Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar o efeito dos peptídeos na migração das células epiteliais brônquicas. Este método permite a obtenção rápida e altamente reprodutível de dados quantitativos sobre a velocidade de fechamento de migração e ferida de célula.
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Artigo de método
Um romance em Vitro ferida cura ensaio para avaliar a migração celular
Neste artigo
Resumo
Resumo
O objetivo deste trabalho é apresentar um novo método para avaliar a capacidade de algumas moléculas de imunomoduladores, como peptídeos antimicrobianos (AMPs), para estimular a migração celular. Importante, migração celular é um evento limitante durante o processo de cicatrização de feridas para re-estabelecer a integridade e a função normal das camadas de tecido após a lesão. A vantagem deste método sobre o ensaio clássico, que é baseado em um arranhão feito manualmente em uma monocamada de células, é que o uso da cultura de silicone especial insere fornecendo dois compartimentos para criar um campo de pseudo ferido sem célula com uma largura bem definida (500 μm ). Além disso, devido a uma plataforma de análise automatizada de imagem, é possível obter rapidamente dados quantitativos sobre a velocidade da migração de encerramento e célula de ferida. Mais precisamente, será mostrado o efeito de duas ampolas de pele de sapo sobre a migração de células epiteliais brônquicas. Além disso, tratamento prévio destas células com inibidores específicos irá fornecer informações sobre os mecanismos moleculares subjacentes a tais eventos.
Introdução
Isso é amplamente conhecido que a cicatrização de feridas em animais é um processo fundamental para restabelecer a integridade e a função normal das camadas de tecido após lesão1. Apesar de superfícies epithelial expostas ao ambiente externo (por exemplo, a pele, respiratória e trato gastrointestinal) formam uma barreira protetora de insultos físicos e químicos, a formação de feridas pode ocorrer facilmente, especialmente depois cirurgia ou infecções microbianas2. Como exemplo, a colonização do tecido pulmonar pelo patógeno oportunista bacteriano Pseudomonas aeruginosa, especialmente em pessoas com fibr....
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Protocolo
1. preparação da pilha
- Sementes 2.5x106 células em 10 mL de mínimo essencial médio (MEM) suplementada com glutamina 2mm (MEMg), e mais 10% de soro fetal bovino (FBS), antibióticos (0,1 mg/mL de penicilina e estreptomicina) e puromicina (0,5 µ g/mL para a seleção e manutenção da linha de células) em um balão de T75. Incube o frasco a 37 ° C e 5% de CO2 por 2 dias. Antes de iniciar o experimento, verificar a confluência das células sob um microscópio invertido.
Nota: As células utilizadas para o experimento são imortalizadas brônquicas epiteliais células humanas transfectadas com um vetor de Lentivirus confere resistência à puromicina.....
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Resultados
Este protocolo foi utilizado para determinar a efeito de Esc(1-21) e Esc(1-21) - 1 c em termos de actividade de migração celular induzida em células epiteliais brônquicas expressando a CFTR funcional de cicatrização de feridas. Neste ensaio, inserções de cultura foram colocadas em poços de uma placa de 12, e cada compartimento foi inoculado com 35.000 células em MEMg suplementado com 10% FBS. As células atingiu completa confluência dentro de 24 h. depois, uma lacuna de 500 μm foi gerada, .......
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Discussão
Migração celular é um processo essencial em muitos eventos fisiológicos e patológicos, incluindo a cicatrização de feridas, desenvolvimento embrionário e metástases. O procedimento básico para estudar célula migração em vitro envolve: (i) a criação de uma monocamada de células, (ii) a produção de uma pseudo ferida na camada confluente das células, (iii) a captura de imagens em intervalos de tempo diferentes até ferida encerramento é alcançado. e (iv) a análise da sequência de imagem de forma a quantificar a velo.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por fundos da Universidade Sapienza de Roma e da Fundação de pesquisa de fibrose cística italiano (projeto FFC #11/2014 adoptada pelo FFC delegações de Pavia, Sondrio Valchiavenna, Cerea Il Sorriso di Jenny e Siena). Parte deste trabalho também foi apoiado por FILAS Grant Prot. FILAS-RU-2014-1020.
Nós estamos gratos ao Dr. Loretta Ferrera (U.O.C. Genetica Medica, Istituto Giannina Gaslini, Genova, Itália) para fornecer as células epiteliais brônquicas.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Meio essencial mínimo (MEM) | Euroclone | ECB2071L | Quente em 37 ° C banho-maria antes de usar |
| Glutamina | Euroclone | ECB3000D | |
| Soro Fetal Bovino Inativado por Calor (FBS) | Euroclone | ECS0180DH | |
| Penicilina e estreptomicina | Euroclone | ECB3001D | |
| Puromicina | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Tripsina/EDTA 1X em PBS | Euroclone | ECB3052D | Aquecer à temperatura ambiente antes |
| de usar DPBS sem cálcio e magnésio (CMF-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DPBS com cálcio e magnésio (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Ibidi Cultura-Inserção 2 poços | Ibidi | 80209 | |
| Wimasis Análise de Imagem | Ibidi | 30002 | |
| Software PRISM | GraphPad | versão 6.0 |
Referências
- Enyedi, B., Niethammer, P. Mechanisms of epithelial wound detection. Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).
- Kujath, P., Kujath, C. Complicated skin, skin structure and soft tissue infections - are we threatened by multi-resistant pathogens? Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., ....
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Reimpressões e permissões
