Procedimentos de fabricação e medições de birrefringência por projetar Lanthanide magneticamente responsivo Ion quelantes Phospholipid assembleias

Stéphane Isabettini; Mirjam E. Baumgartner; Peter Fischer; Erich J. Windhab; Marianne Liebi; Simon Kuster

doi:10.3791/56812

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Artigo de método

Procedimentos de fabricação e medições de birrefringência por projetar Lanthanide magneticamente responsivo Ion quelantes Phospholipid assembleias

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DOI:

10.3791/56812

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3 de janeiro de 2018

Stéphane Isabettini¹ , Mirjam E. Baumgartner¹ , Peter Fischer¹ , Erich J. Windhab¹ , Marianne Liebi² , Simon Kuster¹

¹Laboratory of Food Process Engineering, ETH Zurich, ²MAX IV Laboratory, Lund University

Neste artigo

Resumo

Processos de fabricação de iões lantanídeos magneticamente altamente responsivo quelantes polymolecular assemblies são apresentados. A resposta magnética é ditada pelo tamanho montagem, que é adaptado por extrusão através de membranas nanopore. As assembleias alignability magnética e temperatura induzido por alterações estruturais são monitoradas por medições de birrefringência, uma técnica complementar de ressonância magnética nuclear e a dispersão de nêutrons de ângulo pequeno.

Resumo

Bicelles são assemblies sintonizável disco-como polymolecular, formados a partir de uma grande variedade de misturas de lipídios. Aplicações variam estudos estruturais de membrana proteínas por ressonância magnética nuclear (NMR) aos desenvolvimentos nanotecnológicos, incluindo a formação de géis opticamente ativos e magneticamente comutáveis. Essas tecnologias exigem alto controle do tamanho da montagem, resposta magnética e resistência térmica. Misturas de 1,2-dimyristoyl -sn- glicero-3-fosfocolina (ácido) e os seus iões lantanídeos (Ln^{3 +}) quelantes conjugado de fosfolípidos, 1,2-dimyristoyl -sn- glicero-3-fosfo-etanolamina-dietileno triaminepentaacetate ( DMPE-DTPA), montar em assemblies magneticamente altamente responsivos tais como ácido/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} (razão molar 4:1:1) bicelles. Introdução de colesterol (Chol-OH) e esteroides derivados nos resultados da bicamada em outro conjunto de módulos (assemblies) oferecendo propriedades físico-químicas únicas. Para uma composição de lipídios determinado, a alignability magnética é proporcional ao tamanho do bicelle. A complexação de Ln^{3 +} resulta em respostas magnéticas sem precedentes em termos de magnitude e o alinhamento de direção. O thermo-reversível colapso das estruturas disco-como em vesículas após aquecimento permite alfaiataria de dimensões os assemblies por extrusão através de filtros de membrana com tamanhos definidos dos poros. Os magneticamente ajustável em bicelles são regenerados por resfriamento a 5 ° C, resultando em montagem dimensões definidas pelos precursores de vesículas. Neste documento, este processo de fabricação é explicado e a alignability magnética das assembleias é quantificada através de medições de birrefringência sob 5.5 T campo magnético. O sinal de birrefringência, provenientes da bicamada de fosfolípidos, mais permite o monitoramento de mudanças polymolecular que ocorrem na BICAMADA. Esta técnica simples é complementar experiências NMR, que são comumente empregadas para caracterizar bicelles.

Introdução

Bicelles são polymolecular de disco-como conjuntos obtidos de várias misturas de lipídios. ¹ ^, ² ^, ³ ^, ⁴ ^, ⁵ são amplamente utilizados para a caracterização estrutural de membrana biomoléculas por espectroscopia RMN. ⁶ ^, ⁷ no entanto, os recentes esforços visam expandir o campo de aplicações possíveis. ⁵ ^, ⁸ ^, ⁹ o sistema bicelle mais estudado é composto por uma mistura de 1,2-dimyristoyl -sn- glicero-3-fosfocolina (ácido), que constituem a parte plana da Assembleia e 1,2-dihexanoyl -sn- glicero-3-fosfocolina (DHPC) fosfolipídeo cobrindo a borda. ¹ ^, ² ^, ³ a geometria molecular do compondo a BICAMADA de fosfolipídios ditar a arquitetura da estrutura de polymolecular Self montado. ⁴ ^, ⁵ substituir DHPC com DMPE-DTPA gera sistemas bicelle magneticamente altamente responsivo e ajustáveis. ¹⁰ ^, ¹¹ ácido/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} (razão molar 4:1:1) bicelles associar com muitos mais íons lantanídeos paramagnético (Ln^{3 +}) na superfície da bicamada, resultando em uma resposta magnética melhorada. ¹⁰ além disso, substituindo as moléculas hidrossolúveis de DHPC DMPE-DTPA/Ln^{3 +} permite que a formação de bicelles resistente a diluição. ¹¹

