Brotos adventícios podem ser induzidos em segmentos internodal de ipeca sem tratamento phytohormone. Para avaliar a dinâmica phytohormone durante formação de tiro acidental, medimos endógena auxina e citocinina em segmentos internodal por LC-MS/MS.
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Artigo de método
Quantificação de auxina endógena e citocinina durante Internode cultura de ipeca
Neste artigo
Resumo
Resumo
Formação de tiro acidental é uma técnica importante para a propagação de culturas economicamente importantes e a regeneração de plantas transgênicas. Tratamento de phytohormone é necessário para a indução de brotos adventícios na maioria das espécies. Se os brotos adventícios podem ser induzidos é determinado pelo saldo entre a auxina e citocinina (CK) níveis. Muito esforço vai para determinar concentrações óptimas e combinações de fitohormônios em cada tecido usado como explantes e em cada espécie de planta. Em ipecac, no entanto, brotos adventícios podem ser induzidos em segmentos internodal em meio de cultura sem tratamento phytohormone. Isso permite que a plasticidade inerente de ipeca para diferenciação de célula a ser avaliada. Para induzir os brotos adventícios em ipecac, nós cultivadas internodal segmentos a 24 ° C sob 15 µmol m− 2 s− 1 de luz em um ciclo escuro da luz/10-h 14-h phytohormone livre B5 meio solidificado com 0,2% gelano por 5 semanas. Para investigar a dinâmica phytohormone durante formação de tiro acidental, medimos endógeno ácido indol-3-acético e CKs nos segmentos por líquido espectrometria de massa em tandem-cromatografia de LC-MS/MS. Este método permite a análise de ácido indol-3-acético endógeno e CKs níveis de forma simples. Pode ser aplicado para investigar a dinâmica de auxina endógena e CK durante a organogênese em outras espécies de plantas.
Introdução
Gottlieb Haberlandt (1854-1945) propôs o conceito de "totipotência", pela qual planta células podem dividir, diferenciar e regenerar plantas inteiras mesmo após sua prévia diferenciação em tipos de células específicas em plantas maduras1. Em cultura de tecidos, se planta regeneração pode ser induzida ou não é determinada pela combinação e concentração de fitohormônios exogenamente aplicadas no meio de crescimento. Skoog e Miller encontraram que brotos adventícios poderiam ser induzidos de tabaco calo no meio de cultura contendo uma alta proporção de CKs de auxinas, Considerando que raízes adventícias poderiam ser induzidas em meio contendo uma ....
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Protocolo
Nota: Poaia (ipecacuanha c.) foi usada neste estudo porque facilita a análise de fitohormônios endógenas.
1. crescimento condições para induzir brotos adventícios de ipeca
- Prepare phytohormone livre B5 médio ajustado ao pH 5.710e adicionar gelano 0,2%. Esterilize em autoclave.
- Despeje uma placa de Petri estéril (90 mm × 20 mm), 25 mL do meio de autoclave.
- Corte-8mm internodal segmentos de plântulas de ipecac, usando um bisturi cirúrgico com uma lâmina n º 22, em uma placa de acrílico estéril e coloque no meio (Figura 1).
- Cultura livre phyt....
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Resultados
Em 1 semanast , sem brotos adventícios tinham formado. Na semana de 2nd , pequenos brotos apareceram. O 3rd e 4 semanas deth , o número de tiros aumento principalmente nas regiões apicais (I e II)(Figura 2). Na semana de 5th , o número de brotos foi aproximadamente 7 em região eu e 5 na região II (Figura 2B). Em contraste, apenas alguns tiros.......
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Discussão
Para identificar a distribuição dos fitohormônios envolvidos na organogênese, é importante o uso de materiais vegetais em que organogênese pode ser observado na média phytohormone-livre, porque quando os fitohormônios são exogenamente aplicados a explantes para induzir brotos ou raízes, elas afetam o explante todo, tornando-se difícil avaliar a plasticidade inerente de plantas na diferenciação celular e organogênese. Brotos adventícios podem ser induzidos em meios de cultura livre phytohormone em outras espécies de plant.......
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Divulgações
Os autores declaram que têm não há conflitos de interesse.
Agradecimentos
Nós estamos gratos ao Sr. Akira Murakami do departamento de Biociências aplicadas, Universidade de Toyo e Sr. Koudai Taniguchi do centro de tecnologia agrícola de Gunma para sua assistência técnica. Nós também estamos gratos ao Professor Shosaku Kashiwada e Dr. Uma Maheswari Rajagopalan, Universidade Toyo para suas sugestões. Este estudo foi suportado em parte pelo centro de pesquisa para a vida e ciências ambientais, Universidade de Toyo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| [2H5]ácido indol-3-acético | Olchemlm Ltd | 031 1531 | Padrão interno para LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatina | Olchemlm Ltd | 030 0301 | Padrão interno para LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatina ribosídeo | Olchemlm Ltd | 030 0311 | Padrão interno para LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenil adenina | Olchemlm Ltd | 030 0161 | Padrão interno para LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenil adenosina | Olchemlm Ltd | 030 0171 | Padrão interno para ácido indol-3-acético LC-MS/MS |
| Wako | 098 00181 | padrão para LC-MS/ | |
| MS trans-zeatina | SIGMA-ALDRICH | Z0876 5MG | padrão para LC-MS/ |
| MS trans-zeatina ribosídeo | Wako | 262 01081 | padrão para LC-MS/MS |
| N6-isopentenil adenina | SIGMA-ALDRICH | D7674 1G | padrão para LC-MS/MS |
| N6-isopentenil adenosina | ACROS ORGANICS | 22648 1000 | padrão para LC-MS/MS |
| acetonitrila hipergrade para LC-MS LiChrosolv | MERCK | 1.00029.1000 | solvente para LC-MS/MS |
| Água para cromatografia LiChrosolv | MERCK | 1.15333.1000 | solvente para LC-MS/MS |
| HPLC | SHIMADZU | Proeminência | |
| MS | Sciex | 3200QTRAP | |
| Oasis HLB 30 mg/1 cc | Coluna | de cartucho de WAT094225 | |
| Oasis MCX 30 mg/1 cc | Frasco | gargalo de rosca da coluna de cartucho | de 186000252 |
| Waters | 186002805 | ||
| azul, tampa de pescoço de rosca de 12 x 32 mm e septo de PTFE/silicone | Waters | ||
| Acquity UPLC BEH C18, 2,1x100 mm | Coluna Waters | 186002350 | UPLC |
| Proshell 120 EC-C18, 2,1x50 mm | Agilent | 699775-902 | Coluna UPLC |
| Microscópio digital | Leica | DHS1000 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Lâmina cirúrgica | Feather | No. 22 | |
| Cabo de bisturi | Feather | No. 4 | |
| Savant SpeedVac/Armadilha de vapor refregenada | Thermo Fisher Scientific | SPD111/RVT4104 | concentrador de vácuo |
| Tobe de vidro descartável (13x100 mm) | IWAKI | 9832-1310 | |
| Placa de Petri estéril | INA OPTICA | I-90-20 |
Referências
- Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).
- Skoog, F., Miller, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).
- Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N. Transgenic plants and crops
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Reimpressões e permissões
