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Quantificação de todo o genoma de tradução no fermento Budding pelo Ribossoma perfilamento

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DOI:

10.3791/56820

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21 de dezembro de 2017

 ,  ,  , 
1Department of Dermatology, Boston University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Regulamento translacional desempenha um papel importante no controle da abundância de proteína. Aqui, descrevemos um método de alta produtividade para análise quantitativa de tradução em brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae.

Resumo

Tradução do RNAm em proteínas é um processo complexo que envolve várias camadas do regulamento. Muitas vezes supõe-se que as alterações na transcrição de mRNA refletem alterações na síntese proteica, mas muitas exceções foram observadas. Recentemente, uma técnica chamada Ribossoma perfilação (ou Ribo-Seq) surgiu como um método poderoso que permite a identificação, com alta precisão, quais as regiões de mRNA são traduzidas em proteínas e quantificação de tradução a nível de todo o genoma. Aqui, apresentamos um protocolo de generalizadas para quantificação de todo o genoma de tradução usando Ribo-Seq no fermento de brotamento. Além disso, combinar dados Ribo-Seq com medições de abundância de mRNA nos permite quantificar simultaneamente a eficiência de conversão de milhares de transcrições de mRNA na mesma amostra e comparar alterações desses parâmetros em resposta a experimental manipulações ou nos diferentes Estados fisiológicos. Descreveremos um protocolo detalhado para geração de pegadas de Ribossoma usando digestão nuclease, isolamento de complexos de Ribossoma-pegada intacta através de fracionamento de gradiente de sacarose e preparação de bibliotecas de DNA para sequenciamento profundo juntamente com o apropriado controles de qualidade necessários para garantir uma análise precisa da tradução na vivo .

Introdução

Tradução de mRNA é um dos processos fundamentais na célula, que desempenha um papel importante na regulação da expressão da proteína. Portanto, a tradução de mRNA é rigidamente controlada em resposta a diferentes estímulos fisiológicos internos e externos, 1,2. No entanto, os mecanismos de regulação traducional permanecem pouco estudados. Aqui, descrevemos o protocolo para a quantificação de todo o genoma da tradução em leveduras brotamento pelo Ribossoma perfilação. O objectivo geral da técnica de criação de perfil ribossoma é estudar e quantificar a tradução de mRNAs específicos sob diferentes condições de celulares. Esta técnica usa o sequenciamento de próxima geração para analisar quantitativamente a ocupação do ribossomo ao longo do genoma e permite monitorar a taxa de proteína síntese na vivo no códon única resolução 3,4. Atualmente, este método fornece os meios mais avançados de medição dos níveis de tradução da proteína e provou para ser uma ferramenta de descoberta útil, fornecendo informações que não podem ser reveladas por outras técnicas atualmente disponíveis, por exemplo, microarrays ou Tradução estado matriz análise (TSAA) 5. Como o ribossoma relatórios sobre as alterações combinadas em níveis de transcrição e translação saída de criação de perfil, ele também fornece sensibilidade muito maior em comparação com outros métodos.

Esta abordagem baseia-se na profundo sequenciamento de fragmentos de mRNA ribossomo-protegido 3. Durante a tradução de proteínas, ribossomas proteger ~ 28 porções de nt do mRNA (chamado pegadas) 6. Determinando a sequência dos fragmentos protegidos Ribossoma, Ribo-Seq pode mapear a posição dos ribossomas no mRNA traduzido e identificar quais as regiões de mRNA são susceptíveis de ser ativamente traduzido em proteína 3,7. Além disso, quantitativamente podemos medir a tradução de mRNA pela contagem do número de pegadas que se alinham para uma determinado transcrição de mRNA.

Para isolar os fragmentos protegidos Ribossoma, lisados celulares são inicialmente tratados com um inibidor de tradução para enrolar os ribossomas seguidos por digestão ribonuclease. Considerando que livre mRNA e porções de mRNAs traduzidos não protegidos por ribossomos são degradadas pela ribonuclease, os fragmentos do mRNA ribossomo-protegido podem ser recuperados por purificar complexos Ribossoma-pegada intacta. Estas pegadas de mRNA são então convertidas em biblioteca de cDNA e analisadas por sequenciamento profundo (Figura 1). Em paralelo ao Ribossoma perfilação, mRNA intacta é extraído da mesma amostra e sequenciados. Comparando o nível de tradução identificado por Ribo-Seq com medições de abundância de mRNA, podemos identificar os genes que são especificamente acima - ou para baixo-regulado ao nível da tradução e calcular a eficiência da tradução do mRNA a nível de todo o genoma. Enquanto o protocolo descrito neste artigo é específico para o fermento, é também útil para pesquisadores que tentarão estabelecer o protocolo Ribo-Seq em outros sistemas.

