.
  6. Desenhar cortar imagem e conjunto imagem de limiar para uma região de interesse. Clique em concluído.
  7. Para o registro do órgão, vá para a aba de registro em 3D menu suspenso de instrumentos ópticos.
  8. Registre-se órgãos de interesse em um atlas do órgão.
  9. Ajuste tamanho do órgão ou local para a topografia da superfície gerada usando a ferramenta de transformação de ligar/desligar localizada sobre as ferramentas do painel de registro.
  10. Vá para tomografia computadorizada fluorescente reconstrução 3D (FLIT), e selecione analisar Tab. Selecione as imagens para ser incluído para análise, tipo a eficiência de fluorescência de transmissão normalizados (NTF) de imagem, clique em Iniciar.
  11. Verifique em selecionar tudo e reconstruir na guia de visualização de dados.
  12. Para quantificação de fluorescência, vá para ferramentas da região de interesse (ROI), adicionar o cubo ROI ao órgão de interesse e ajustar o tamanho do cubo para cobrir o órgão de interesse. Clique em medir ROIs 3D.
  13. Na janela de medições de ROI, ir para medições de ROI 3D, selecione o tipo de dados para unidade voxels e medições da fonte de pmolM-1cm-1.
  14. Salvar e/ou exportar o resultado da análise de reconstrução 3D de FLIT em um arquivo de dados ou figura.

6. quantificação de bactérias pela UFC

  1. Eutanásia em ratos por injeção intraperitoneal de 0,1 mL pentobarbital de sódio (390 mg/mL).
  2. Verifique se há reflexo pedal apertando as almofadas dos pés de ratos para assegurar que não há nenhuma reação reflexa.
  3. Explantes de tecido pulmonar de ratos usando uma tesoura e pinça estéril. Homogeneizar o tecido pulmonar em 1 mL de tampão fosfato salino (PBS) de 1x.
  4. Faça 10 vezes diluições em série do homogenate pulmão em PBS 1x estéril.
  5. Para o chapeamento, identificar três alíquotas de 20 µ l cada as respectivas diluições na placa de ágar.
  6. Incube as placas em uma incubadora a 37 ° C e monitor para o crescimento bacteriano.
  7. Contagem de colônias em cada local após o tempo de incubação e expressam como CFU / mL corrigindo para volume e diluição utilizando a seguinte equação:
    UFC / mL = (C/V) x M
    Onde C = colônia contagens por ponto, V = volume da amostra inoculada em cada placa (mL) e M = fator de multiplicação (recíproca da diluição utilizada).
    Nota: Se 11 colônias são contadas em um local para um volume de amostra de 0,002 mL a uma diluição de amostra de 10-4, utilizando a equação, a contagem de colônia será calculada como
    (11/0.02) x 104 = 5,5 x 106 UFC / mL