A alignability magnética das assembleias polymolecular planar é ditada pela sua energia magnética total,

figure-introduction-1 (1)

onde B é a intensidade do campo magnético, figure-introduction-2 o magnético constante, n o número de agregação e figure-introduction-3 a anisotropia de susceptibilidade diamagnético molecular dos lipídeos compondo a BICAMADA. Portanto, a resposta do ácido/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles a campos magnéticos é costurada por seu tamanho (n número agregado) e o Δχ de anisotropia de susceptibilidade diamagnético molecular. Este último é prontamente alcançado alterando a natureza do Ln quelatadas^{3 +}. ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴ ^, ¹⁵ apresentando colesterol (Chol-OH) ou outros derivados de esteroides na BICAMADA oferece a possibilidade de ajuste tanto o agregado número n e o Δχ de susceptibilidade magnética dos assemblies. ¹¹ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹ para uma composição de lipídios determinado, maiores assemblies contêm lipídios mais capazes de contribuir para o E_mag (maior agregação número n), resultando em mais ajustável em espécie. O tamanho do ácido/DHPC bicelles, por exemplo, convencionalmente é controlado através da otimização da composição lipídica ratio ou total concentração. ²⁰ ^, ²¹ ^, ²² embora isso seja possível em ácido/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles, sua transformação de thermo-reversível de bicelle para vesículas sobre ofertas de aquecimento adicionou opções de alfaiataria. Meios mecânicos, tais como extrusão através de filtros de membrana permite a formação das vesículas. Os magneticamente ajustável em bicelles são regenerados em cima de refrigerar a 5 ° C e suas dimensões são ditadas de precursores da vesícula. ¹¹ aquiem, focalizamos o potencial dos processos de fabricação mecânica com ácido/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (razão molar 4:1:1) ou ácido/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (razão molar 16:4:5:5) como sistemas de referência. O processo funciona de forma análoga ao trabalhar com outros Ln^{3 +} do que Tm^{3 +}. A vasta gama de possibilidades oferecidas por estas técnicas são destacadas na Figura 1 e amplamente discutido em outro lugar. ²³

figure-introduction-4
Figura 1: visão geral esquemática dos procedimentos de fabricação possível. Os estudados magneticamente ajustável em Ln^{3 +} quelante polymolecular assemblies são compostas de qualquer ácido/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (razão molar 4:1:1) ou ácido/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (razão molar 16:4:5:5). O filme lipídico seco é hidratado com um tampão de fosfato de 50 milímetros em um valor de pH de 7,4 e a concentração de lipídios total é de 15 mM. Uma eficaz hidratação do filme lipídico requer também congelar descongelar ciclos (FT) ou aquecimento e arrefecimento ciclos (H & C). H & C ciclos são necessários para regenerar as amostras após a última congelar descongelar passo ou para regenerar as amostras mantidas congeladas durante um período prolongado de tempo, se eles devem ser usados sem mais extrusão. Estas etapas são discutidas extensivamente por Isabettini et al. ²³ polymolecular màxima ajustável em módulos (assemblies) é alcançados, entregando arquiteturas assembly diferente com base na composição lipídica. O tamanho de bicelle e alignability magnética é sintonizável por extrusão (Ext) através de filtros de membrana nanopore. O alinhamento apresentado fatores A_f foram calculados a partir de padrões de dispersão (SANS) de nêutrons 2D ângulos pequenos de uma amostra de ácido/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (razão molar 16:4:5:5) extrudados através de 800, 400, 200 ou 100 nm poros. SANS medições são meios complementares de quantificar bicelle alinhamento que não será abordado em mais detalhes aqui. ¹¹ ^, ¹⁶ o A_f varia de -1 (dispersão de nêutrons paralelo ou alinhamento perpendicular da bicelles em relação a direção do campo magnético) como 0 para dispersão isotrópica.Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A estrutura do bicelles tem sido estudada extensivamente por uma vasta gama de técnicas de caracterização. ¹³ o alinhamento de bicelles expostos a um campo magnético foi quantificado usando espectroscopia RMN ou experimentos de espalhamento (SANS) ângulo pequeno neutrão. ⁵ ^, ¹⁰ ^, ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹ ^, ²⁴ ^, ²⁵ no entanto, o turno e o alargamento dos picos NMR ocorrem na presença de Ln^{3 +} são sérias limitações para o método. ¹⁵ ^, ²⁶ ^, ²⁷ ^, ²⁸ SANS embora experimentos não sofrem essa limitação, alternativa e técnicas mais acessíveis são desejáveis para quantificação de rotina de alinhamento magneticamente induzida de módulos (assemblies) em solução. Medições de birrefringência são uma alternativa viável e comparativamente simples. De forma análoga às experiências NMR, medições de birrefringência revelam informações valiosas sobre rearranjos de lipídios e fases de lipídios, ocorrendo na BICAMADA. Além disso, transformações geométricas, ocorrendo no assembly polymolecular com a mudança de condições ambientais, tais como a temperatura são monitoradas. ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁶ Δn′ birrefringência magneticamente induzida serviu para estudar vários tipos de sistemas de fosfolípidos. ¹³ ^, ²⁹ ^, ³⁰ medições de birrefringência, baseadas na técnica de modulação de fase em um campo magnético é um método viável para detectar a orientação de bicelles. ¹² ^, ¹⁶ ^, ¹⁸ ^, ²⁹ ^, ³¹ ^, ³² a possibilidade de investigar bicelles com birrefringência em altas campos magnéticos até 35 T também foi demonstrada por M. Liebi et al ¹³

