Quantificação de auxina endógena e citocinina durante Internode cultura de ipeca

Resumo

Brotos adventícios podem ser induzidos em segmentos internodal de ipeca sem tratamento phytohormone. Para avaliar a dinâmica phytohormone durante formação de tiro acidental, medimos endógena auxina e citocinina em segmentos internodal por LC-MS/MS.

Resumo

Formação de tiro acidental é uma técnica importante para a propagação de culturas economicamente importantes e a regeneração de plantas transgênicas. Tratamento de phytohormone é necessário para a indução de brotos adventícios na maioria das espécies. Se os brotos adventícios podem ser induzidos é determinado pelo saldo entre a auxina e citocinina (CK) níveis. Muito esforço vai para determinar concentrações óptimas e combinações de fitohormônios em cada tecido usado como explantes e em cada espécie de planta. Em ipecac, no entanto, brotos adventícios podem ser induzidos em segmentos internodal em meio de cultura sem tratamento phytohormone. Isso permite que a plasticidade inerente de ipeca para diferenciação de célula a ser avaliada. Para induzir os brotos adventícios em ipecac, nós cultivadas internodal segmentos a 24 ° C sob 15 µmol m^{− 2} s^{− 1} de luz em um ciclo escuro da luz/10-h 14-h phytohormone livre B5 meio solidificado com 0,2% gelano por 5 semanas. Para investigar a dinâmica phytohormone durante formação de tiro acidental, medimos endógeno ácido indol-3-acético e CKs nos segmentos por líquido espectrometria de massa em tandem-cromatografia de LC-MS/MS. Este método permite a análise de ácido indol-3-acético endógeno e CKs níveis de forma simples. Pode ser aplicado para investigar a dinâmica de auxina endógena e CK durante a organogênese em outras espécies de plantas.

Introdução

Gottlieb Haberlandt (1854-1945) propôs o conceito de "totipotência", pela qual planta células podem dividir, diferenciar e regenerar plantas inteiras mesmo após sua prévia diferenciação em tipos de células específicas em plantas maduras¹. Em cultura de tecidos, se planta regeneração pode ser induzida ou não é determinada pela combinação e concentração de fitohormônios exogenamente aplicadas no meio de crescimento. Skoog e Miller encontraram que brotos adventícios poderiam ser induzidos de tabaco calo no meio de cultura contendo uma alta proporção de CKs de auxinas, Considerando que raízes adventícias poderiam ser induzidas em meio contendo uma baixa relação². Desde essa constatação, cultura de tecidos foi amplamente utilizada para a propagação de culturas economicamente importantes e a regeneração de plantas transgénicas³. Brotos adventícios podem ser induzidos a partir de tecidos que não sejam o meristema apical de tiro, como folhas, raízes e entrenós. Tratamento de phytohormone é necessário para a indução de brotos adventícios na maioria das espécies de plantas. No entanto, o ideais concentrações e combinações diferem por espécie e entre tecidos utilizados como explantes. Assim, muito esforço vai para determinação da concentração ideal e combinações de fitohormônios para experimentos.

Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (ipecacuanha) é uma planta medicinal que contém alcaloides como Emetina e a Cefalina, principalmente no raízes⁴. Extratos de raiz são usados como um expectorante, um emético e um amoebicide⁵. Embora ipecac cresce naturalmente nas florestas tropicais do Brasil, é relutante em conjunto de sementes na cultura, e a taxa de germinação diminui durante o armazenamento de sementes no Japão, com seus de clima mais frio⁶. Em vez disso, ele é propagado por cultura de tecidos, no qual adventícios atirar formação em entrenós é o mais eficiente método de^7,8. Curiosamente, os brotos adventícios podem ser induzidos nesta espécie sem phytohormone tratamento⁸.

Brotos adventícios são formados na epiderme na região apical dos segmentos internodal sem callusing, mas não na região basal⁹. Esta diferença indica a polaridade do tecido em segmentos internodal, que é, provavelmente, ao abrigo do Regulamento fitohormonal. O sistema de cultura de ipecac permite uma oportunidade única para analisar as alterações nos níveis endógenos phytohormone durante formação de tiro acidental. Aqui apresentamos nosso método para a análise dos níveis endógenos de uma auxina (ácido indol-3-acético (IAA)) e quatro CKs (isopentenilo adenina (iP), Ribosídica de adenina de isopentenilo (iPR), trans-Zeatina (tZ) e trans-Zeatina Ribosídica (tZR)) em segmentos internodal através do uso de LC-MS/MS.

Protocolo

Nota: Poaia (ipecacuanha c.) foi usada neste estudo porque facilita a análise de fitohormônios endógenas.

