Alto Throughput, absoluta determinação do conteúdo de uma proteína selecionada em níveis de tecido usando quantitativa Dot Blot Analysis (QDB)

Resumo

Aqui vamos demonstrar um processo detalhado de análise de borrão ponto quantitativa (QDB) determinando o conteúdo absoluto de uma proteína alvo, tampando a proteína actina, como gelsolin (CAPG), em três tecidos diferentes do rato. Vamos demonstrar um alto throughput, conveniente, quantitativos immunoblot técnica para validação de biomarcador no nível celular e tecido.

Resumo

Falta um conveniente, método de immunoblot quantitativa, alta taxa de transferência para absoluta determinação do conteúdo de uma proteína específica a nível celular e tecido significativamente dificulta o progresso na pesquisa de proteômica. Resultados derivados de immunoblot atualmente disponíveis técnicas também são relativos, impedindo quaisquer esforços para combinar estudos independentes com uma análise em larga escala de amostras da proteína. Neste estudo, demonstramos o processo de análise de borrão ponto quantitativa (QDB) para alcançar a quantificação absoluta em um formato de alta taxa de transferência. Usando um padrão de proteína disponível comercialmente, somos capazes de determinar o conteúdo absoluto de nivelamento da proteína actina, como gelsolin (CAPG) em amostras da proteína preparados a partir de três tecidos de mouse diferente (rins, baço e próstata) juntamente com um detalhado explicação dos detalhes experimentais. Propomos a análise QDB como um método de immunoblot conveniente, quantitativos, alta taxa de transferência de quantificação absoluta de proteínas individuais a nível celular e tecido. Este método irá ajuda substancialmente biomarcador validação e verificação de percurso em várias áreas de pesquisa biológica e biomédica.

Introdução

Ao lado com os emocionantes avanços em pesquisa genômica nos anos recentes, campo de investigação biomédica também testemunhas o avanço significativo na pesquisa proteômica. Com o aumento da acumulação de dados biológicos em ambos genômica e proteômica níveis, usando ferramentas de bioinformatic para analisar esses dados tornou-se o foco da investigação biomédica no futuro perceptível. Consequentemente, o sucesso da pesquisa de bioinformatical aumenta a demanda por mais e melhor qualidade dos dados da comunidade de pesquisa biológica e Biomédica, uma tarefa só pode ser alcançada através do avanço da técnica em genômica e proteômica níveis.

Espectrometria de massa (MS) e análise de immunoblot são duas técnicas predominantes de análise de proteínas atualmente. MS tem dominado a pesquisa proteomic nos últimos anos para permitir a análise de milhares de proteínas individuais simultaneamente. As técnicas baseadas em immunoblot, incluindo borrão ocidental e borrão de ponto, por outro lado, também desempenharam um papel significativo na pesquisa da proteína mesmo desde sua invenção^{1,2,3,4, 5}. Enzima lig da imunoabsorção ensaio (ELISA)^5,6,7 e fase reversa proteína microarray (RPPM)^8,9 pode ser considerada como o formato de alta taxa de transferência de immunoblot análise. No entanto, todos esses métodos de imunoensaio, exceto ELISA, medem o nível de expressão relativa de uma proteína específica. A natureza relativa desses métodos se tornará um problema real para estudos populacionais, como a análise deve ser feita ao mesmo tempo, impedindo quaisquer esforços para aumentar o tamanho da piscina através de múltiplas análises. Além disso, os resultados derivados destes estudos são apenas semi-quantitativa, assim complicando qualquer Bioinformática na análise dos dados. Entretanto, embora ELISA é bem adequada para análise de absoluto alto throughput de amostras da proteína, esta técnica parece enfrentar desafios em ambientes complexos, tais como células ou tecidos devido a sua capacidade de ligação de baixa e multiplexação de¹⁰.

Desenvolvemos um método de immunoblot adequado para estudos populacionais com as principais características de ser conveniente, alta taxa de transferência, quantitativa e apropriada para absoluta determinação do teor de proteína e chamado essa mancha de ponto quantitativa de técnica análise (QDB)¹¹. Neste estudo, apresentamos um protocolo detalhado para análise QDB e demonstrar o método de determinação do teor de proteína absoluto de uma proteína específica, a CAPG, em três rato diferentes tecidos, incluindo rins, baço e próstata. Pensamos que este protocolo detalhado ilustra bem a viabilidade e conveniência deste método e fornecer orientações sobre como evitar as armadilhas potenciais na prática desse método.