Resultados

REF imagem de camundongos infectados com M. tuberculosis juntamente com rato de controle não infectados são mostrados na Figura 1A. Os ratos infectados produziram um significativamente (P = 0.0057) maior sinal de fluorescência dos pulmões a pós-infecção 6 semanas, em relação ao controle após a administração de substrato. Um curso de tempo típico para estudar a eficácia terapêutica contra M. tuberculosis usando REF poderia ser imagens na semana 1, 2, 4, 6, 15, 24 pós infecção. Intensidade da fluorescência é quantificada usando epi-iluminação para tecidos do pulmão (Figura 1B). O sinal constantemente crescente de semana 2 para semana 6 nos pulmões de ratos infectados sugere que REF com sucesso capaz de detectar o M. tuberculosis in vivo. Uma gota no sinal de fundo de ratos controle em um momento posterior do tempo (Figura 1B) poderia ser atribuída ao aumento do corpo massa e volume de ratos durante um período de 6 semanas, reduzindo assim a penetração de comprimento de onda de excitação. Reconstrução 3D do FLIT de fontes de fluorescência em camundongos infectados com M. tuberculosis é representada na Figura 2. As sequências de imagem são adquiridas em vários pontos trans-iluminação do mouse usando a mesma excitação e série de filtros de emissão. Essas sequências de imagem são usadas para reconstrução 3D de FLIT para distribuição fonte fluorescente no âmbito da disciplina de animais. Figura 2 A-D demonstra as diferentes direções (coronal, sagital e transaxial) da tomografia computadorizada do mouse com o registro do órgão de pulmão. Eficiência NTF mapas para verificar a qualidade da reconstrução são representados na Figura 2,E. NTF permite subtrair o vazamento de luz de fundo de imagens trans-iluminação através de uma imagem extra capturado com filtro de densidade neutra. A imagem feita com o filtro de excitação específica (Figura 2E-medido) é normalizada para a imagem de transmissão, medida com o mesmo filtro de emissão e um filtro de excitação aberto (Figura 2E simulada) para dar o sinal produzido pelo substrato sozinho. O semelhante medido e simulado perfil de eficiência NTF tanto na horizontal (Figura 2-F) e vertical (Figura 2G) perfis com quase 0% percentagem erro (Figura 2E-% erro) fornece a evidência de uma reconstrução 3D de boa qualidade com redução de artefatos e sinal melhor localização e sensibilidade.

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Figura 1 . Imagem de M. tuberculosis com REF. (A) imagem na vivo de ratos infectados e infectados com M. tuberculosis em 2, 4 e 6 semanas pós infecção. A barra de cor representa a intensidade do sinal fluorescente em fótons por segundo por cm2 de baixo (amarelo) para alto (vermelho). (B) a quantificação da intensidade de fluorescência de camundongos infectados com M. tuberculosis. Valores de fluorescência para ambos controle (preto) e infectado (vermelho) é representado junto com o erro-padrão para cada ponto de tempo. O significado dos resultados foi determinado por estudantes t-teste, valores de p de < 0,05 foram considerados significativos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2 . Reconstrução 3D do FLIT de fontes de fluorescência em camundongos infectados com M. tuberculosis. Tomografia computadorizada de mouse representada em diferentes direções; A) coronal, B) sagital e C) transaxial com registro de órgão de pulmão D). A região 3D de interesse (ROI) é representada como um cubo vermelho no pulmão para medições de fonte. (E) eficiência NTF mapas do medido e simulado para verificação da qualidade da reconstrução. O perfil de eficiência medido e simulado NTF foi comparado, providing de boa qualidade da reconstrução 3D (eficiência semelhante medida e simulada de NTF). F) Horizontal e G) sinal vertical perfis representando medido (azul) e simulado a curva de eficiência NTF (vermelha). As barras vermelhas horizontais e verticais indicam a posição de origem. A barra de cor representa a intensidade do sinal fluorescente em fótons por segundo por cm2 de baixa (azul) para alto (vermelho). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Ao usar técnicas de imagem, tais como REF, existem estratégias-chave que permitem a geração de dados robustas e consistentes. Imagem latente ótica produz luz espalhada em tecidos que podem afetar a profundidade de penetração, uma vez que é difícil de captar a luz emitida em todas as direções. Uso de um fluoróforo de infravermelho próximo (NIR) substrato para REF tendo um comprimento de onda de excitação e emissão no Querange de 700-900 nm de imagem facilita a absorção mínima do sinal fluorescente por tecidos de mamíferos. O substrato personalizado projetado foi construído, ligando um fluoróforo NIR, IRDye 800Cw para um quencher, QC IRDye-1, por um anel lactâmico permitindo fluorescência ressonância energética baseada em transferência têmpera. IRDye tem penetração de tecido excelente e características de dispersão de luz e não tem qualquer efeito prejudicial evidente mamíferos36, sendo liberado do sangue e órgãos por 24 h. fluorescência sinal significativamente aumenta começando 4 h após Administração de substrato, atingir o máximo níveis 6 h após a administração.