Quando a luz polarizada entre um material anisotrópico, irá ser refratado em uma onda ordinária e extraordinária. ¹¹ as duas ondas têm velocidades diferentes e são transferidas em fase por um δ de retardo. O grau de retardo δ é medido e convertido em um sinal de birrefringência figure-introduction-5 para quantificar o grau de anisotropia no utilizando material

figure-introduction-6 (2)

onde λ é o comprimento de onda do laser e d é a espessura da amostra. Fosfolipídios são opticamente anisotrópicos e seu eixo óptico coincide com seus eixos tempo moleculares, paralelamente as caudas de hidrocarbonetos. ¹¹ ^, ¹² sem atraso é medido se os fosfolípidos são orientados aleatoriamente na solução. Retardamento é medido quando fosfolípidos estão alinhados paralelamente uns aos outros. A birrefringência magneticamente induzida figure-introduction-7 pode ter um sinal positivo ou negativo, dependendo da orientação das moléculas no campo magnético; consulte a Figura 2. Fosfolipídios alinhados paralelamente ao eixo x resultará em um negativo figure-introduction-8 , enquanto que aqueles alinhados ao longo do eixo z positivo figure-introduction-9 . Não birrefringência é observada quando o eixo ótico coincide com a direção de propagação de luz como o fosfolípido alinha paralelamente ao eixo y.

figure-introduction-10
Figura 2: Alinhamento dos fosfolipídios e sinal correspondente a birrefringência magneticamente induzida figure-introduction-11 . O sinal de que a medida figure-introduction-12 varia de acordo com a orientação do phospholipid em campo magnético. Linhas tracejadas indicam o eixo óptico da molécula. A luz é polarizada a 45° e se propaga na direção y. O campo magnético B é na direção z. Esta figura foi modificada de M. Liebi. ¹¹ por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

No caso de uma suspensão coloidal isotrópica de bicelles, a orientação induzida pelo arranjo dos fosfolipídios na BICAMADA serão perdida, zerando o δ de retardo. O bicelles também deve alinhar a fim de orientar os fosfolípidos opticamente ativos em seus bilayers, causando um retardo δ da luz polarizada. Consequentemente, birrefringência é uma ferramenta sensível para quantificar a alignability magnética das assembleias de polymolecular. Bicelles alinhados perpendicular ao campo magnético renderá um positivo figure-introduction-13 , enquanto aqueles alinhados paralelamente renderá um negativo figure-introduction-14 . O sinal varia de acordo com o alinhamento da instalação e pode ser verificado com uma amostra de referência.

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Protocolo

1. procedimento fabricação de ácido/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (razão molar 4:1:1) e ácido/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (razão molar 16:4:5:5) polymolecular assemblies