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Protocolo

1. preparação do extrato

  1. Cepas de leveduras de raia de congelados reservas para as colônias única em placas YPD (extrato de levedura 1%, 2% de peptona, glicose 2% e 2% de ágar). Incube as placas a 30 ° C durante 2 dias.
  2. Inocular o fermento de uma placa YPD (uso uma única colônia) em 15 mL de meio YPD (extrato de levedura 1%, 2% de peptona, 2% de glicose) em um tubo de centrifuga conico de 50 mL e crescer durante a noite com agitação (200-250 rpm) a 30 ° C.
  3. Cultura de diluir em 500 mL de meio YPD em um frasco estéril de 2 L, para que o OD600 < 0.1. Desenvolvem-se células de levedura com agitação a 30 ° C, durante 3-5 h até OD600 = 0,5 (fase log de mid).
  4. Recolha pilhas por filtragem através de filtros de membrana 0,45 μm usando um conjunto de filtro de suporte de vidro. Raspar a pelota com uma espátula, flash congelamento em nitrogênio líquido e armazenar a-80 ° C. O tamanho esperado do sedimento congelado é ~ 0,2 - 0,5 g.
    Atenção: O nitrogênio líquido é extremamente baixa temperatura; Use proteção adequada.
  5. Preparar um fresco do lysis (pH 20 mM Tris-HCl 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, 100 cicloheximida μg/mL, 0,5 mM DTT, 1% Triton X-100) imediatamente antes da utilização, manter no gelo.
  6. Colocar 3 grânulos de aço cromado (3,2 mm) em um tubo de aço inoxidável de 1,8 mL. Pre-calma em nitrogênio líquido e adicionar pelotas congeladas, cubra com uma tampa de borracha do silicone. Homogeneizar a amostra por cryogrinding por 10 s a 4200 rpm; Repita 10 vezes. Esfriar o tubo em nitrogênio líquido pelo menos 10 s entre cada rodada.
    Nota: É importante manter sempre a amostra congelada.
  7. Adicionar 1 mL de tampão de Lise, misture bem por pipetagem. Transferir para um novo tubo de 1,5 mL.
  8. Centrifugar a 20.000 x g por 5 min a 4 ° C. Enquanto trabalhava no gelo, transferi o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL. Transferi 100 μL de lisado para um novo tubo de 1,5 mL para o isolamento de mRNA poli. Dirijam-se ao isolamento de RNA ou flash congelar o tubo em nitrogênio líquido. Medida OD260 do resto do lisado, que será usado para a extração de pegada e flash congelar os tubos em nitrogênio líquido. Armazenar os lysates a-80 ° C.