Protocolo

Todos os procedimentos de animais foram efectuados na linha Binzhou diretiva de uso de Animal médicos de Universidade e aprovados pelo Conselho de revisão ética da Universidade de medicina de Binzhou.

1. preparação da amostra

1. Leve tecido de rato de 50 mg em um tubo de 1,5 mL. Juntar 200 µ l tampão de lise (50 mM Hepes, pH 7,4, 137 mM de NaCl, 5 mM EDTA, 5mm EGTA, 1 mM MgCl₂, 10mm Na₂P2O₇, 1% Triton X-100, 10% de glicerol), complementado com inibidores de protease e fosfatase (100mm NaF, phenylmethylsulfonyl 0.1 mM flúor, 5 µ g/mL pepstatin, 10 µ g/mL leupeptin, aprotinina 5 µ g/mL).
2. Homogeneizar o tecido com um homogenizador para 1 min no gelo.
3. Centrifugação por 10min a de 8 000 x g a 4 ° C.
4. Recolher o sobrenadante em novos tubos (1,5 mL) e tirar 1 µ l para ensaio de concentração da proteína com kit BCA.
   Nota: Todos os buffers de Lise comumente usados para a análise ocidental do Borrão e Dot blot análise podem ser usados para análise QDB.

2. determinar a especificidade do anticorpo

1. Preparar amostra lysates (20 µ g) na seção 1.4, IgG BSA gratuito (20 µ g), proteína padrão (pág. 600), para análise ocidental do borrão.
   Nota: IgG BSA livre é usado como um controle negativo e a proteína padrão é usada como controle positivo. A especificidade do anticorpo é demonstrada, mostrando uma banda do tamanho certo, usando a análise ocidental do borrão.

3. definir a escala Linear da análise QDB

1. Dissolva a proteína padrão com DDQ₂O. Dilua a proteína a uma concentração de 1.200 pg / µ l.
2. Dilua a concentrado proteína das amostras preparadas na seção 1.4 a 4 µ g / µ l.
3. Dissolva a BSA com DDQ₂O. Dilua a proteína a uma concentração de 1.200 pg / µ l e 4 µ g / µ l.
4. Uma série de diluição da proteína padrão e preparadas as amostras foram preparadas com a orientação da tabela 1 e tabela 2.
5. Mix 10 µ l diluição padrão proteína ou diluição preparou amostras e 10 µ l 2 x tampão de carregamento (pH de 120mM Tris-HCl 6,8, 20% glicerol, SDS de 4%, 0,2% azul de bromofenol, 200 mM DTT) juntos.

	S1 (0pg / µ l)	S2 (33.3pg / µ l)	S3 (100pg / µ l)	S3 (300pg / µ l)	S5 (600pg / µ l)	S6 (1200pg / µ l)
protein(1200pg/µl) padrão	0	1.39	4.17	12.5	25	50
IgG-livre BSA (4pg / µ l)	50	48.61	45,83	37.5	25	0
total	50	50	50	50	50	50

Tabela 1. Esquema de diluição para a curva padrão de proteínas.

	X1 (0µg / µ l)	X2 (0.25µg / µ l)	X3 (0.5µg / µ l)	X4 (1µg / µ l)	X5 (2µg / µ l)	X6 (4 µ g / µ l)
Sample(4µg/µl)	0	3.125	6.25	12.5	25	50
IgG-livre BSA(4µg/µl)	50	46.875	43.75	37.5	25	0
total	50	50	50	50	50	50