Preparativos preliminares
1. Lavagem do material de vidro por lavagem uma vez com etanol clorofórmio estabilizado (> 99% clorofórmio) e seque com ar comprimido.
2. Produzir 2 10mg/mL distintas ações soluções de ácido e DMPE-DTPA em clorofórmio etanol-estabilizado (> 99% clorofórmio), uma solução de reserva de 10 mM de Chol-OH no clorofórmio etanol-estabilizado (> 99% clorofórmio) e uma solução stock de 10 mM de TmCl₃ em metanol.
3. Preparar um tampão de fosfato de 50 milímetros em um valor de pH de 7.4, misturando 0,121 g de sódio dihidrogeno fosfato di-hidratado e 0,599 g de di-sódio anidro fosfato de hidrogênio em 100 mL de ultrapura H₂O.
Preparação do filme lipídico seco
1. Pese as quantidades necessárias de amphiphiles (ácido DMPE-DTPA e opcionalmente Chol-OH) e Ln^{3 +} estoque soluções snap-copos de vidro de 3ml separado com uma seringa de vidro de 2,5 mL.
  1. Para um volume de amostra de 3 mL de ácido/DMPE-DTPA / Tm3 + (razão molar 4:1:1, concentração de lipídios totais de 15mm), pesar 3,6435 g da solução estoque de ácido, 1,4731 g de solução-mãe DMPE-DTPA e 0,7126 g de solução-mãe TmCl₃ .
  2. Para um volume de amostra de 3 mL de ácido/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (razão molar 16:4:5:5, concentração de lipídios totais de 15mm), pesar 2,9148 g da solução estoque de ácido, 1,4731 g de solução-mãe DMPE-DTPA, 1,0749 g de solução-mãe de Chol-OH e 0,7126 g de a solução-mãe TmCl₃ .
    Cuidado: Clorofórmio e metanol são tóxicos e voláteis à temperatura ambiente. Trabalhar sob uma coifa e prontamente prosseguir com as medições de massa.
2. Transferi o conteúdo dos copos-pressão para um 25 mL redonda balão de fundo. Liberar cada snap-copo para o balão de fundo redondo com cerca de 2,5 mL do solvente correspondente.
3. Remover o solvente sob vácuo num evaporador rotativo a 40 ° C. Ajustar a pressão inicial de 30 000 Pa até que a maioria do solvente for removido. Reduzir a pressão de 100 Pa e seco a amostra sob rotação por um período mínimo de 2 h. obtêm um filme uniforme lipídico seco nas paredes do recipiente de vidro.
4. Coloque o filme lipídico seco durante 1 minuto sob um fluxo constante de argônio para evitar oxidação lipídica no ar e armazenar a amostra no freezer antes de reidratação.
Hidratação do filme lipídico seco
1. Adicione a 3 mL de tampão fosfato no balão de fundo redondo para atingir uma concentração de lipídios totais de 15 mM.
2. Realizar um ciclo de congelamento-descongelamento (FT) mergulhando o frasco sob rotação em nitrogênio líquido, até que ele é completamente congelado (as paradas de nitrogênio líquido a ferver) e, em seguida, aqueça até 60 ° C de volta, colocando a amostra por 5 min em um banho de água, agitando o frasco continuamente auxiliar o processo de derretimento. Aplicar 30 s de utilização do Vortex antes de cada ciclo de congelamento quando a amostra é líquida para ajudar a hidratação do filme lipídico.
  Nota: Nenhum filme lipídico deve ser visível nas paredes do balão após o segundo ciclo de descongelamento de congelar.
3. Repita 1.3.2 um total de cinco vezes. Feche o frasco com uma tampa para evitar evaporação desnecessária do buffer fosfato quando a amostra estiver quente. O protocolo pode ser pausado quando a amostra é congelada.
4. Prossiga para dois de aquecimento e arrefecimento (H & C) ciclos para estabilizar a amostra sai a última etapa de congelamento, ou manter-se congelado por até dois meses. Aquecer a amostra de 40 ou 60 ° C para ácido/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (razão molar 4:1:1) ou ácido/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (razão molar 16:4:5:5), respectivamente, antes de resfriamento a 5 ° C em 1 ° C/min. manter a amostra 5 min no máximo e mínimo temperaturas do ciclo.
5. Agora, quer determinar o sinal de birrefringência da amostra em um campo magnético externo (etapa 2) ou mais extrude a amostra para adequar as dimensões de bicelle e alignability magnética (etapa 1.4).
  Nota: Ácido/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (razão molar 4:1:1) amostras são compostas principalmente de bicelles com um diâmetro médio de hidrodinâmico D_H de 70 nm, como revelado pela distribuição de números obtidos de medições de difusão dinâmica da luz (DLS) a 5 ° C. Estas amostras também contêm maior polymolecular assemblies, com uma média D_H de 500 nm, como revelado por uma distribuição de intensidade. ÁCIDO/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (razão molar 16:4:5:5) amostras são altamente polydisperse em tamanho com distribuições típicas de intensidade, revelando uma média D_H de 700 nm, enquanto que as distribuições números revelam uma população dominada por menores bicelles na faixa de tamanho de 200 nm. Distribuições de tamanho mais detalhadas e crio imagens de microscopia eletrônica de transmissão destas amostras foram relatadas por Isabettini et al . ²³
Extrusão dos assemblies polymolecular.
1. Monte a extrusora, conforme mostrado na Figura 3. Usar luvas e pinças com proteger os tubos de silicone para manipulação. Molhe o papel de filtro (5) com algumas gotas de tampão para permitir um posicionamento ideal do filtro de membrana (6). Verifique se que o papel tem sem dobras depois de colocar a junta tórica (7) na parte superior.
  Nota: O processo de extrusão foi testado em filtros de membrana (6) com um diâmetro de poro de 800, 400, 200 e 100 nm; Veja a Figura 7.
2. Definir o banho de água a 40 ° C, de ácido/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (razão molar 4:1:1) amostras ou 60 ° C para ácido/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (razão molar 16:4:5:5) amostras garantir a formação das vesículas extrudable.
3. Conectar a extrusora para uma garrafa de nitrogênio pressurizado usando um tubo de PVC de alta pressão (> 4 MPa) equipados com adaptadores serto e extrusão o material líquido através da membrana. 1 MPa de pressão é geralmente necessário para extrusão através de filtros de membrana (6) com um diâmetro de poro de 200 nm e acima. 1.5-2.5 MPa são necessários para os filtros de membrana menores (6) com um diâmetro dos poros de 100 nm.
  Nota: Mudar o filtro de membrana se anormalmente altas pressões (> 2.5 MPa) são necessários para expulsar a amostra (este é o primeiro sinal de entupimento).
4. Abra a tampa (10) e inserir a amostra com uma pipeta de vidro de 2 mL. Em seguida, feche a tampa (10) e abra a válvula de pressão (12), mantendo o tubo de saída de amostra (2). Feche a válvula de pressão (12) após a conclusão do ciclo de extrusão, desabafar e continuar com o próximo ciclo.
  Nota: Não deixe a amostra em contato muito tempo com o navio encamisado quente (8) para evitar a perda excessiva de amostra por evaporação.

