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Artigo de método

Enriquecimento de lipoproteínas bacterianas e preparação do N-terminal Lipopeptides de determinação estrutural por espectrometria de massa

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DOI:

10.3791/56842

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21 de maio de 2018

 , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Pennsylvania State University

Neste artigo

Resumo

O enriquecimento de lipoproteínas bacterianas usando uma fase de tensoativo não-iônico, método de particionamento é descrito para utilização directa em ensaios TLR ou outras aplicações. Novos passos são detalhados para preparar tryptic lipopeptides N-terminal para caracterização estrutural por espectrometria de massa.

Resumo

As lipoproteínas são importantes constituintes do envelope celular bacteriana e potentes ativadores da resposta imune inata dos mamíferos. Apesar de sua importância para a fisiologia celular e Imunologia, ainda muito para ser descoberto sobre formas de lipoproteína romance, como eles são sintetizados e o efeito das várias formas de imunidade do hospedeiro. Para habilitar estudos aprofundados sobre as lipoproteínas, este protocolo descreve um método para o enriquecimento de lipoproteína bacteriana e preparação do N-terminal tryptic lipopeptides de determinação estrutural por laser assistida por matriz desorção ionização-tempo de voo espectrometria de massa (MALDI-TOF-MS). Expandindo-se em uma fase de Triton X-114 estabelecida particionamento método para extração de lipoproteína e enriquecimento da membrana da célula bacteriana, o protocolo inclui etapas adicionais para remover contaminantes não-lipoproteína, aumentando o rendimento de lipoproteína e pureza. Desde que lipoproteínas são comumente utilizadas em ensaios de receptores do tipo Toll (TLR), é fundamental para primeiro caracterizar a estrutura do N-terminal por aquiem MALDI-TOF MS., um método é apresentado para isolar peptídeos hidrofóbicos concentrados, enriquecidos no N-terminal lipopeptides adequados para análise direta por MALDI-TOF MS/MS. lipoproteínas que foram separados por sódio Dodecil sulfato de Poly-Acrylamide electroforese do Gel (SDS-PAGE) são transferidos para uma membrana de nitrocelulose, digerido em situ com tripsina, sequencialmente lavado para remover peptídeos tryptic polares e finalmente eluída com clorofórmio-metanol. Quando acoplado com MS dos peptides mais polares trypsinized de soluções de lavagem, este método fornece a capacidade para identificar a lipoproteína e caracterizar seu N-terminal em uma única experiência. Sódio intencional aduto formação também podem ser empregados como uma ferramenta para promover mais espectros de fragmentação estruturalmente informativo. Em última análise, enriquecimento de lipoproteínas e determinação das suas estruturas de N-terminal permitirá estudos mais aprofundados sobre esta classe onipresente de proteínas bacterianas.

Introdução

Lipoproteínas bacterianas são caracterizadas por uma cisteína conservada de lipídios-modificado N-terminal que ancora o domínio de proteínas globulares na superfície da membrana celular. Eles são universalmente distribuídos em bactérias, constituindo 2 a 5% de todos os genes celulares dentro de um genoma típico1. Lipoproteínas desempenham um papel crítico em uma ampla variedade de processos celulares, incluindo a absorção de nutrientes, transdução de sinal, montagem de complexos de proteínas, bem como na manutenção celular envelope integridade estrutural2. Em bactérias patogênicas, lipoproteínas servem como fatores de virulência3,4. Durante uma infecção, o reconhecimento do N-terminal lipopeptides pelos receptores do tipo Toll (TLR) 2 incita a uma resposta imune inata para remover patógenos invasores. Dependendo do estado de acilação do N-terminal, lipoproteínas são geralmente reconhecidas pelo alternativo TLR2 heterodimérica complexos. TLR2-TLR1 reconhece lipopeptides N-acylated, enquanto TLR2-TLR6 liga livre lipopeptide α-amino termini. Uma vez acoplado, as vias de sinalização convergem para induzir a secreção de proinflammatory cytokines3,4.