Tabela 2. Regime de diluição de amostras preparadas

6. Aqueça a mistura a 85 ° C por 5 min.

4. processo de análise QDB

1. Aplicativo de exemplo
   1. Suporte a placa QDB para evitar a parte inferior da placa de tocar a superfície da mesa. Por exemplo, use uma caixa de ponta da pipeta vazio como suporte.
   2. Carrega até 2 µ l da amostra para o centro da membrana na parte inferior da unidade individual da placa QDB.
2. A placa de secagem
   1. Deixar a placa QDB carregada por 1h no quarto temperadas (RT) ou como alternativa deixar o prato carregado a 37 ° C por 15 min em um espaço bem ventilado.
3. A placa de bloqueio
   1. Mergulhe a placa QDB no buffer de transferência (0,039 M glicina, 0,048 M Tris, 0,37% SDS, 20% de álcool metílico) e agitar suavemente a placa por 10 s.
   2. Lave a placa QDB suavemente com TBST (solução tampão salino, 0.1% Tween 20) três vezes e em seguida lavar a placa por 5 min em TBST sob agitação constante.
   3. Bloquear a placa QDB com tampão de bloqueio (5% de leite desnatado em TBST (100 µ l/poço) para 1 h, sob agitação constante.
4. Incubação do anticorpo primário
   1. Diluir o anticorpo primário no buffer de bloqueio em uma concentração escolhido (de 1:500 a 1:5 000) e adicionar 100 µ l de cada poço individual de uma placa de bem comum 96. Inserir a placa QDB em placa de 96 bem e incubar as placas combinadas ou por 2 h no RT ou durante a noite a 4 ° C, sob agitação constante.
   2. Como alternativa, coloque a placa QDB dentro de uma caixa e encha a caixa com tampão de bloqueio 2 a 3 mm acima da porção da membrana da placa, se o mesmo anticorpo é usado para a placa inteira. Adicione o anticorpo primário na concentração escolhida e incubar a placa ou por 2 h no RT ou durante a noite a 4 ° C por sob agitação constante.
   3. Lave a placa suavemente com TBST por três vezes antes que é lavado com TBST por três vezes, cada vez por 5 min sob agitação constante.
5. Incubação de anticorpo secundária
   1. Diluir o anticorpo secundário no buffer de bloqueio a concentração escolhida (a partir de 1:1, 000, 01:50, 000), e qualquer alíquota 100 µ l/poço em um prato bem 96 ou em uma caixa como descrito em secção 4.4.2 e então incubar a placa QDB dentro ou o pla bem 96 carregado te ou a caixa para 1 h no RT sob agitação constante.
   2. Lave a placa QDB delicadamente 3 vezes com TBST e, em seguida, lavar a placa por 3 vezes, 5 min cada com TBST sob agitação constante.
6. Quantificação
   1. Prepare o substrato quimioluminescência reforçada (ECL), seguindo as instruções do fabricante.
   2. Substrato de ECL alíquota em um prato bem (100 µ l/poço) 96 e inserir a placa QDB dentro a placa bem 96 por 2 min sob agitação constante.
   3. Remova a placa QDB o 96 placa bem e agitar rapidamente para remover o excesso de líquido. Coloque a placa em uma placa de microtitulação branco.
   4. Ligue o leitor de microplacas e selecione "prato com tampa" na interface do usuário antes de colocar os pratos combinados (QDB plate + adaptador de placa branca) dentro do leitor de microplacas para quantificação.
      Nota: Certifique-se de usar a placa de microtitulação branco, transparentes como um adaptador para evitar qualquer interferência da placa. Certifique-se de escolher "prato com tampa" para evitar a interferência da máquina quando combinado placas (adaptador QDB placa + 96 placa bem) são colocadas dentro do leitor de microplacas.

Resultados

A determinação da quantidade absoluta de qualquer proteína, incluindo a proteína CAPG no tecido do mouse requer um anticorpo específico e uma proteína purificada como padrão. A escala linear das análises de proteína padrão e os lysates também precisa ser estabelecida antes de qualquer análise em larga escala. O intervalo linear do anticorpo é altamente dependente do anticorpo por si, e a faixa de diluição adequada de um anticorpo específico precisa ser verificado por cada usuário individual.