2. pegada extração

  1. Preparação de gradientes de sacarose
    1. Prepare soluções para 50%, 40%, 30%, 20% e 10% de sacarose em gradiente tampão (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, 100 cicloheximida μg/mL, 0,5 mM DTT).
    2. Pipetar 2,2 mL de tampão de sacarose preparada 50% para o fundo do tubo de polyallomer de parede fina de 13,2 mL e congelar a solução durante 10 minutos a-80 ° C (Figura 2). Em seguida, camada 2,2 mL de tampão de sacarose 40% em cima do buffer de sacarose 50% congelado e congelar por 10 min a-80 ° C. Seguir as mesmas instruções, sacarose camada 30%, em seguida, 20% e, finalmente, 10% buffers em cima uns dos outros. Evite fazer bolhas de ar durante a estratificação. Manter os gradientes a-80 ° C até o uso. Os gradientes de sacarose devem ser preparados pelo menos um dia antes do experimento e armazenados a-80 ° C.
  2. Digestão de nuclease
    1. Descongele os gradientes de sacarose na noite anterior experiências a 4 ° C.
    2. Descongele o celular lisado (pegada amostra) no gelo. Transferir uma alíquota de célula lisada contendo 50 unidades de260 OD para um novo tubo de 1,5 mL e adicionar tampão de Lise fresco até 1 mL. Armazenar o restante lisado a-80 ° C. Adicionar 10 μL RNase eu (100 U/μL) e incube a 1 h em temperatura ambiente com suave rotação em rotacao cabeça-sobresaltos.
    3. (Opcional) Clarificar as amostras a 20.000 x g por 5 min a 4 ° C e recuperar o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL.
  3. Ultracentrifugação
    1. Suavemente a camada lisadas amostras ao topo de um gradiente de sacarose de 10-50%.
    2. Se o polyallomer tubos a 210.000 x g (35.000 rpm) a 4 ° C por 3 h, usando o rotor Ti SW-41.
  4. Configuração do sistema de fracionamento de gradiente
    1. Os componentes e deixe o monitor de UV para aquecimento pelo menos 30 min.
    2. Se usando um software de gravador digital, inicie o software no computador, defina limites de dimensionamento do gráfico de-0.01 e 1.
    3. Encha a seringa com a solução de Chase (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 140 mM KCl, 5 mM MgCl2, 60% de sacarose), remover quaisquer bolhas de ar dentro da seringa e cânula.
    4. Instale um tubo se encheu com água livre de RNase. Fure o tubo com a cânula até duas marcas pretas podem ser vistas. Ligue a bomba de seringa de 1 mL/min.
    5. A água que passa através da célula de fluxo, pressione o botão "Auto Zero" o monitor de UV para ajustar a linha de base para 0. Definir a sensibilidade do monitor UV para "2.0 AU". Depois que foi criada uma linha de base estável, pare a bomba de seringa. Recuperar a solução de Chase e remova o tubo se.
  5. Isolamento de monosome
    1. Instalar e perfurar o tubo se contendo o gradiente de sacarose. Ligue a bomba de seringa de 1 mL/min, coletar frações de 1 mL um254 valores de monitoramento. Frações que representam o pico de monosome dos anos 80 em um tubo do pool, manter no gelo (Figura 3).
    2. Uma vez que Chase solução atinge a célula de fluxo, pare a bomba de seringa. Recuperar a solução de Chase e remova o tubo se. Repita o fracionamento para o resto das amostras começando no ponto 2.5.1.
      Nota: Quando terminar, limpe o sistema de fracionamento com pelo menos 30 mL de água livre de RNase. Lave cuidadosamente o tubo, seringa e todos os componentes removíveis com água morna.
    3. Filtrar as frações através de filtros centrífugos de 0,5 mL (100 kDa MWCO) a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C e descartar a passagem, repita até que volume é < 100 μL. Adicione 400 μL de tampão de lançamento (20 mM Tris-HCl pH 7.0, 2 mM EDTA, 40 inibidor de RNase U/mL). Mix por pipetagem, incubar por 10 min de gelo e a unidade de transferência para um novo tubo de coleção. Centrifugar a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C e coletar o escoamento.
  6. Purificação do fragmento de pegada
    1. Transferi os escoamento contendo pegada RNA fragmentos do tubo um novo 1,5 mL, adicionar 20 μL de SDS (para uma concentração final de 1%), misture por pipetagem de 20%.
    2. Adicionar 1 volume de ácido-fenol: clorofórmio (pH 4.5), vortex por 10 s.
      Cuidado: Ácido-fenol: clorofórmio é tóxico, evite o contacto com a pele e inalação.
    3. Aqueça a 65 ° C por 5 min, Coloque gelo por 1 min. centrifugar a amostra a 12.000 x g por 5 min a 4 ° C, transferir a fase aquosa (superior) para um novo tubo de 1,5 mL.
    4. Precipitar fragmentos de RNA pegada adicionando volume 1/10 de NaOAc (pH 5,5), o volume de 1/100 de glicogênio (10 mg/mL) e 2,5 volumes de etanol a 100%.
Incube a-20 º C pelo menos 1 h.