Anteriormente, pensava-se que as lipoproteínas de bactérias gram-positivas eram diacylated e os de bactérias Gram-negativas foram triacylated, diferenciando-se na ausência ou presença de um ácido graxo Amida-lig sobre os resíduos de cisteína conservados N-terminal. Esta hipótese foi apoiada pela falta de sequência orthologs em Gram-positivas genomas de Lnt, o transferase N-acil Gram-negativas que forma de lipoproteínas triacylated5. No entanto, estudos recentes têm revelado lipoproteína triacylation em Gram-positivas Firmicutes essa falta de lnt, bem como três estruturas romance de lipoproteína de N-terminal, denominadas o peptidyl, super e N -acetil formas6,7 ,8. Estas descobertas levantam questões sobre formas de lipoproteína possível para ser descoberto, ao lado de questões fundamentais sobre como estas lipoproteínas romance são feitas e que finalidade fisiológica ou vantagem das diversas formas transmitir. Além disso, eles demonstram claramente a incapacidade atual de genômica para prever a estrutura de lipoproteína. Com efeito, recentemente identificamos uma classe nova de transferases N-acil de lipoproteína, chamado Lit, de Enterococcus faecalis e Bacillus cereus que faz superformulário lipoproteínas9. Isto indica a necessidade de verificar experimentalmente a estrutura de lipoproteína, que pode ser um desafio devido à sua natureza extremamente hidrofóbica e limitados métodos disponíveis para caracterizar sua estrutura molecular.

Para facilitar estudos na indução de lipoproteína da resposta imune do hospedeiro, bem como a determinação estrutural N-terminal, adaptámos vários protocolos descritas anteriormente, a fim de purificar as lipoproteínas bacterianas e preparar o N-terminal tryptic lipopeptides para análise por MALDI-TOF MS6,10,11,12. As lipoproteínas são enriquecidas usando uma fase estabelecida de Triton X-114 (doravante referido como surfactante ou TX-114) método, com otimização para remover contaminantes não-lipoproteínas e aumentar o rendimento de lipoproteína de particionamento. Estas lipoproteínas são adequadas para uso direto em ensaios TLR ou mais purificação por SDS-PAGE. Para MALDI-TOF MS, transferência das lipoproteínas para membrana de nitrocelulose prevê um andaime eficiente em situ digestão do trypsin, lavagem e eluição subsequente da superfície da membrana, resultando no altamente purificado lipopeptides N-terminal. Nitrocelulose foi mostrado para facilitar o manuseio de amostras e melhorar a cobertura de sequência para peptídeos altamente hidrofóbicos das proteínas de membrana integrais13,14, bem como as lipoproteínas9,10 . O método tem a vantagem adicional de fracionamento peptídeos baseados na polaridade, para que soluções de lavagem intermediária podem ser analisadas para identificação de proteínas de alta confiança simultaneamente com determinação estrutural N-terminal em uma única experiência . Este protocolo exclusivamente intencional sódio características aduto formação para promover a fragmentação de íon de pai para dehydroalanyl íons durante MS/MS, auxiliando na atribuição estrutural do estado de - acilação N. N-terminal é ambos a característica mais variável e chave relacionada ao reconhecimento TLR de lipoproteínas. Tomados em conjunto, este protocolo tem permitido estudos intensivos e reprodutíveis sobre as lipoproteínas, com diferentes etapas de purificação e determinação estrutural por MALDI-TOF MS facilmente adaptado dependendo o objetivo geral do experimento.

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Protocolo

1. crescimento e Lysis da pilha

  1. Cresce bactérias em 15 mL de caldo de tryptic soy (TSB) ou mídia similar ao final da fase exponencial (OD600 de 1.0-1.5). Colheita de células por centrifugação, lave uma vez com solução tampão salino/EDTA (TBSE) e continuar com protocolo ou congelar até o uso.
    Nota: TBSE: 20 mM Tris-cloridrato (HCl), pH 8.0, 130 mM de cloreto de sódio (NaCl) e 5 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)). Modificação e expressão de lipoproteína podem ser influenciadas por condições de crescimento (por exemplo, acidez, salinidade, meios de crescimento) e fase de crescimento15. Crescimento da pilha pode ser escalado como desejado, mas 15 mL de células é recomendado para uma única preparação de lipoproteínas como biomassa em excesso pode diminuir o rendimento de lipoproteína. Uma preparação de 15 mL geralmente produz suficiente amostra para carregamento ideal de ~ 2-4 pistas em um padrão mini gel de SDS-PAGE.
  2. Ressuspender as células em 800 μL TBSE com fluoreto de sulfonila fenilmetil 1mm (PMSF) e lisozima 0,5 mg/mL. Transferir a solução para um tubo de rosca microcentrifuga 2,0 mL com tampa de rosca e o-Ring e incube por 20 min a 37 ° C.
    Nota: Certas espécies não são suscetíveis à Lise por lisozima. Uma enzima lítica apropriada deve ser substituída para auxiliar na Lise.
  3. Adicionar contas de zircônia/sílica ~ 800 μL 0,1 mm para o tubo e rompa as celulas agitando a velocidade máxima (7.000 rpm) em um homogeneizador de 5 ciclos de 30 s cada, com 2 min descansar no gelo entre cada ciclo.
  4. Amostra de centrífuga a 3000 x g por 5 min a 4 ° C (a pelota grânulos e ininterrupta de células). Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 2,0 mL microcentrifuga e manter no gelo.
  5. Adicionar 200 μL TBSE a remanescente e retornar para o homogeneizador para um ciclo adicional. Centrifugar (como acima) e combinar o sobrenadante com o sobrenadante anterior (deve ser o volume total de 800-1000 μL).