Determinamos a especificidade do anticorpo CAPG no rim de rato, baço e próstata tecidos usando análise ocidental do borrão com o controle negativo (IgG BSA livre) e controle positivo (proteína CAPG comercialmente disponível) (Figura 1A). O anticorpo anti-CAPG foi específico contra lysates do baço de rato, coração, músculo e próstata (uma banda detectada). Faixas não-específicas foram observadas lysates do rim e fígado. No entanto, no rim lisado, as bandas não-específicos foram significativamente mais fracas do que a banda específica, o que sugere que o anticorpo é adequado para análise do tecido renal. Em seguida, o intervalo linear da proteína padrão e a quantidade de lisados para análises foram determinados por duas curvas de dose de lado a lado. Uma proteína CAPG disponível comercialmente foi serialmente diluída conforme indicado na tabela 1 , com base em nossas experiências passadas e os lysates de tecido do rim do rato, baço e próstata também foram diluídas com base na quantidade de proteína total nos lysates determinados por um kit de determinação de proteínas totais do BCA. Dois estudos de dose foram executados lado a lado e plotados juntos em Figura 1B. A quantidade adequada de lysates do rim de rato, baço e próstata foram escolhidos com base nos sinais QDB medidos pelo leitor de microplacas na unidade arbitrária. A leitura original para este experimento é mostrada na tabela 3.

Na última etapa, o padrão de proteína CAPG serialmente diluído e os lysates do rim de rato, baço e próstata foram carregados na chapa QDB. Neste caso, escolhemos a carga 0,3 µ g/amostra para lysates do rim de rato e baço e 1 µ g/amostra para lysates de análise de próstatas de rato, quanto a estes níveis, a leitura do QDB foi pelo menos 20 vezes sobre o plano de fundo enquanto bem dentro da escala linear da análise com base na curva de dose de ambos os lysates e a proteína padrão. A placa foi submetida ao protocolo descrito QDB antes que a placa foi quantificada diretamente pelo leitor de microplacas. Usando a proteína purificada serialmente diluída do CAPG, nós poderia estabelecer uma curva de dose-resposta, a equação e R2 por análise de regressão simples usando o software disponível (por exemplo, Microsoft office excel). O QDB sinais de lisados de rins do rato, baços e próstatas foram convertidas para a quantidade absoluta de CAPG proteína nestes lysates usando a equação estabelecida, e os resultados foram corrigidos pela quantidade total de proteínas, neste caso, 0,3 µ g para o lisado de spleens do rato e rins e 1 µ g para lysates de próstatas de rato, para a concentração final de proteína CAPG nestes tecidos como pg / µ g. Os resultados são mostrados na Figura 1C com a leitura original mostrada no tabela 4.

Figura 1 . Resultado representativo de uma análise QDB para determinar os níveis CAPG absolutos em três tecidos de rato (rins, baço e próstata). R. examinando a especificidade do anticorpo anti-CAPG usando o rato tecido lysates preparados a partir de baço, coração, músculo, rim, fígado e próstata usando ocidental análise borrão com o controlo negativo (IgG BSA livre) e o controle positivo (comercialmente proteína CAPG disponível). B. definindo as análises de escala linear do QDB de anticorpo anti-CAPG usando lysates preparados a partir da próstata, rins, baço e usando purificado recombinante da proteína CAPG padrão. Os resultados foram uma média de triplica. C. absoluta determinação dos níveis CAPG no lysates preparados a partir de próstatas, baço e rins do rato. Cada barra representa um tecido de um mouse individual. Os resultados foram a média de três vias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 3: Resultado de leitor de microplacas dos estudos de dose usando ambos serialmente diluída, lysates em pool de spleens do rato, rins e próstatas e purificado da proteína recombinante do CAPG.

Tabela 4: Resultam da análise do nível absoluto CAPG QDB leitor de microplacas nos rins do rato (8), baços (4) e próstatas (5) usando uma proteína recombinante do CAPG como padrão.

Discussão

Entre todas as atuais imunoensaio disponível técnicas de análise de proteínas exceto ELISA, análise do QDB é o único método para alcançar o conteúdo absoluto de uma proteína específica em níveis celular e tecido em um formato de alta taxa de transferência. Embora com padrão rotulado de isótopo estável, espectrometria de massa é capaz de alcançar a quantificação absoluta de algumas proteínas, esse método ainda não é projetado para alto desempenho de throughput. Neste estudo, demonstramos o processo de análise QDB, alcançar absoluta determinação do nível de proteína CAPG nos tecidos do mouse, incluindo rins, baço e próstata. CAPG níveis foram encontrados para ser entre 200 a 360 pg/g em tecidos de rim de rato, 460 para 650 pg/g no baço de rato e 330 para 390 pg/g nos tecidos da próstata do rato.