3. extração de mRNA poli

  1. Extração de RNA total
    1. Descongelar uma alíquota de 100 μL de lisado celular (amostra deRNA Total ) no gelo, adicionar 300 μL de 20 mM Tris-HCl pH 7.0 e 20 μL de SDS (para uma concentração final de 1%), misture por pipetagem de 20%.
    2. Adicionar 1 volume (400 μL) de ácido-fenol: clorofórmio (pH 4.5) e vórtice por 10 s.
    3. Aqueça a 65 ° C por 5 min, Coloque gelo por 1 min. centrifugar a amostra a 12.000 x g por 5 min a 4 ° C, transferir a fase aquosa (superior) para um novo tubo de 1,5 mL.
    4. Realize uma segunda extracção de fenol. Adicionar 1 volume de ácido-fenol: clorofórmio (pH 4.5), vórtice para calor s. 10 a 65 ° C por 5 min, colocar no gelo por 1 min. centrifugar a amostra a 12.000 x g por 5 min a 4 ° C, transferir a fase aquosa para um novo tubo de 1,5 mL.
    5. Precipitar o RNA. Para isso adicione volume 1/10 de NaOAc 3 M (pH 5,5), o volume de 1/100 de glicogênio (10 mg/mL) e 2,5 volumes de etanol a 100%. Incube a-20 º C pelo menos 1 h.
  2. Isolamento de mRNA poli
    1. Centrifugar as amostras de RNA em 20.000 x g durante 30 minutos a 4 ° C, retire o etanol. Spin para baixo 30 s em velocidade máxima, remover o resto do etanol com uma ponta de gel de carregamento, e o ar seco a pelota por 5 min.
    2. Dissolva a pelota em 300 μL de tampão de Lise/ligação do kit de isolamento do mRNA da poli. Proceda à extração de mRNA poli (a) de acordo com o protocolo de poli mRNA isolamento kit do fabricante.
    3. Precipitar as amostras de mRNA adicionando volume 1/10 de NaOAc 3 M (pH 5,5), o volume de 1/100 de glicogênio (10 mg/mL) e 2,5 volumes de etanol a 100%. Incube a-20 º C pelo menos 1 h.
  3. fragmentação de mRNA
    1. Centrifugar as amostras de mRNA em 20.000 x g durante 30 minutos a 4 ° C, retire o etanol. Spin para baixo 30 seg, remover o resto do etanol com um carregamento de gel de ponta e ar seco a pelota por 5 min.
    2. Resuspenda o mRNA em 18 μL de água livre de RNase, adicionar 2 μL de 10x buffer de fragmentação de RNA. Incubar a 5 min a 94° C. Transferi o tubo de gelo.
    3. Precipitar, adicionando o volume de 1/10 de NaOAc 3 M (pH 5,5), o volume de 1/100 de glicogênio (10 mg/mL) e 2,5 volumes de etanol a 100%. Incube a-20 º C pelo menos 1 h.

4. desfosforilação

  1. Trate a pegada e fragmentada amostras de mRNA com quinase de polinucleotido T4. Para isso, Centrifugar as amostras a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C, retire o etanol. Spin para baixo 30 s em velocidade máxima, remover o resto do etanol com um gel de ponta de carga. Ar seco a pelota por 5 min.
  2. Resuspenda o pellet em 7,75 µ l de água, adicionar 1 µ l de buffer de quinase 10 x T4 polinucleotídicas, 1 µ l da quinase de polinucleotido T4 (10.000 U/mL) e 0,25 µ l de inibidor de RNase (20 U / µ l). Incubar a 1 h a 37 ° C.
  3. (Opcional) Pre-execute um gel de TBE-ureia 15% em 180 V por 15 min, usando 1 x TBE buffer.
  4. Adicione 10 µ l de 2 X amortecedor de TBE-ureia amostra de 10 µ l de cada amostra de pegada e mRNA. Preparar uma amostra de controle contendo 1 µ l de 10 do oligonucleotide de marcador de tamanho superior de µM (32 nt), 1 µ l de 10 µM menor tamanho marcador do oligonucleotide (28 nt), 8 µ l água e 10 µ l de 2 x amortecedor de TBE-ureia amostra para amostras de pegada. Preparar uma amostra de controle contendo 1 µ l de 10 do oligonucleotide de marcador de RNA de µM (63 nt), 9 µ l água e 10 µ l de 2 x amortecedor de TBE-ureia amostra para amostras de mRNA.
  5. Incubar as amostras e controles 3 min a 75 ° C, spin para baixo, Coloque gelo por 1 min. carregar cada amostra em 2 poços do gel 15% TBE-ureia, fragmentos de RNA separados por eletroforese em gel de 180 V por 1h.
  6. Manchar o gel por 5 min com uma mancha de gel de ácido nucleico (10.000 x diluído em água), proteger da luz.
  7. Usando um transiluminador de luz azul, cortar a banda adequada entre 28 e 32 marcadores nt para amostras de pegada (Figura 4A) e cerca de 50-70 nt para mRNA amostras (Figura 4B) com uma lâmina de barbear limpa. Congele os pedaços de gel de poliacrilamida a-80 ° C durante pelo menos 10 min.
  8. Extraia o RNA do gel de polyacrylamide como segue. Aquecer os pedaços de gel a 70 ° C por 2 min, moer o gel usando macacos descartável da pelota. Eluir RNA com tampão de eluição 300 µ l (20 mM Tris-HCl pH 7.0, 2 mM EDTA), adicionar 1 inibidor de RNase µ l (20 U / µ l) e incubar a 37 ° C por 3 h.
  9. Centrifugar a amostra a 12.000 x g por 5 min a 4 ° C, recolher o sobrenadante e precipitado pela adição de 1/10 de volume de NaOAc (pH 5,5), o volume de 1/100 de glicogênio (10 mg/mL) e 2,5 volumes de etanol 100%. Incube a-20 º C pelo menos 1 h.