2. enriquecimento de lipoproteínas Particionando fase TX-114

  1. Complementar o sobrenadante com surfactante TX-114 para uma concentração final de 2% (vol/vol) adicionando um volume igual de 4% (vol/vol) o surfactante em TBSE gelada e incubar no gelo por 1h, misturar por inversão cada ~ 15 min.
    Nota: Quando refrigerados, o sobrenadante e surfactante será miscíveis.
  2. Transferir o tubo para banho maria a 37 ° C e incubar durante 10 min induzir a separação de fases. Centrifugar a amostra a 10.000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente para manter a separação entre bi-fásicos.
  3. Delicadamente, pipetar fora a fase aquosa superior e descarte. Adicionar TBSE gelada para a fase inferior do surfactante para encher o tubo ao seu volume original e inverter para misturar. Incube no gelo por 10 min.
  4. Transferir o tubo para banho maria a 37 ° C e incubar durante 10 min induzir a separação de fases e, em seguida, centrifugar a 10.000 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente.
  5. Repita etapas 2.3-2.4 mais uma vez, para um total de 3 separações. Retire a fase aquosa superior e descarte.
  6. Retire o chumbo das proteínas precipitados que se formou durante o curso de extracções (visíveis na parte inferior do tubo), adicionando-se 1 volume de TBSE gelada para a fase de surfactante. Centrifugar a 4 ° C a 16.000 x g por 2 min para proteína insolúvel de Pelotas.
    Nota: A amostra deve manter uma única fase. Se ocorrer separação de fases, re-calma amostra e centrifugar novamente. A pelota é geralmente composta de contaminantes não-lipoproteína, mas pode ser retida para posterior análise.
  7. Imediatamente transferi o sobrenadante para um tubo de fresco microcentrifuga de 2,0 mL contendo 1250 μL de acetona 100%. Pipete acima e para baixo completamente para lavar a amostra da ponta, que vai ser viscoso. Misturar por inversão e incubar durante uma noite a-20 ° C para precipitar proteínas.
  8. Centrifugar a amostra a 16.000 x g por 20 min em temperatura ambiente para lipoproteínas com atenção para a orientação do tubo de Pelotas. Lipoproteínas irão formar uma película fina, branca ao longo da parede exterior do tubo.
  9. Pellet de lavar duas vezes com 100% de acetona. Decantar a acetona e deixar secar a amostra ao ar.
  10. Adicionar 20 a 40 μL de 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 ou um padrão de tampão de amostra Laemmli SDS-PAGE16 e completamente Resuspenda pipetando para cima e para baixo contra a parede com as precipitado lipoproteínas. Raspe a lateral do tubo com a ponta da pipeta para desalojar as lipoproteínas.
    Nota: As lipoproteínas não se dissolverá em tampão Tris, mas prefiro formam uma suspensão.
    1. Armazenar as lipoproteínas a-20 º C até o uso.