Em comparação com o ELISA, o QDB análise requer esforços mínimos a ser desenvolvido em um laboratório normal. Em primeiro lugar, a placa do QDB é um baseado em uma membrana de nitrocelulose para eliminar a etapa de revestimento em ELISA. Em segundo lugar, a análise QDB requer apenas um em vez de dois anticorpos específicos em um sanduíche ELISA. Em terceiro lugar, a alta capacidade de ligação da membrana de nitrocelulose em comparação com a superfície da placa ELISA também permite que a membrana suportar as etapas de lavagem rigorosas normalmente usadas na análise immunoblot para reduzir a interferência de fundo. Esse recurso é muito útil na análise complicada lysates preparados a partir de células e tecidos. Em contraste, devido a capacidade de ligação relativamente baixo de placas de ELISA, a redução do plano de fundo quando se analisa o lisado celular e tecido complicado torna-se um verdadeiro desafio no processo de desenvolvimento.

Análise QDB pode ser adotada facilmente em qualquer laboratório com o acesso de um anticorpo específico. No entanto, é importante mencionar que a especificidade do anticorpo é um termo relativo, limitado por fatores, incluindo a espécie, os tipos de tecido e tipos de células. Como mostrado na Figura 1A, CAPG anticorpo é específico ao analisar o lisado de próstata, baço e rim de rato e ainda se torna não-específica ao analisar o fígado de rato. Na verdade, encontramos rotineiramente um anticorpo para ser específico para o tipo de um tecido, mas não é sempre específica para outro tipo de tecido da mesma espécie. Assim, a análise prévia do borrão ocidental é necessário para garantir a especificidade da análise QDB. Na verdade, a especificidade do anticorpo pode ser a causa de resultados falsos, frequentemente associada com análise de ELISA, que não importa quanto esforço pode ter gastado a empresa de fabricação para garantir a especificidade do ensaio, eles não podem esgotar todos os possíveis tipos de amostras, os usuários podem optar por analisar usando seus produtos de ELISA.

Como com todos os imunoensaios, um problema potencial com o método de análise do QDB é a falta de consistência da qualidade do anticorpo comercial. Mesmo se a qualidade aparente de um anticorpo da mesma empresa (mesmo catálogo número, etc) é usada, pode haver grandes diferenças de uma compra para outro devido à variabilidade de lotes. Portanto, a menos que a plena confiança é alcançada na qualidade do anticorpo disponível, re-caracterizar o anticorpo em cima de cada compra é importante.

Em resumo, nós fornecemos aqui um protocolo detalhado e um exemplo ao usar o método de análise do QDB para alcançar absoluta determinação quantitativa de uma proteína específica no nível do tecido. Vamos mostrar que o método de análise do QDB é uma ferramenta conveniente para quem está interessado em alto throughput, análise quantitativa immunoblot. Sua capacidade de atingir a absoluta determinação do conteúdo de uma proteína específica em um nível celular e tecido também distinguir esta técnica de técnicas tradicionais immunoblot. Esta característica permite a combinação e comparação dos resultados de múltiplas análises, um passo necessário, especialmente em maiores estudos de população e a realização dos estudos de associação relevantes a nível de proteína no futuro próximo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Leitor de microplacas	: Tecan	Tecan Infinite 200 PRO
placa QDB	Yantai Zestern Co.Ltd		As placas estão disponíveis mediante solicitação para fins de verificação, seja por e-mail ou visitando www.zestern.net.
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)	jackson	711-035-152
Substrato de quimioluminescência aprimorada	Thermo	32134
Coelho anti-CAPG	Sino Biologic Inc	14213-T52
CAPG proteína	Sino Biologic Inc	14213-HNAE
Hepes	Sigma	H4034
Nacl	Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd	10461220
Mgcl2	Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd	20120802
EDTA	Sigma	E9884-500G
EGTA	Sigma	BNN1913
Na2P2O7	Haituo	20160914
Triton X-100	Sigma	T9284
Glicerol	Sigma	G7757
fluoreto de fenilmetilsulfonil	Sigma	P7626-5G
pepstatina	Sigma	Z290033
leupeptina	Sigma	L2884
aprotinina	Sigma	A3428
Tris-HCL	Sigma	T6455
SDS	Sigma	L5750-500G
DTT	Sigma	43815-1G
Bromphenol Blue	Sigma	B-0126
NaF	Sigma	S7920