5. 3'-adaptador ligadura

  1. Centrifugar as amostras pegada e mRNA em 20.000 x g durante 30 minutos a 4 ° C, retire o etanol. Spin para baixo 30 s em velocidade máxima, remover o resto do etanol com uma ponta de gel de carregamento. Ar seco a pelota por 10 min.
  2. Resuspenda o pellet em 4,75 µ l de água livre de nuclease, 2 µ l de 50% PEG8000, 1 µ l de tampão de ligase 10 X T4 RNA, 1 µ l de 3'-adaptador (100 ng / µ l), 0,25 µ l de inibidor de RNase (20 U / µ l), 1 µ l de RNA T4 ligase do 2 truncado KQ (200.000 U/mL). Incubar durante uma noite a 16 ° C.
  3. Na manhã seguinte, retire o excesso de adaptador, adicionando 0,5 µ l de 5'-deadenylase (10 U / µ l) e 0,5 µ l de Rec J do exonuclease (10 U / µ l) diretamente a reação da ligadura. Incubar durante 30 min a 30 ° C.
  4. Precipitar as amostras. Para isso, adicione 30 µ l de água livre de nuclease, 1 glicogênio µ l (10 mg/mL), volume 1/10 de NaOAc (pH 5,5) e 2,5 volumes de etanol a 100%. Incube a-20 º C pelo menos 1 h.

6. inverter a transcrição

  1. Centrifugar as amostras a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C, retire o etanol. Spin para baixo 30 s em velocidade máxima, remover o resto do etanol com uma ponta de gel de carregamento. Ar seco a pelota por 10 min.
  2. Resuspenda o pellet em 11,5 µ l de água livre de nuclease, adicionar 0,5 µ l de primer de transcrição reversa 8 µM (primeira demão RT) e 1 µ l de dNTP mix (10 mM). Incubar durante 5 minutos a 65 ° C, Coloque gelo.
  3. Adicione 4 µ l de 5 X buffer de primeira vertente, 2 µ l de 0,1 M DTT, 0,5 µ l de inibidor de RNase (20 U / µ l), 0,5 µ l de transcriptase reversa (200 U / µ l). Incubar durante 30 min a 48 ° C, 1 minuto a 65 ° C, 5 min a 80 ° C.
  4. Não precipitar e proceder de imediato à hidrólise de RNA, pela adição de 0,8 µ l de 2 M de NaOH, Incubar 30 min a 98 ° C. Adicionar 0,8 µ l de 2M de HCl para neutralizar a reação.
  5. Precipitar as amostras.
Para isso, adicione 20 µ l de água livre de nuclease, 1 glicogênio µ l (10 mg/mL), volume 1/10 de NaOAc (pH 5,5) e 2,5 volumes de etanol a 100%. Incube a-20 º C pelo menos 1 h.
  • Centrifugar as amostras a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C, retire o etanol. Spin para baixo 30 s em velocidade máxima, remover o resto do etanol com uma ponta de gel de carregamento. Ar seco a pelota por 10 min.
  • Resuspenda o pellet em 5 µ l de água livre de nuclease, adicione 5 µ l de 2 X amortecedor de TBE-ureia amostra. Incubar a 3 min a 75 ° C, spin para baixo, Coloque gelo por 1 min.
  • (Opcional) Pre-execute um gel de TBE-ureia 10% em 180 V por 15 min, usando 1 X TBE buffer.
  • Carrega a amostra em 1 bem do gel TBE-ureia 10%. Separe os produtos da reação de transcrição reversa por eletroforese em gel de 180 V por 50 min. Como um controle, preparar uma amostra contendo 1 µ l de primer de RT 2,5 µM, 1 µ l de 2,5 µM 128 nt marcador do oligonucleotide, água de µ l 3, e 5 µ l de 2 X TBE-ureia amortecedor da amostra e correr em uma pista separada do gel.
  • Manchar o gel por 5 min com uma mancha de gel de ácido nucleico (10.000 x diluído em água), proteger da luz. Usando um transiluminador de luz azul, corte a banda cerca de 128 nt e superiores (Figura 5), com uma lâmina de barbear limpa. Congele os pedaços de gel de poliacrilamida a-80 ° C durante pelo menos 10 min.
  • Aquecer os pedaços de gel a 70 ° C por 2min, moer o gel usando macacos descartável da pelota. Eluir o DNA com 300 µ l de pH de Tris-HCl 20 mM 7.0 e incubar a 37 ° C por 3 h.
  • Centrifugar a amostra a 12.000 x g, durante 5 min a 4 ° C, recolher o sobrenadante e precipitado pela adição de 1/10 de volume de NaOAc (pH 5,5), o volume de 1/100 de glicogênio (10 mg/mL) e 2,5 volumes de etanol 100%. Incube a-20 º C pelo menos 1 h.