3. SDS-PAGE, eletroblotting e coloração com Ponceau S

  1. Lipoproteínas separadas por SDS-PAGE usando métodos padrão16.
    Nota: A percentagem de acrilamida gel apropriado pode variar dependendo de seu uso pretendido e tamanho de lipoproteínas. Aqui, lipoproteínas E. faecalis foram separadas mais um 10% gel de Tris-glicina, enquanto um gel Tris-tricine de 16,5% foi usado para a lipoproteína de e. coli menor Lpp17.
  2. Transferi as lipoproteínas para uma membrana de nitrocelulose transferência usando um procedimento padrão eletroblotting.
    Nota: Uma transferência semi seca usando Bjerrum Schafer-Nielsen buffer mais 0,1% SDS foi realizada a 25 V, 1.3 mA para min 1518. Alternadamente, polivinilideno (PVDF) de difluoreto membrana pode ser usada, no entanto, como é mais hidrofóbica de nitrocelulose, pode reduzir eficiente eluição de lipopeptides hidrofóbico da membrana em etapas posteriores.
  3. Transferi a membrana de nitrocelulose para um recipiente e cubra com a solução de Ponceau S (0,2% (p/v) Ponceau S em ácido acético a 5%). Rocha suavemente durante 5 minutos, ou até vermelho-rosa bandas são visíveis.
  4. Decantar a solução de Ponceau S e Enxagúe cuidadosamente a membrana de nitrocelulose com dH2O para remover o excesso de manchar.
    Nota: Bandas Ponceau manchada serão destain rapidamente. Se desaparecerem, bandas, repita o processo de coloração.
  5. Com uma lâmina de barbear limpa, excisar a banda desejada e a transferência para um tubo de microcentrifugadora. Lavar três vezes com 1 mL de dH2O para destain completamente a banda.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Loja a seção extirpada coberto com água a-20 ° C até o uso.
  6. A seção de transferência para uma superfície limpa e com uma lâmina de barbear limpa, a tira de nitrocelulose com dados em pequenos pedaços de aproximadamente 1 mm x 1 mm. coletar os pedaços em um tubo de microcentrifuga de ligação baixa proteína de 0,5 mL.
  7. Lave as peças duas vezes com 0,5 mL de 50mm recém-preparado bicarbonato de amónio (NH4HCO3), 7,8 de pH em água de grau de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC).

4. tryptic digestão, Lipopeptide extração de membrana de nitrocelulose, deposição em destino MALDI e aquisição de dados

  1. Resuspenda pedaços de nitrocelulose em 20 μL de solução de tripsina em 50mm NH4HCO3, pH 7,8 em água de grau HPLC 20 μg/mL. Vórtice de misturar, em seguida girar brevemente para assegurar que todas as peças são totalmente cobertas pela solução tripsina. Cobrir a tampa do tubo usando a película de parafina para evitar a evaporação e incubar a digerir durante a noite a 37 ° C.
  2. Girar a amostra a 16.000 x g, durante 30 s e remover o líquido por pipetagem.
    Nota: Isto remove trypsinized hidrofílicos peptídeos que podem ser examinados mais tarde por MALDI-TOF MS para identificação de proteínas.
  3. Adicione 50 μL de 0,5% o ácido trifluoroacético (TFA) em água de grau HPLC. Vórtice para misturar e, em seguida, girar a amostra brevemente para assegurar que todas as peças são cobertas pela solução. Incube durante 10 minutos à temperatura ambiente. Remova o líquido por pipetagem.
    Atenção: TFA é prejudicial se inalado. Manipular com cuidado e use na coifa química. Evite o contacto com a pele.
  4. Repita a etapa 4.3 com 50 μL de acetonitrilo de 10% em água de grau HPLC.
    Atenção: Acetonitrilo é prejudicial se inalado. Manipular com cuidado e use na coifa química. Evite o contacto com a pele.
  5. Repita a etapa 4.3 com 50 μL de acetonitrilo de 20% em água de grau HPLC.
    Observação: Isso remove qualquer peptídeos hidrofóbicos moderadamente frouxamente ligados a nitrocelulose.
  6. Eluir o lipopeptides firmemente ligados, adicionar 15 μL de 10 mg/mL acabadas α-cyano-4-hidroxicinâmicos ácido (CHCA) matriz dissolvido no clorofórmio-metanol (2:1, v/v) e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente com utilização do Vortex intermitente.
    1. Alternadamente, adicione 15 μL de clorofórmio-metanol para eluir lipopeptides e misture com a matriz em um momento posterior. Outras matrizes, tais como o ácido benzoico-2,5 (DHB), devem ser testados como alternativas a CHCA se obtêm-se resultados satisfatórios para uma composição específica lipopeptide.
      Atenção: Tanto clorofórmio e metanol são prejudiciais se inalado. Manipular com cuidado e use na coifa química. Evite o contacto com a pele.
    2. Opcional: Para promover o sódio aduto de formação, complementar a solução de CHCA em clorofórmio-metanol com aquosa de bicarbonato de sódio (NaHCO3) a uma concentração final de 1 mM.
  7. Gire a amostra brevemente. Com uma pipeta, transferi cuidadosamente o líquido para um novo tubo de microcentrifuga de ligação de baixa proteína. Esta solução irá conter a maior parte do N-terminal lipopeptides.
    Nota: A nitrocelulose pode parcialmente ou totalmente dissolver na solução de clorofórmio-metanol. Isto não afetará negativamente os resultados do MS e pode ser usado como um método alternativo para aumentar o retorno de lipopeptide. Membrana PVDF não se dissolverá na mesma maneira.
  8. Deposite 1 μL do lipopeptides eluted com CHCA em um alvo MALDI aço polido.
    Nota: O clorofórmio-metanol evaporará rapidamente, deixando para trás cristalizado CHCA e lipopeptides. Um opcional segundo 1 μL alíquota pode ser depositado no mesmo local para aumentar a concentração da amostra. Clorofórmio-metanol pode propagar-se significativamente após a deposição sobre o alvo, e como tal, deve ter cuidado para evitar a mistura de amostra no alvo. É recomendável para depositar e atirar em vários pontos de cada amostra.
  9. Seguir para a espectrometria de massa. Varredura de todas as áreas da mancha para lipopeptide sinal, especialmente se o local contém duas camadas de amostra, como a segunda camada pode empurrar o lipopeptides a orla exterior do local.
    Nota: A intensidade de laser partida recomendada é 25%, embora pode ser necessário aumentar a intensidade para adquirir o sinal e soma vários espectros (varreduras de 20 ou mais) para alcançar a relação sinal-ruído adequada. Aqui, os espectros foram adquiridos em um instrumento de MALDI-TOF-TOF (consulte a Tabela de materiais) usando um método de instrumento configurado de fábrica para a deteção de iões positivos do refletor na gama de m/z 700-3500. O instrumento foi calibrado com uma mistura de peptídeo tryptic albumina de soro bovino (BSA).

