Etiquetando metabólica e caracterização das RNAs de transferência usando Macroarrays

Níveis de tRNA celular variam de acordo com condições tais como o tipo de célula, ambiente e stress^1,2,3. SPOt, plataforma simplificada para observar o tRNA, é uma original, confiável e uma técnica simples que permite a rápida e precisa de quantificação dos níveis de RNA de transferência em organismos laboratório-crescido.

os tRNAs têm estruturas secundárias e terciárias notavelmente estável⁴. Eles também exibem numerosas modificações pós-transcricional⁵. Esses recursos representam significativa estrutural e bloqueios de estradas sequência de polarização ou às vezes impedindo direta e reprodutíveis tRNA perfis usando de técnicas de quantificação de RNA de referência padrão⁶. Grupos de pesquisa ao redor do mundo foram obrigados a desenvolver técnicas criativas, mas muitas vezes complicadas para avaliar níveis de tRNA celular. Alguns desses métodos incluem: (1) separação eletroforética bidimensional de tRNAs metabolicamente rotulado combinado com atribuição local metódica pelo Borrão do Norte¹; (2) individual quantificação por Northern blot usando cuidadosamente padronizado radioativo DNA sondas⁷; (3) pós-extração de rotulagem com fluorochromes cianina seguido de análise de microarray³e (4) em vitro descascamento de modificações de tRNA usando enzimas recombinantes demodification combinadas com a transcrição reversa e subsequentes arranjar em sequência do elevado-throughput,⁸.

SPOt é uma combinação simples e original de duas abordagens de padrão e simples: corpo de RNA (1) rotulagem, que consiste na síntese, no cultivo de organismos, de RNAs totais radioactivos e (2) tRNA macroarrays, uma ferramenta genômica sistemática e miniaturizada otimizado para segregação de tRNA.

As amostras são simplificadas de organismos vivos para a plataforma de quantificação. Eles são analisados diretamente após a extração e não processados mais longe que limita significativamente a preconceitos em relação às técnicas que requerem amplificação pós-extração ou tratamentos enzimáticos. SPOt é versátil e pode ser facilmente combinado para fracionamento de polysome a identificação e quantificação de subpopulações de tRNA fisicamente associados traduzir ribossomas.

O protocolo aqui apresentado é otimizado para Mycobacterium smegmatis, e foi usado também com sucesso para os tRNAs perfil em⁹ Escherichia coli,¹⁰ Saccharomyces cerevisiae, rato e culturas de células humanas¹¹ .

1. cultura e rotulagem metabólica

1. Picar uma vez o centro da tampa de um tubos de microcentrífuga estéril 1,5 mL com uma agulha de calibre 18, para permitir a aeração adequada. Inocular a 500 µ l de completados estéril 7h 9 caldo com 5 µ l de M. smegmatis de um starter cultura adulta durante a noite¹².
   Nota: A receita para um litro de 7h 9 caldo é: 4,7 g comercial 7h 9 em pó, 2 mL de glicerol, 1 mL de Tween 80, 0,85 g de NaCl, 5 g de albumina, 2 g de Dextrose, H₂O (para trazer o volume total de 1 L).
   1. (Cuidado) Seguindo as práticas padrão de protecção contra as radiações, spike o meio de cultura com 20 µCi/mL [³²P] Na₂HPO₄. Cresce bactérias a 37 ° C e 1.200 rpm agitação, numa incubadora shaker colocado atrás de um escudo acrílico grosso de 9mm.
2. Na fase midlog (O.D.600 nm ~ 0.5), transferir toda a cultura para um tubo de 2 mL tampa de rosca e bactérias radioativas à temperatura de pelotas por centrifugação para 2 min a 10.000 g. x coletar ortofosfato radioactivo não incorporado contendo sobrenadante em recipiente de resíduos adequado.

2. preparação do RNA total

Nota: Total RNAs são extraídos de pelotas bacterianas usando um reagente de extração de RNA comercial (contendo guanidínio tiocianato, fenol e clorofórmio) seguindo o protocolo do fabricante.