    • 7. circularização

    1. Centrifugar as amostras a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C, retire o etanol. Spin para baixo 30 s em velocidade máxima, remover o resto do etanol com uma ponta de gel de carregamento, e ar seco a pelota por 10 min.
    2. Resuspenda o pellet em 16,75 µ l de água livre de nuclease. Adicionar 2 µ l de buffer de ligase single-stranded DNA (ssDNA), 1 µ l de 50mm MnCl2, 0,25 µ l de ssDNA Ligase de 10x (100 U / µ l). Incubar durante 1 h a 60 ° C, 10 min a 80 ° C. Não precipitar e armazenar o produto da reação da ligadura ssDNA a-20 ° C.

    8. PCR amplificação de biblioteca

    1. Enquanto trabalho no gelo, misture o seguinte em um tubo PCR: 146 µ l de água livre de nuclease, 2 µ l de cartilha para a frente de 20 µM, 2 µ l de primer de indexado reversa 20 µM, 40 µ l de 5 x buffer de plymerase de DNA de alta-fidelidade, 4 µ l de dNTPs (10 mM), 4 µ l do produto da reação da ligadura ssDNA e 2 µ l de DNA polimerase de alta-fidelidade. Escolha um primer indexados reverter diferente para cada amostra que vai ser multiplexado para sequenciamento. Transferi uma alíquota de 50 μL da mistura de PCR para 4 novos tubos de PCR.
    2. Executar a amplificação por PCR com número variável de ciclos (8, 10, 12, 14) usando as seguintes configurações:
      1 min a desnaturação inicial de 98 ° C
      8 a 14 ciclos:
      15 s a 94 ° C
      5 s a 55 ° C
      10 s a 65 ° C
      2 min a extensão final de 65 ° C
    3. Precipitar o produto do PCR, adicionando o volume de 1/10 de NaOAc 3 M (pH 5,5), o volume de 1/100 de glicogênio (10 mg/mL) e 2,5 volumes de etanol a 100%. Incube a-20 º C pelo menos 1 h.
    4. Centrifugar as amostras a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C, retire o etanol. Spin para baixo 30 s em velocidade máxima, remover o resto do etanol com uma ponta de gel de carregamento, e o ar seco a pelota.
    5. Resuspenda o pellet em 8 µ l de água livre de nuclease, adicionar 2 µ l de desnaturação não 5X amortecedor da amostra de ácido nucleico. Carrega a amostra em 1 bem de um gel não-desnaturação de TBE 8%. Separe os produtos de DNA por eletroforese em gel de 150 V por 35 min. Como um controle, preparar uma amostra contendo 0,5 µ l de escada de DNA 10 bp (1 µ g / µ l), 7,5 µ l água e 2 µ l de desnaturação não 5X amortecedor da amostra de ácido nucleico e correr em uma pista separada do gel.
    6. Manchar o gel por 5 min com uma mancha de gel de ácido nucleico (10.000 x diluído em água), proteger da luz. Usando um transiluminador de luz azul, corte a banda cerca de 150 bp para amostras de pegada e cerca de 180 bp mRNA das amostras (Figura 6) com uma lâmina de barbear limpa. Armazene os pedaços de gel a-80 ° C durante pelo menos 10 min.
    7. Aquecer os pedaços de gel a 70 ° C por 2 min, moer o gel usando macacos descartável da pelota. Eluir o DNA com 300 µ l de pH de Tris-HCl 20 mM 7.0 e incubar a 37 ° C por 3 h.
    8. Centrifugar a amostra a 12.000 x g, durante 5 min a 4 ° C, recolher o sobrenadante e precipitado pela adição de 1/10 de volume de NaOAc (pH 5,5), o volume de 1/100 de glicogênio (10 mg/mL) e 2,5 volumes de etanol 100%. Incube a-20 º C pelo menos 1 h.
    9. Centrifugar as amostras a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C, retire o etanol. Spin para baixo 30 s em velocidade máxima, remover o resto do etanol com uma ponta de gel de carregamento, e o ar seco a pelota. Finalmente, resuspenda as bibliotecas em 20 µ l de água livre de nuclease e proceder à quantificação, controle de qualidade e sequenciamento.

