Monitoramento de transmissão de celular para celular da proteína príon como agregados em Drosophila Melanogaster.

Resumo

Acumular evidências suporta a ideia que agregados de proteínas patogênicas associam com doenças neurodegenerativas espalhados entre as células com o prião-como propriedades. Aqui, descrevemos um método que permite a visualização de propagação de célula para célula de príon como agregados no organismo modelo, Drosophila melanogaster.

Resumo

A agregação da proteína é uma característica central da maioria das doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer (AD), a doença de Parkinson (PD), a doença de Huntington (HD) e esclerose lateral amiotrófica (ela). Agregados de proteína estão intimamente associados com neuropatologia destas doenças, embora o mecanismo exato pelo qual a agregação da proteína aberrante interrompe a homeostase celular normal não é conhecido. Emergentes dados fornecer forte apoio para a hipótese que agregados patogénicos em AD, PD, HD, e ALS tem muitas semelhanças com os prions, que são somente proteína agentes infecciosos responsáveis para as encefalopatias espongiformes transmissíveis. Priões auto replicam por modelagem a conversão das versões nativamente-dobrado da mesma proteína, causando a propagação do fenótipo agregação. Como príons e proteínas de príon, como no anúncio, PD, HD e ALS mover de uma célula para outra é atualmente uma área de intensa investigação. Aqui, um modelo de Drosophila melanogaster que permite o monitoramento da transmissão príon-like, célula a célula do mutant huntingtin (Htt) agregados associados com HD é descrito. Este modelo aproveita-se de poderosas ferramentas para manipular a expressão do transgene em muitos tecidos diferentes da drosófila e utiliza uma proteína citoplasmática marcados fluorescentemente diretamente transferência de prião, como relatório de mutante Htt agregados. Importante, a abordagem que descrevemos aqui pode ser usada para identificar novos genes e vias que medeiam o espalhamento de agregados de proteínas entre célula diversos tipos em vivo. Informações obtidas a partir desses estudos irão expandir a compreensão limitada dos mecanismos patogénicos que fundamentam a doenças neurodegenerativas e revelar novas possibilidades de intervenção terapêutica.

Introdução

A hipótese do príon afirma que o agente infeccioso responsável para as encefalopatias espongiformes transmissíveis (por exemplo, doença de Creutzfeldt - Jakob nos seres humanos, o tremor epizoótico dos ovinos, doença desperdiçando crônica em cervos e alces e "doença da vaca louca" em bovinos ) é unicamente composto de proteína e desprovidos de ácidos nucleicos¹. Em doenças de príon, a proteína príon celular (PrP^C) pressupõe uma dobra não-nativas, estável (PrP^Sc) que é altamente beta folha-rico e pode propagar self convertendo e recrutamento monomérico PrP^C moléculas em amiloide estável agregados. PrP

Protocolo

1. acoplamento Gal4 e QF-mediada Htt Transgene expressão em Drosophila

1. Coletar e/ou gerar transgénicos Drosophila melanogaster linhas contendo tecido-específica Gal4 ou QF "drivers", bem como as linhas que contêm o selvagem-tipo ou mutant Htt transgenes a jusante da Gal4-UAS³⁸ ou QF-QUAS³⁹. Certifique-se de que as proteínas que são expressas de transgenes estes são fundidos para proteínas fluorescentes ou epítopo-Tags para permitir a diferenciação dos mutantes e selvagem-tipo Htt transgene produtos na mosca da mesma. Veja a Figura 1.
   Nota: Normalmente usamos fr....

Resultados

Os métodos descritos aqui produzem dados robustos, demonstrando o prião, como transferência de agregados de proteína de Htt da população de uma célula para outra na mosca da intacta CNS. Conversão de tipo selvagem Htt de difusa para punctate é observado por fluorescência direta desta proteína de fusão YFP na glia destinatário como resultado da expressão de HttQ91-mCherry em ORNs doador (Figura 2A C e a Figura 4

Discussão

Como o número de pacientes que sofrem de doenças neurodegenerativas continua a aumentar, há uma necessidade urgente de aumentar a compreensão da patogênese molecular dessas doenças para que melhor terapias podem ser desenvolvidas. Aqui, descrevemos os métodos que permitem a monitorização do prião, como transmissão de agregados de proteínas patogênicas entre diferentes tipos de células no organismo modelo, Drosophila melanogaster. Recentemente usamos esta metodologia para demonstrar prião, como transmissão de mut.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução salina tamponada com fosfato (PBS), 10X, pH 7.4	ThermoFisher Scientific	AM9625	Diluir para 1X
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-1L
Kimwipes	Thomas Scientific	2904F24
20% paraformaldeído (PFA)	Microscopia Eletrônica Sciences	15713-S
Soro de Cabra Normal (NGS), filtrado	Lampire Biological Laboratories	7332500	Alíquota e congelamento após o recebimento
Frango anti-GFP	Aves Labs	GFP-1020	Use na diluição de 1:500
Coelho anti-DsRed	Clontech	632496	Use na diluição de 1:2000; pode reconhecer proteínas fluorescentes à base de DsRed (por exemplo, mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.)
Estudos de desenvolvimento anti-Bruchpilot de camundongo	Hybridoma Bank	nc82	Use na diluição de 1:100; rotulará estruturas pré-sinápticas ativas em todo o cérebro da mosca
FITC anti-frango	ThermoFisher Scientific	SA1-7200	Use na diluição de 1:250
Alexa Fluor 568 anti-coelho	Life Technologies	A11011	Use na diluição de 1:250
Alexa Fluor 647 anticorpo anti-camundongo	Life Tecnologias	A21235	Uso em diluição de 1:250
Reagente Antifade Gold Life	Technologies	S36936
(25 x 75 x 1.0 mm)	Fisher Scientific	12-550-143
Vidro de Cobertura (22 x 22 mm)	Pinça	Scientific 1404-15
, Estilo 3	Ted Pella	503	uso em mão não dominante
Fórceps Dumont Biology Grade, Estilo 5	Ted Pella	505	uso na mão dominante
Software de análise de imagem LAS X
Imaris	Bitplane

Lâminas de Microscópio de Grau de Biologia Dumont Globe Software de análise de imagem Leica