30-60 s é tempo suficiente para uma amostra de 3 mL para equilibrar na extrusora antes de abrir a válvula de pressão (12).

Proceda a 10 ciclos de extrusão para uma dimensão de poros de membrana determinado conforme mostrado na Figura 3. A maioria dos sistemas bicelle é expulsada 10 vezes através de membranas com um diâmetro de poro de 200 e outro 10 vezes através de membranas, com um diâmetro dos poros de 100 nm, garantir a comparabilidade de amostra.

Agora, determine o sinal de birrefringência da amostra em um campo magnético externo (passo 2).

figure-protocol-1
Figura 3: extrusora de laboratório usada para preparações bicelle e vesículas. A extrusora é montada de baixo acima: (1) montagem, (2) amostra coleta de espaço com um tubo de plástico saída de 2,4 mm (diâmetro interno) e o-Ring (3) e malha de estabilização (4) grande e pequena, (5) papel de filtro, os filtros de membrana (6), (7) o-Ring, vaso (8) encamisado, (9. ) top tampa com conexão de entrada e de pressão, válvula de pressão (12) capa (10), parafusos borboleta (11). Um esboço da extrusora montada é mostrado do lado direito. O nitrogênio (N₂) é fornecido por um vaso de pressão e o vaso encamisado (9) é ligado a um banho de água para controle de temperatura. A amostra sofre 10 ciclos de extrusão para qualquer diâmetro de poro do filtro de membrana determinado (caminho de exemplo mostrado em azul). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. medições de birrefringência de ácido/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (razão molar 4:1:1) e ácido/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (razão molar 16:4:5:5) polymolecular módulos (assemblies).

Construir e conectar-se a instalação de birrefringência, tal como apresentado na Figura 4 e fornecer energia para os respectivos elementos eletrônicos. Não coloque o PEM, a amostra e o segundo polarizador no caminho do laser nesta fase. Evite a detecção de luz laser volta-espalhadas por cobrir superfícies reflectoras, por exemplo alumínio espelho titulares, com papel preto.
Ajustar os espelhos para maximizar a intensidade do laser para o detector, que é representado pela intensidade da corrente direta obtido a partir do filtro passa-baixa na Figura 4B.
Cuidado: Use proteção ocular adequada ao ajustar os espelhos e consultar com um instrutor de segurança do laser se manipular lasers pela primeira vez.
Vire o primeiro polarizador linear cruzado (mantida perpendicular ao feixe de laser incidente) para maximizar a .