    9. Biblioteca quantificação e arranjar em sequência do elevado-throughput

    1. Antes de enviar as amostras para sequenciamento, determine o rendimento e a qualidade das bibliotecas PCR amplificados. Perfis representativos para pegada e bibliotecas de sequenciamento de mRNA são mostrados na Figura 7. O tamanho esperado da biblioteca PCR amplificados é bp 148-152 para amostras de pegada e bp 170-190 para amostras de mRNA.
    2. Se várias amostras com diferentes códigos de barras vão ser agrupadas para sequenciamento, realize quantificação precisa das bibliotecas usando um ensaio de quantificação de biblioteca baseada em qPCR sequenciamento.
    3. As bibliotecas em relações equimolar da piscina. Calcule o volume total da piscina como 3 µ l x número total de amostras seja agrupado. Determine o volume de cada biblioteca que precisa ser adicionado para que as bibliotecas são misturadas nas relações equimolar para atingir a concentração final de 10 nM da piscina. Adicionar os volumes calculados de cada biblioteca para um novo tubo de 1,5 mL, misturar por pipetagem. Adicione água para atingir o volume total calculado. Bibliotecas de pool de armazenamento-20 ° c.
    4. Envie uma alíquota da biblioteca em pool para ser sequenciado usando sequenciamento de único-extremidade bp 50 executado em uma plataforma de sequenciamento de Illumina. Nós rotineiramente multiplex 12 amostras em um único sequenciamento executar, quais rendimentos ~ 200 milhões lê por raia de sequenciamento.
      Nota: O número final de pegada leituras coletadas por cada amostra depende da quantidade de material a entrada e o nível de contaminação do rRNA.

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    Resultados

    Encanamentos detalhados para a análise de bioinformatic do Ribossoma dados de perfil tem sido descrito anteriormente 8,9. Além disso, diversos grupos de pesquisa desenvolveram ferramentas de Bioinformática para análise de expressão diferencial do gene e processamento de dados de sequenciamento, que são específicos para o ribossoma perfilação método 10,11,

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    Discussão

    A abordagem de Ribo-Seq tem emergido como uma poderosa tecnologia de análise de mRNA tradução na vivo a todo o genoma de nível 3. Estudos utilizando esta abordagem, que permite o monitoramento de tradução com resolução de single-códon, tem contribuído para o nosso entendimento do Regulamento translacional. Apesar de suas vantagens, Ribo-Seq tem várias limitações. Fragmentos de RNA ribossómico (rRNA) são sempre co purificados durante o isolamento de pegadas Ribossoma-protegido, diminuindo ...

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    Divulgações

    Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

    Agradecimentos

    Este trabalho foi financiado pelos institutos nacionais de subvenções de saúde AG040191 e AG054566 de VML. Esta pesquisa foi realizada enquanto VML foi bolseiro de investigação um AFAR da Federação Americana para pesquisa do envelhecimento.