1. Adicione 1 mL do reagente de extração de RNA comercial e aproximadamente 200 µ l de esferas de vidro para a pelota. Tampar o tubo firmemente e perturbar a bacteriana em um homogeneizador por 2 min sob agitação máxima, (definindo o número cinco no instrumento escolhido (consulte a Tabela de materiais)).
2. Amostra de centrifugação a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 2 mL e descartar os grânulos apropriadamente. Adicionar 0,2 mL de clorofórmio e agitar vigorosamente o tubo à mão por 15 s. centrifugar a 12.000 x g por 15 min a 4 ° C.
3. Recolha a fase aquosa da amostra para um tubo novo por pesca o tubo a 45°. Evite qualquer interfase ou camada orgânica de desenho. Adicione 2 µ l de dessensibilizador colorida e 0,5 mL de isopropanol 100%. Agite o tubo vigorosamente à mão para 5 s. centrifugar a 12.000 x g por 10 min a 4° C.
4. Remover o sobrenadante do tubo e descartar adequadamente como a fracção líquida pode conter vestígios de radioactividade. Ar seco da pelota por 5 min e Resuspenda em 200 µ l de solução salina-citrato de sódio (SSC), 0,1% (p/v) Dodecil sulfato de sódio (SDS) final de 2x.
   Nota: A composição de estoque 20 X SSC é 3,0 M NaCl, citrato de sódio 0,3 M, pH 7,0.

3. preparação de 96 placas de impressora bem

Nota: tRNA microarrays manualmente são impressos com quarenta e dois 70-mer oligonucleotídeos de DNA complementares à extremidade 3' de cada tRNA M. smegmatis (terminal CCA excluído) usando um arrayer de oito pinos. As sequências de DNA do oligonucleotide sondas, bem como o layout de sonda na placa de bem e a matriz são fornecidas (arquivo complementar 1 - folha 1 a 3 respectivamente).

1. Projeto DNA sondas por primeiro recuperando sequências de tRNA ou tRNA codificação genes de tRNA bancos de dados como o tRNA Genomic Database¹³. Guarnição conservada 3' extremidade CCA se codificado. Complemento de inverter a sequência resultante. Sonda de ordem com base nos primeiros 70 nucleotídeos.
2. Resuspenda sondas de DNA secas na água. Ajuste a concentração de sondas de 100 µM. Em uma placa-96, preparar 120 µ l de 50 µM oligos em 3 X SSC, 0,01% (p/v) SDS final (diluir 60 µ l de estoque sondas poço individuais com 60 µ l de 6 X SSC, 0,01% (p/v) SDS.
3. Cubra o prato com papel alumínio para evitar evaporação ou contaminação, congelar imediatamente e manter a-20 ° C até ser necessário.

4. impressão matriz

1. Descongele a placa de 96 poços à temperatura ambiente (leva cerca de 20 min).
2. Lâminas de vidro de rótulo amina-revestido com uma caneta de diamante. Coloque slides em unidade de indexação. Siga as colocações de grade e proceda como a seguir.
   1. Mergulhe cuidadosamente os pinos replicator em poços.
   2. Delicadamente, imprima a matriz nas corrediças de vidro, usando a pressão mínima (você vai sentir uma pequena resistência). Continuar a impressão sem limpeza a arrayer até terminar com o bloco A.
3. Quando estiver pronto para avançar para o próximo bloco, siga o procedimento de lavagem descrito abaixo.
   1. Mergulhe o replicador em lixívia a 5% e agite suavemente.
   2. Replicador de imprensa em papel absorvente.
   3. Mergulhe replicator na água destilada, agitar suavemente e pressione no papel. Repita este passo uma vez.
   4. Mergulhe o replicador em isopropanol, agite e pressione o papel.
   5. Secar o replicador no ventilador por cerca de 20 s antes de passar para o próximo bloco da placa de 96 poços. Continue para o número desejado de cópias.
4. Permitir que os slides secar em seguida crosslink o oligos para o slide usando um agente reticulante UV de 254 nm.
   1. Defina o nível de energia a 999.990 µ j/cm².
   2. Colocar o rosto de slides sobre uma superfície limpa no crosslinker. Pressione "start".
5. Bloquear as matrizes durante a noite em 450 mL de solução em um agitador magnético, à temperatura ambiente e sob agitação lenta de bloqueio. Recolher e reutilizar a solução bloqueio até quatro vezes.
   Nota: A receita para a solução de bloqueio é: 125 mM de tampão de fosfato (NaH₂PO₄/num₂HPO₄-) pH 7,2, SDS de 2,25% (p/v), 0,5 mM EDTA, 0,5 X SSC, BSA 1% (p/v).
6. Lave as lâminas 2 vezes durante 5 min à temperatura ambiente em 500 mL de água destilada. Secar as lâminas por centrifugação para 10 s à temperatura ambiente em uma centrífuga de microarray. Matrizes de loja em um lugar seco e escuro por até 6 meses.