1. crescimento condições para induzir brotos adventícios de ipeca

1. Prepare phytohormone livre B5 médio ajustado ao pH 5.7¹⁰e adicionar gelano 0,2%. Esterilize em autoclave.
2. Despeje uma placa de Petri estéril (90 mm × 20 mm), 25 mL do meio de autoclave.
3. Corte-8mm internodal segmentos de plântulas de ipecac, usando um bisturi cirúrgico com uma lâmina n º 22, em uma placa de acrílico estéril e coloque no meio (Figura 1).
4. Cultura livre phytohormone B5 meio a 24 ° C sob 15 µmol m^{− 2} s^{− 1} de luz em um ciclo escuro da luz/10-h 14-h por 5 semanas.
5. Identificar regiões eu (apical) a IV (basal) em cada segmento (Figura 1B). Conte o número de brotos adventícios > 0,3 mm de comprimento em cada região sob um microscópio, uma vez por semana.

2. extração e purificação de fitohormônios

1. Coloque uma pérola zircônia 5 mm em cada um dos quatro tubos 2 mL de amostra.
2. Corte os segmentos em regiões I a IV (cada 2 mm em comprimento) usando um bisturi cirúrgico em uma placa de acrílico estéril.
3. Colete oito segmentos de cada região em tubos de amostra separada (peso fresco de 10 a 30 mg).
4. Pesar e em seguida, congelar as amostras em nitrogênio líquido.
5. Esmaga as amostras congeladas, usando um homogeneizador de grânulo-baseado.
6. Suspender as amostras esmagadas em 1 mL acetonitrila contendo 500 pg de cada padrão interno de auxina e CKs (d₅-IAA, d₅- tZ, d₅- tZR, d₆- iP, d₆- iPR) usando um misturador do vortex.
7. Mantenha a 4 ° C, durante 1 h e, em seguida, centrifugar a 3.500 × g por 5 min à temperatura ambiente.
8. Lave o pellet em acetonitrila 80% (v/v) contendo ácido acético a 1% (v/v). Centrifugar novamente 3.500 × g por 5 min à temperatura ambiente. Combine os sobrenadantes (a partir de etapas 2.7 e 2.8) em um tubo de vidro descartáveis.
9. Adicione 600 µ l contendo ácido acético de 1% (v/v) para cada sobrenadante combinada de água e evaporar o acetonitrilo usando um concentrador a vácuo.
10. Equilibrar o hidrófilo lipofílico-balanceamento de cartuchos de coluna (HLB) aplicando-se 1 mL de água contendo 1% (v/v) de ácido acético, metanol e acetonitrila.
11. Aplica uma solução de amostra por cartucho HLB equilibrado.
12. Lave os cartuchos com 1 mL de água contendo ácido acético a 1% (v/v).
13. Eluir todos hormônios com acetonitrilo de 80% (v/v) de 2 mL contendo ácido acético a 1% (v/v) em um tubo de vidro.
14. Evapore o acetonitrilo no eluato para obter o extrato em água contendo 1% (v/v) de ácido acético usando um concentrador a vácuo.
    Nota: Não seque isto completamente.
15. Equilibrar os cartuchos de coluna de modo misto, forte permutadora de catiões (MCX) aplicando-se 1 mL acetonitrilo, 1 mL de metanol, 0,5 mL 0,1 M de HCl e 1 mL de água contendo ácido acético a 1% (v/v).
16. Aplica uma solução de amostra por cartucho MCX equilibrado.
17. Lave os cartuchos com 1 mL de água contendo ácido acético a 1% (v/v).
18. Eluir IAA com acetonitrilo de 30% (v/v) de 2 mL contendo ácido acético a 1% (v/v) em um tubo de vidro.
19. Lave os cartuchos com acetonitrilo de 80% (v/v) de 2 mL contendo 1% (v/v) de ácido acético.
20. Lave os cartuchos com 2 mL de água e 1 mL de água contendo amônia aquosa de 5%.
21. Eluir os CKs com acetonitrilo de 60% (v/v) de 2 mL contendo 5% de amônia aquosa em um tubo de vidro.
22. Evaporar o solvente de cada fração do hormônio usando um concentrador a vácuo e armazenar a 30 ° C até a análise de LC-MS/MS.