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    Materiais

    Lista de materiais utilizados neste artigo
    NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
    0,45 μ Filtros de membrana MMilliporeHVLP04700
    0,5 M EDTAInvitrogenAM9261
    Filtros centrífugos de 0,5 mL (100 kDa MWCO)MilliporeUFC510024
    1 M Tris-HCl, pH 7,0InvitrogenAM9850G
    1 M Tris-HCl, pH 7,5 (pH 8,0 a 4° C)Invitrogen15567-027
    10X TBE tampãoInvitrogenAM9863
    10% TBE-ureia gelInvitrogenEC6875BOX
    15% TBE-ureia gelInvitrogenEC6885BOX
    2 M MgCl2RPIM24500-10.0
    2X TBE-ureia tampão de amostraInvitrogenLC6876
    3M NaOAc, pH 5.5InvitrogenAM9740
    5' Deadenylase (10 U/μ L)EpicentroDA11101K
    5X Tampão de carregamento de amostra de ácido nucleicoBio-Rad161-0767
    8% TBE gelInvitrogenEC6215BOX
    Acid-Phenol: Clorofórmio, pH 4,5 (com IAA, 125: 24: 1)InvitrogenAM9722
    Transiluminador de luz azulClare Chemical ResearchDR-46B
    Contas de aço cromado, 3,2 mmBioSpec Products11079132c
    CryogrinderProduto Biospec3110BX
    CicloheximidaRPIC81040-5.0
    Sistema de Aquisição de DadosDATAQ InstrumentsDI-245
    Mistura de solução de desoxinucleotídeo (dNTP) (10 mM)NEBN0447L
    GlicogênioInvitrogenAM9510
    Sistema de fracionamento gradienteBrandelBR-184X
    DNA polimerase de alta fidelidade (2.000 U/mL)NEBM0530SFornecido com 5X Phusion HF Buffer
    Kit de quantificação de biblioteca de sequenciamento de próxima geraçãoKapa BiosystemsKK4824
    Corante de gel de ácido nucleicoInvitrogenS11494
    Optima XE-90 ultracentrífugaBeckman CoulterA94471
    Invitrogen61011
    Rec J exonuclease (10 U/μ L)EpicentroRJ411250
    transcriptase reversa (200 U/μ L)Invitrogen18080093Fornecido com tampão de primeira fita 5X e
    tampão de fragmentação de RNANEBE6186A
    RNase I (100 U/μ L)InvitrogenAM2295
    (20 U/μ L)InvitrogenAM2696
    Tampas de borracha de siliconeProdutos BioSpec2008
    ssDNA ligase (100 U/μ L)EpicentroCL9021KFornecido com tampão 10X CircLigase II e 50 mM MnCl2
    Microfrascos de aço inoxidável, 1,8 mLProdutos BioSpec2007
    SacaroseRPIS24060-5000.0
    SW-41 Ti rotorBeckman Coulter331362
    Bomba de seringaNew Era Pump SystemsNE-300
    Polinucleotídeo quinase T4 (10.000 U/mL)NEBM0201SFornecido com tampão polinucleotídeo quinase 10X T4 T4
    RNA ligase 2 truncado KQ (200.000 U/mL)NEBM0373SFornecido com tampão ligase de RNA 10X T4 e 50% PEG8000
    TermocicladorBio-Rad1851148
    tubos de polialômero de parede fina, 13,2 mLBeckman Coulter331372
    Triton X-100Monitor UV Sigma AldrichX100-100ML
    Bio-Rad7318160
    Saccharomyces cerevisiae cepa BY4741Open BiosystemsYSC1048
    Kit de isolamento de mRNA Poly(A) DTT de 0,1 M Inibidor de RNase

    Referências

    1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
    2. Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. Regulation of mRNA translation during mitosis. Elife. 4, (2015).
    3. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
    4. Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).
    5. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
    6. Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).
    7. Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).
    8. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
    9. Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling. Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).
    10. Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).
    11. Zhong, Y., et al. RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints. Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).
    12. Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data. Nat Commun. 7, 11194(2016).
    13. Chung, B. Y., et al. The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis. RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).
    14. Popa, A., et al. RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing. F1000Res. 5, 1309(2016).
    15. Dunn, J. G., Weissman, J. S. Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data. BMC Genomics. 17 (1), 958(2016).
    16. Baranov, P. V., Michel, A. M. Illuminating translation with ribosome profiling spectra. Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).
    17. Calviello, L., et al. Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data. Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).
    18. Michel, A. M., et al. RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data. RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).
    19. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).
    20. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25(2009).
    21. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
    22. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550(2014).
    23. van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).
    24. Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
    25. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
    26. Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).
    27. Weinberg, D. E., et al. Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation. Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).
    28. Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle. Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).
    29. Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability. J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).
    30. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic Acids Res. 45 (2), e6(2017).
    31. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Res. 42 (17), e134(2014).
    32. O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density. Nat Commun. 7, 12915(2016).

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