A dose infecciosa bacteriana, modo de administração da dose infecciosa e o substrato, bem como os pontos de tempo de imagem post infecção através da realização de estudos-piloto deve ser padronizada antes de embarcar em grandes e complexas, experiências. Estudos-piloto podem reduzir tempo e custo quando a imagem de um grande número de animais porque um procedimento padrão pode ser otimizado antes de fazer o experimento chave. Cargas bacterianas devem ser determinadas nos órgãos/tecidos de interesse, seguindo a imagem de corpo inteiro usando trans-iluminação e ex vivo pulmão imagem usando epi-iluminação para validar a fonte do sinal e determinar a qualidade da correlação com números bacteriana presente8. Estudos-piloto irão fornecer insights sobre o limiar da deteção, gama dinâmica da técnica, bem como a determinação das condições experimentais ideais para a imagem latente.

As principais vantagens de usar REF imagem como em comparação com outras estratégias de fluorescentes e bioluminescentes são sua alta sensibilidade e capacidade de imagem natural M. tuberculosis estirpes. REF de imagem utiliza a enzima cataliticamente robusta BlaC que é conservada em todos os isolados clínicos de M. tuberculosis e cepas de tuberculose-complexo. A grande sensibilidade de REF de imagem é devido à rápida taxa catalítica de BlaC em combinação com a retenção do produto fluorescente clivada pela célula hospedeira. O sinal continuamente aumenta enquanto o substrato está disponível, resultando em acúmulo quase ilimitado do sinal dentro da células infectadas e tecidos. Este aumento da sensibilidade de REF de imagem em comparação com abordagens alternativas de imagem permite a detecção específica de M. tuberculosis ambos em vitro e em vivo8,23,24, 29.

REF de imagem pode ser usado para a deteção bacteriana sem modificações genéticas, permitindo sua aplicação direta para qualquer modelo de infecção, de qualquer laboratório animais8,37 ou materiais clínicos humanos29,38 . REF pode ser usado para detectar e imagem de uma grande variedade de patógenos39,40, desde fluorogenic carcaças podem ser desenvolvidas para inúmeros alvos enzimáticos diferente BlaC como proteases, quinases, ureases e β-galactosidases. No entanto, cuidado pensamento deve ser dada ao alvo para garantir ele exibe as características ideais para a imagem latente. BlaC representa uma enzima bom modelo para características que garantam a aplicação bem sucedida desta estratégia. REF de imagem fornece uma leitura imediata na carga bacteriana presente nos pulmões durante infecções, que se apressa muito progresso no estudo da patogênese da tuberculose, uma vez que a determinação dos números bacterianas normalmente requer três a seis semanas, mas mesmo no mais organismos de crescimento rápido esta abordagem vai poupar uma grande quantidade de tempo. REF também pode ser usado para discriminar carcinomas de tuberculose, dos principais problemas no diagnóstico de lesões nodulares em pacientes41,42. REF serve como uma nova ferramenta para acelerar a imagem latente de tuberculose translacional e pode ser aplicada aos seres humanos, potencialmente permitindo rápida predição dos resultados terapêuticos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
IsofluranoVETONE501027
CNIR800Fatal Plus sintetizada
Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd
7H9 Caldo MiddlebrookBD271310
OADC Enriquecimento MiddlebrookBD212351
EsporcidinaRE-1284F
7H11 Middlebrook AgarBD212203
Madison Câmara
IVIS SpectrumPerkin Elmer124262
XGI-8-gas Sistema de anestesiaPerkin Elmer
Software de imagem vivaPerkin Elmer
Cones de nariz transparentesPerkin Elmer
M. tuberculosis cepa CDC1551
, 5-7 semanasJackson Laboratory
Solução personalizada camundongos BALB/C fêmeas ATCC

Referências

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