3. a LC-MS/MS análise de IAA e CKs

1. Dissolver cada extracto de hormônio em um tubo com 600 µ l de metanol e transferir a solução para um frasco de recuperação total do pescoço de parafuso. Evapore o solvente usando um concentrador a vácuo.
2. Dissolva a fração de IAA em 20 µ l de 30% (v/v) acetonitrila e as frações CK em água de 20 µ l contendo ácido acético a 1% (v/v) em frascos de recuperação total de pescoço de parafuso.
3. Analise as amostras no modo de íon positivo em um sistema de MS triplo quadrupolo equipado com um sistema HPLC.
   Nota: Podemos definir as condições HPLC conforme listado na tabela 1.
   1. Para a eluição do IAA, use um gradiente binário de 5% - 50% solvente B mais 7 min, em seguida, aumentar por 98% de solvente B Aguarde 1 min e então equilibrar por 2 min em 5% solvente B por injeção de ninho.
   2. Para a eluição de CK, use um gradiente binário de 2% - 40% de solvente B mais 5 min, 40% - 70% de solvente B em 7 min, em seguida, aumentar em 95% solvente B Aguarde 1 min e então equilibrar por 2 min em 2% solvente B por ninho de injeção.
   3. Definir a ionização electrospray (ESI)-MS parâmetros da fonte de íons, conforme listado na tabela 2.
4. Use a reação múltiplo monitoramento transição (MRM) para quantificação de cada analito listado na tabela 3.
5. Quantificar os níveis endógenos de IAA e CK contra uma curva-padrão do rácio de sem rótulo para padrões de deutério-rotulado.

Resultados

Em 1 semana^st , sem brotos adventícios tinham formado. Na semana de 2^nd , pequenos brotos apareceram. O 3^rd e 4 semanas de^th , o número de tiros aumento principalmente nas regiões apicais (I e II)(Figura 2). Na semana de 5^th , o número de brotos foi aproximadamente 7 em região eu e 5 na região II (Figura 2B). Em contraste, apenas alguns tiros...

Discussão

Para identificar a distribuição dos fitohormônios envolvidos na organogênese, é importante o uso de materiais vegetais em que organogênese pode ser observado na média phytohormone-livre, porque quando os fitohormônios são exogenamente aplicados a explantes para induzir brotos ou raízes, elas afetam o explante todo, tornando-se difícil avaliar a plasticidade inerente de plantas na diferenciação celular e organogênese. Brotos adventícios podem ser induzidos em meios de cultura livre phytohormone em outras espécies de plant...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
[2H5]ácido indol-3-acético	Olchemlm Ltd	031 1531	Padrão interno para LC-MS/MS
[2H5]trans-zeatina	Olchemlm Ltd	030 0301	Padrão interno para LC-MS/MS
[2H5]trans-zeatina ribosídeo	Olchemlm Ltd	030 0311	Padrão interno para LC-MS/MS
[2H6]N6-isopentenil adenina	Olchemlm Ltd	030 0161	Padrão interno para LC-MS/MS
[2H6]N6-isopentenil adenosina	Olchemlm Ltd	030 0171	Padrão interno para ácido indol-3-acético LC-MS/MS
	Wako	098 00181	padrão para LC-MS/
MS trans-zeatina	SIGMA-ALDRICH	Z0876 5MG	padrão para LC-MS/
MS trans-zeatina ribosídeo	Wako	262 01081	padrão para LC-MS/MS
N6-isopentenil adenina	SIGMA-ALDRICH	D7674 1G	padrão para LC-MS/MS
N6-isopentenil adenosina	ACROS ORGANICS	22648 1000	padrão para LC-MS/MS
acetonitrila hipergrade para LC-MS LiChrosolv	MERCK	1.00029.1000	solvente para LC-MS/MS
Água para cromatografia LiChrosolv	MERCK	1.15333.1000	solvente para LC-MS/MS
HPLC	SHIMADZU	Proeminência
MS	Sciex	3200QTRAP
Oasis HLB 30 mg/1 cc	Coluna	de cartucho de WAT094225
Oasis MCX 30 mg/1 cc	Frasco	gargalo de rosca da coluna de cartucho	de 186000252
	Waters	186002805
azul, tampa de pescoço de rosca de 12 x 32 mm e septo de PTFE/silicone	Waters
Acquity UPLC BEH C18, 2,1x100 mm	Coluna Waters	186002350	UPLC
Proshell 120 EC-C18, 2,1x50 mm	Agilent	699775-902	Coluna UPLC
Microscópio digital	Leica	DHS1000
TissueLyser II	QIAGEN	85300
Lâmina cirúrgica	Feather	No. 22
Cabo de bisturi	Feather	No. 4
Savant SpeedVac/Armadilha de vapor refregenada	Thermo Fisher Scientific	SPD111/RVT4104	concentrador de vácuo
Tobe de vidro descartável (13x100 mm)	IWAKI	9832-1310
Placa de Petri estéril	INA OPTICA	I-90-20