figure-protocol-4
Figura 4: representação esquemática da instalação de birrefringência e conexões para os sinais óticos. A) um eletroímã supercondutor fornece 5,5 T campo magnético. A luz de um laser de diodo em 635 nm é polarizada por dois polarizadores cruzados. Um modulador fotoelástica PEM-90 opera em 50 KHz, com uma amplitude um₀ de rad 2,405 e colocado entre os dois polarizadores. A amostra encontra-se no imã entre o PEM e o segundo polarizador. Non-polarização espelhos orientar a luz por meio de diferentes elementos e finalmente é detectado por um fotodetector. A primeira e a segunda harmônica figure-protocol-5 e figure-protocol-6 do sinal AC são monitorados, permitindo o cálculo do sinal birrefringência dando informações sobre o alignability magnético do Ln^{3 +} quelantes polymolecular assemblies. A cubeta de amostra é conectada a um banho de água externa para controle de temperatura (azul). A temperatura da amostra é monitorada com uma sonda de temperatura (vermelha). B) o sinal do detector de foto é alimentado em um filtro passa-baixa ordem Sallen-chave com segundo (fonte de alimentação 24 V AC) com uma frequência de corte de 360 Hz através de ± 12 V DC cabo de alimentação braded (3). O filtro passa-baixa extrai o componente DC figure-protocol-7 e o entrega para a interface para PC (4) através de cabo BNC 50 Ω. O sinal do detector de foto é entregue as dois amplificadores lock-in (que extrair a primeira e a segunda harmônica figure-protocol-8 e figure-protocol-9 ) através de um cabo Ω 50 BNC (1) & (2). As intensidades de harmônicas são detectadas por uma detecção de fase sensível. Por conseguinte, o sinal do PEM é usado como sinal de referência para os amplificadores lock-in (1f-saída do PEM dentro do primeiro fechamento-no amplificador e 2f-saída para o segundo, com BNC 50 Ω os cabos conectados). Os sinais de saída são entregues para a unidade de interface para PC através de cabos Ω de 50 BNC. Unidades de aquisição analógico PCP-AI-110 e PCP-CB-1 digitalizar o sinal que é transferido para o computador através de um cabo RS-232 para monitoramento. A sonda de temperatura tipo K também é ligada à unidade de interface para PC, onde unidades de aquisição analógico PCP-CB-3 e PCP-TC-120 digitalizar o sinal antes de transferi-lo para o computador através de um cabo RS-232 para monitoramento. C) imagens da instalação do esquemática apresentada em elementos chave B. são identificados com números correspondentes de 1 a 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Coloque o segundo polarizador linear cruzado perpendicular ao feixe de laser incidente, como indicado na Figura 4A. Minimizar o definindo o segundo polarizador em um ângulo de 90° em relação ao primeiro.
Lugar do modulador fotoelástica (PEM) 0 ° entre os dois polarizadores lineares cruzados e perpendicular ao feixe de laser incidente como indicado na Figura 4A. Ajuste o PEM para uma frequência de 50 kHz e amplitude A0 para rad 2,405 como mostrado na Figura 5A. Isso faz com que o componente DC independente de birrefringência e impulsiona o .
Nota: O eixo óptico do PEM poderão ser sintonizado por alguns graus para manter uma constante no ar antes de medir qualquer amostra.
Espere por 1h depois de ligar o laser e equipamentos eletrônicos para estabilizar o sinal.

O sinal é estável, uma vez que a autoeliminação gradual dos amplificadores lock-in permanece constante.

Colocar a amostra em uma cubeta de quartzo de temperatura controlada com um caminho de comprimento de 10 mm e conectá-lo a um banho de água externo, inicialmente fixado em 5 ° C.

Coloque um termopar tipo espessura K de 0,5 mm (sonda de temperatura) diretamente na amostra para monitorar a temperatura da amostra. Verifique se que a sonda não interfere com a luz laser, colocando um papel branco no caminho do laser (após a cubeta) e procurando sombras causadas pela sonda.
Nota: Há uma diferença de 2-3 ° C entre o registo da temperatura do banho de água e a temperatura da amostra.

Coloca a cubeta no furo do ímã, como mostrado na Figura 4A. A luz do laser propaga horizontalmente através da amostra, é desviada por espelhos de polarização e detectada por um fotodetector.
Nota: O laser é dirigido para baixo, através da amostra e back-up o mesmo caminho a conta para efeitos de Faraday (ou seja, a rotação do plano de polarização da luz causada pelo campo magnético quando descer é cancelada quando vai sair na direção oposta).

Aplicar um fluxo de ar constante de ar comprimido, a temperatura e 10000 Pa sobre a cubeta para evitar a condensação de água nas paredes celulares, que reduziria a intensidade do sinal e aumentar o ruído. Isto é especialmente importante quando se mede a 5 ° C.

Detectar a primeira e a segunda harmônica figure-protocol-13

do sinal AC com dois amplificadores de fechamento-em. Auto fase os amplificadores lock-in pressionando o botão (2), mostrado na Figura 5B e ajustar a sensibilidade, como mostrado na Figura 5B (1). Certifique-se que não existem mais de quatro barras vermelhas sobre os amplificadores, conforme mostrado na Figura 5B (3) para evitar sobrecarga no sinal. Anote a sensibilidade independente para ambos os amplificadores de confinamento no programa Tesla_Magnet_Const_V092 , como mostrado na Figura 5 (8). O programa é fornecido como informação suplementar.

Rampa do campo magnético até 5,5 T, fornecendo corrente ao ímã através do programa Tesla_Magnet_Const_V092 como mostrado na Figura 5 (5).