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Resultados

Um esquema do protocolo é fornecido na Figura 1. A fração de lipoproteína enriquecido extraída de Enterococcus faecalis ATCC 19433 por TX-114 é mostrada na Figura 2. Para comparação, o padrão de bandas da fração proteína precipitado também é mostrado. Proteínas dessa fração foram confirmadas por MALDI-MS para ser altamente abundante contaminando as proteínas além de lipoproteínas (tabela 1). Os espectros...

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Discussão

O protocolo neste documento descreve dois estágios distintos de caracterização de lipoproteína: determinação estrutural e particionamento por MALDI-TOF MS de fase de enriquecimento por TX-114. Durante a extração de TX-114, centrifugação adicional remove proteínas contaminantes que precipitar durante este processo, seguido por precipitação de acetona para produzir altamente enriquecido de lipoproteínas. Limitando-se a escala de cada preparação para 15 mL no valor de células, várias amostras podem ser facilmente transforma...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Pesquisa no laboratório de Meredith foi apoiada por fundos de inicialização fornecidos pela faculdade Eberly da ciência (Pennsylvania State University). Agradecemos o Dr. Tatiana Laremore para aconselhamento técnico e acesso aos equipamentos da proteômica do estado de Penn e massa espectrometria Core Facility, University Park, PA, onde realizaram-se análises de espectrometria de massa.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Materiais
0,01 mm Zircônia/sílicaProdutos BioSpec110791012
Ácido acéticoEMDAX0073-9
AcetonaEMDAX0116-6
AcetonitrilaEMDAX0142-6
Bicarbonato de amônioFluka Analytical09830
BioTrace NT NitrocelulosePALL Ciências da Vida66485
Albumina de soro bovino (BSA) digerir padrãoProteaPS-204-1
ClorofórmioAcros Organics423550025
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)Fisher ScientificBP118
HPLC Grau águaEMDWX0008-1
LysozymeFisher ScientificBP535-1
MetanolSigma-Aldrich34860
Fluoreto de fenilmetil sulfonil (PMSF)Amresco0754
Perfurar protease de tripsinaThermo Scientific90057
Ponceau SAcros Organics161470100
Protein LoBind Tube 0.5mLEppendorf022431064
Bicarbonato de sódioSigma-Aldrich792519
Cloreto de sódioMacron Fine Chemicals7581-06
Ácido trifluoroacético (TFA)Sigma-Aldrich299537
Tris-cloridrato (HCl)Fisher ScientificBP152
Triton X-114Sigma-Aldrich93422
Caldo de soja tríptico (TSB)Ácido BD211822
&alfa;-ciano-4-hidroxicinâmico (grau MS)Sigma-AldrichC8982
NomeEmpresa<strong>Número de catálogoComentários
Equipamento
MagNALyserRoche
Trans-Blot Turbo Transfer SystemBio-Rad
MALDI-TOF alvoBruker Daltonics
Ultraflextreme MALDI-TOF-TOFBruker DaltonicsEquipado com um laser Nd:YAG smartbeam-II triplicado em frequência de 355 nm

Referências

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