5. hibridização de matriz

1. Antes da hibridização enxague slides em água fervente e seque por centrifugação (como em 4.6).
2. Matriz de lugar dentro de uma gaveta de hibridização e carga radiolabeled amostra de RNA.
3. Execute estação de hibridação-lavagem automatizada para máxima reprodutibilidade.
   1. Como seguindo as etapas do programa. Gaxetas de condição por 2 min a 75 ° C. Introduzir a sonda a 60 ° C.
      Desnaturar sondas e amostras de 5 min a 90 ° C. Cruzar as amostras por 3 h a 60 ° C.
      1. Lave os slides a 50 ° C, duas vezes com 2 X SSC, 0,1% (p/v) SDS, fluxo 10 s e mantenha 20 s. lavagem slides a 42 ° C, duas vezes com 0.1 X SSC, 0,1% SDS, fluxo 10 s e segurar 20 slides de lavagem s. a 42 ° C, duas vezes com 0,1 X SSC , fluxo 10 s e espera 20 s.
4. Slides secas por centrifugação (como em 4.6).

6. quantificação de matriz

1. Enrole os slides usando uma fina película de plástico. Verifique slides para sinal radioativo, usando um contador Geiger na sua configuração mais sensível. Expor slides em uma tela de fósforo de armazenamento em uma gaveta de exposição à temperatura de 10 a 90 h dependendo da intensidade do sinal.
   Nota: Como a sensibilidade dos contadores Geiger variam de um instrumento para outro, tempos de exposição devem ser otimizados empiricamente.
2. Digitalize slides em 50 µm resolução usando um phosphorimager. Quantificar e fundo-subtrair intensidades de radioatividade em cada ponto de sonda usando o software Image J livre atualizado com um gerador de perfil de microarray.
3. Organizar e processar os dados utilizando uma planilha eletrônica. Gere mapas de calor usando a ferramenta de formatação condicional. Representa por exemplo cada sinal da sonda como uma fração (expressada em ‰) do sinal de sonda total.

Três biológica independente Replica mostram que, sob as condições de crescimento testadas, todos os tRNAs M. smegmatis exprimem-se acima do nível do plano de fundo (Figura 1). Nesta experiência particular, o desvio padrão observado para cada sonda está compreendido entre 2% (Arg (TCT)) e 22% (Cys (GCA)), com uma mediana de 5% (Figura 1). Falsas mudanças entre repetições são significativamente influenciadas por fatores como preparação da matriz e hibridação. Alta reprodutibilidade é conseguida com impressão de matriz de cuidadoso e consistente, bem como automatizado da hibridação de amostra. Há uma 5-fold diferença entre tRNA Ile (GAT) e tRNA (Val (TAC), a mais alta e mais baixa abundante espécie respectivamente. Ponto mostra que a expressão do tRNA isoacceptors não é uniforme. Isoacceptors são espécies que mantenha o mesmo aminoácido mas exibir sequências anticodão diferentes e, portanto, decodificar diferentes códons sobre mRNAs. Por exemplo, todos os isoacceptors de alanina são expressos em níveis semelhantes, Considerando que a arginina maior e menor, aceitando os tRNAs diferem por 3 vezes.

Figura 1: resultados de tRNA representativo macroarranjo. (A) digitalizados bacteriano, mouse e macroarrays humano. Matrizes de M. smegmatis usam apenas 43 sondas em vez de 48 para rato e humanos. Como consequência, a matriz bacteriana exibe 40 pontos vazios (sondas são replicadas oito vezes em cada matriz) que se misturam com o fundo. A maioria deles é agrupada no canto superior esquerdo. (B) histograma e heatmap representações de perfis de tRNA em M. smegmatis sob condições de crescimento ideal. Sinais de sonda são a média de três experimentos independentes (incluindo o crescimento bacteriano, rotulagem metabólicos, hibridação de extração e matriz) e são expressos como por mil valores de tRNAs total. Desvios-padrão para as três repetições são indicados como barras de erro e tons de laranja no histograma e heatmap, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Não há conflito de interesse declarado.