Obter a birrefringência figure-protocol-15

através da equação 2, onde o atraso é calculado com
figure-protocol-16

(3)
onde

são funções de Bessel do primeiro tipo, com figure-protocol-19

. ¹¹ ^, ¹³ ^, ¹⁸ ^, ³³ ^, ³⁴ plotar o retardo no programa Tesla_Magnet_Const_V092, como mostrado na Figura 5 (4).
Nota: O retardo fornecido pelo programa não deve ser usado para calcular o sinal de birrefringência se o bloquear em dois amplificadores não estiver operando com a mesma sensibilidade (ver passo 2.12). As intensidades de harmônicas conectadas figure-protocol-21

tem que ser multiplicado pela sensibilidade dos amplificadores lock-in para obter as dimensões corretas. Além disso, o sinal de birrefringência, medido em um campo magnético deve ser normalizado subtraindo-se o sinal de birrefringência médio obtido em t 0.

Monitore sinal de birrefringência do exemplo em constante ou mudança de temperatura (1 ° C/min) regulando a temperatura do banho de água conectado para a cubeta, mostrada na Figura 4.

Registre os dados experimentais de enchimento na descrição experimental na Figura 5 (8), fornecendo um nome de arquivo no (9) e pressionando o botão de "START log" (10).

figure-protocol-23
Figura 5: ilustrações das configurações independentes e screenshots do programa. A) configurações do PEM: retardo 2,405 rad, comprimento de onda de 635 nm, frequência 50 Hz. White círculos indicam quais configurações para ser ativado (USR = retardo definido pelo usuário, LOC = modo local da operação). B) Lock-in configurações do amplificador. A sensibilidade (1) tem que ser selecionado antes de cada medição conforme exigido na etapa 2.11. Não deve haver mais de quatro barras vermelhas na tela (3) para evitar sobrecarga no sinal. Uma sobrecarga ocorre quando o led em (1) vermelho acende, tornando impossível a uma medição. Pressione o botão de fase de auto (2) antes de cada medição. C) Screenshots do programa Tesla_Magnet_Const_V092 fornecidos como informação suplementar. O programa permite o controle do campo magnético e a gravação de tudo o sinal saídas como uma função do tempo. A intensidade do campo magnético e a temperatura da amostra são plotadas em (1). A primeira e a segunda harmônica figure-protocol-24 e figure-protocol-25 do sinal AC medido pelas bloquear em dois amplificadores são plotadas em (2). A intensidade da corrente direta figure-protocol-26 é plotado em (3). O retardo é calculado conforme descrito na etapa 2.13 e plotado em (4). A intensidade do campo magnético é definida em (5). A medição direta da temperatura gravada pelo termopar tipo K é apresentada em (6) e os sinais de saída ( figure-protocol-27 e figure-protocol-28 ) em (7). Informações adicionais de amostra podem ser inseridas em (8), tais como a sensibilidade independente do nome de amostra, amplificadores, etc. Os dados podem ser registrados e exportados para um arquivo. txt fornecido em (9). Iniciar e parar a aquisição de dados com o botão de "START log" (10). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Resultados

O sinal de birrefringência de um não-extrudados ácido/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (razão molar 4:1:1) amostra foi monitorizada sob 5.5 T campo magnético durante um aquecimento e resfriamento ciclo de 5 a 40 ° C e volta a uma taxa de 1 ° C/min (Figura 6). Os resultados de birrefringência confirmaram alinhamentos magnéticos elevados a 5 ° C, com um valor de 1,5 x 10^-5, duas vezes tão forte quanto os sistemas de extrusão relatados. ^6<...

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Discussão

Um relato detalhado de como as medições de birrefringência foram usadas em combinação com SANS experimentos para avaliar métodos para gerar magneticamente altamente responsivo Ln^{3 +}quelantes fosfolipídios assemblies é em Isabettini et al . ²³ os protocolos de fabricação proposto também são aplicáveis para assemblies compostos os mais fosfolipídios DPPC e DPPE-DTPA ou para aqueles que contêm derivados de esteroides quimicamente modificados em sua BICAMADA. ^11<...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores reconhecem o Swiss National Science Foundation para financiamento SMhardBi (projeto número 200021_150088/1). Os experimentos SANS, foram realizados na fonte de neutrões de espalação suíço SINQ, Paul Scherrer Instute, Villigen, Suíça. Os autores agradecer vivamente o Dr. Joachim Kohlbrecher de sua orientação com os experimentos SANS. A instalação de medição de birrefringência sob altas campos magnéticos foi inspirada a configuração existente no alto-campo magnético laboratório HFML, Nijmegen, Países Baixos. Agradecemos a Bruno Pfister por sua ajuda no desenvolvimento da eletrônica da instalação do birrefringência, Jan Corsano e Daniel Kiechl para construir as estruturas que permitem o alinhamento fino e superficial do laser e Dr. Bernhard Koller para suporte técnico contínuo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345P	>99%
1,2-dimiristoíl-sn-glicero-3-fosfo-etanolamina-dietileno triaminapentaacetato ácido sal de hexamônio (DMPE-DTPA)	Avanti Polar Lipids	790535P	>99%
Thulium(III) cloreto	Sigma-Aldrich	439649	anidro, pó, 99,9% à base de metais traços
Cloreto de disprósio (III)	Sigma-Aldrich	325546	anidro, pó, 99,9% à base de metais traços Cloreto
itérbio (III)	Sigma-Aldrich	439614	anidro, pó, 99,9% à base de metais traços
Clorofórmio	Sigma-Aldrich	319988	contém etanol como estabilizador, reagente ACS, ≥ 99,8%
Metanol	Sigma-Aldrich	34860	≥ 99,9%
Colesterol	Amresco	433	Grau ultrapuro
D2O	Produtos químicos ARMAR	1410	99,8 átomos % D
Água ultrapura	Millipore		Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Medidor eletrônico de pH Millipack GP (MPGP02001)
	Filtro
Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm	VWR	515-2028
Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm filtro de membrana	VWR	515-2029
Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm filtro de membrana	VWR	515-2030
Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm filtro de membrana	VWR	515-2032
Whatmann Papel de filtro	VWR	230600
Balão de fundo redondo de 25 ml	VWR	201-1352	14/23 NS
Copo de vidro de 3 ml	VWR	548-0554	ND18, 18x30mm
Seringa de vidro de 2,5 ml	Hamilton
Di-hidrogenofosfato de sódio di-hidratado	Merk	1.06342	Sal usado para fazer tampão fosfato
di-Hidrogenofosfato ssódico	Merk	1.06586	Sal usado para fazer tampão fosfato
Nitrogênio líquido	Carbagas	-
Gás nitrogênio pressurizado	Carbagas-garrafa		de 200 bar
Extrusora de lipídios 10 ml	Lipex-Totalmente		equipado com barril térmico
Tubo de PVC de alta pressão	GR NETUM-deve		resistir a mais de 4 MPa
Adaptadores	Serto Sertot-Luvas
de nitrilo	VWR-2
ml pipetas de	vidroVWR	612-1702	Laser de diodo de 230 mm de comprimento
	Newport	LPM635-25C
DSP Amplificador de bloqueio de fase dupla	SRS	SR830
Detector de fotodiodo	Silonex Inc.	SLSD-71N5	5mm2, Silício, fotocondutor
5,5 T Criogênico Magnético Criogênico	Oerlikon AG-12		bar Refrigerado a ele. Compressor RW4000/6000, RGD 5/100 TA crio-cabeça Filtro passa-baixo
segunda ordem	fonte de alimentação linear caseira		24V DC, segunda ordem, Sallen Key, frequência de corte 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA
Modulador fotoelástico Instrumentos	Hinds	PEM-90
Glan-Thompson Calcite Polarizer	Newport	10GT04	25,4mm de diâmetro
Cubeta de amostra de quartzo	Hellma	165-10-40	célula controlada por temperatura, 0,8 ml, comprimento de caminho de 10mm
Sonda de temperatura	Thermocontrol-Tipo		K, 0,5mm de diâmetro, Thermocoax Espelhos
não polarizadores	Newport	50326-1002	25,4mm
	National Instruments	189284-02	Para Conectar à Porta RS-232 na frente dos Controladores Compactos
FieldPoint BNC 50 Ω cabo e conectores	National Instruments	763389-01
cFP-AI-110	National Instruments	777318-110	Módulo de Entrada Analógica de Tensão e Corrente de 8 Canais para Compact FieldPoint
cFP-CB-1	National Instruments	778618-01	Bloco de Conector Integrado para Fiação para Compact FieldPoint I/O
cFP-CB-3	National Instruments	778618-03	Bloco de conectores isotérmicos integrado para fiação de termopares ao módulo cFP-TC-120
cFP-TC-120	National Instruments	777318-120	Módulo de entrada de termopar de 8 canais para Compact FieldPoint
cFP-1804	National Instruments	779490-01	Interface Ethernet/serial para NI Compact FieldPoint
LabView 2010	National	Instruments-Industrial
power Fornecimento	Traco Power	TCL 060-124	100-240V AC
Banho-maria	Julabo	FP40-HE	refrigerado / Circulador de aquecimento

de de membrana Metrohm 17440010 /de Cabos RS 232 de

Referências

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Reimpressões e permissões

Etiquetas

Conjuntos Magn ticos Extrus o de Lip dios Bicelas Dopadas com DMPC DMPE DTPA e Colesterol Alinhamento por Campo Magn tico Forma o de Precursores de Ves culas Montagem com Controle de Temperatura Design de Montagem Polimolecular

Procedimentos de fabricação e medições de birrefringência por projetar Lanthanide magneticamente responsivo Ion quelantes Phospholipid assembleias