Utilizando um sistema de enriquecimento de imunoprecipitação abrangente para identificar um perfil endógena modificação pós-traducional de proteínas alvo

Resumo

Investigando várias, modificações borne-translational endógenas para uma proteína do alvo podem ser extremamente desafiadoras. Técnicas descritas aqui utilizam um sistema de buffer e filtro de Lise otimizado desenvolvido com PTM-direcionamento específico, matrizes de afinidade para detectar as modificações fosforilação acetilação, ubiquitination, SUMOylation 2/3 e tirosina para um destino proteína, usando um sistema único e simplificado.

Resumo

Agora é bem apreciada que modificações borne-translational (PTMs) desempenham um papel fundamental na regulação da proteína, uma estrutura e função, que pode ser essencial para o papel de uma determinada proteína fisiologicamente e patologicamente. Enriquecimento de PTMs é muitas vezes necessário, ao investigar o status PTM de uma proteína do alvo, porque PTMs são muitas vezes transitórios e relativamente baixa em abundância. Muitas armadilhas são encontradas quando enriquecedor para um PTM de uma proteína do alvo, como incompatibilidade de reserva, o anticorpo da proteína alvo não é compatível com IP, perda de sinal do PTM e outros. O grau de dificuldade é ampliado quando investigando várias PTMs como fosforilação acetilação, ubiquitination, SUMOylation 2/3 e tirosina por uma proteína do alvo determinado. Estudar uma combinação destes PTMs pode ser necessária, como crosstalk entre PTMs é prevalente e crítico para regulação de proteínas. Muitas vezes, estes PTMs são estudados nos buffers de Lise diferentes e com composições originais inibidor. Para simplificar o processo, único desnaturação Lise foi desenvolvido um sistema que efetivamente isola e preserva essas quatro PTMs; permitindo assim, a investigação do potencial crosstalk em um sistema único de Lise. Um sistema de filtro único foi projetado para remover contaminantes de DNA genômico do lisado, que é um subproduto problemático da desnaturação de buffers de. Matrizes de afinidade robusto alvejando cada uma as quatro PTMs foram desenvolvidas em conjunto com o sistema de tampão para maximizar o enriquecimento e a detecção de Estados endógenas destes quatro PTMs. Esta abrangente conjunto de ferramentas de deteção de PTM simplifica o processo de obtenção de informação crítica sobre se uma proteína é modificada por um ou mais destes PTMs.

Introdução

Modificações borne-translational (PTMs) são altamente regulamentadas alterações a uma proteína, através do qual a modificação é adicionada ou removida de uma maneira específica. PTMs são muitas vezes transitórias e dinâmicas, mudanças que alteram significativamente a estrutura da proteína, interações com proteínas do parceiro e localização espacial e, finalmente, permitindo que a proteína executar funções distintas^{1,2 , 3 , 4}. PTMs são tão abundantes que aumentam o número de formas de proteína única (ou proteoforms) de cerca de 30.000 produtos de genes para mais 1 milhão de proteoforms^5,6. Identificando PTMs e definindo seu efeito sobre uma proteína alvo são fundamental para a compreensão funções fisiológicas e patológicas^{7,8,9,10, da proteína 11,12,13,14}. Trabalho sobre proteínas selecionadas como receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), p53 e tubulina tem elucidado as funções reguladoras de PTMs^15,16,17. Estes estudos revelaram o fato de que o Regulamento destas proteínas ocorre por PTMs múltiplas, e em muitos casos, essas modificações trabalham em conjunto para promover uma função específica. Novos estudos têm mostrado que essa interferência PTM cooperativa e negativa pode ocorrer em várias proteínas diferentes^{18,19,20,21,22, 23,24,25}. No entanto, os perfis PTM da maioria das proteínas são construídos de vários estudos que utilizaram diferentes modelos e condições únicas. Ter um sistema otimizado para investigar PTMs múltiplos em um único sistema, seria altamente benéfico para ganhar a introspecção em potencial interferência PTM para uma proteína do alvo.

Um desafio de investigar PTMs em um único sistema é que PTMs específicas são investigados usando amortecedores lise distintas. Por exemplo, a utilização de buffers como RIPA ou NP-40 que são comumente utilizados para fosforilação ou ubiquitination investigações pode ser inadequada para estudar um PTM lábil como pequenas ubiquitin-como modificador (SUMO) ylation²⁶. Além disso, não-desnaturação buffers são inadequadas para desassociar interações da proteína e podem levar a falso positivo PTM identificação²⁷. Investigar PTMs em um tampão de Lise a desnaturação pode ser preferido, pois é significativamente melhor em isolar proteínas de todos os compartimentos celulares²⁸, vou apartar a maioria das interações da proteína e vai inibir proteases que alteram Estados PTM, tais como deSUMOylases ²⁶; no entanto, desnaturação buffers pode comprometer a integridade dos reagentes específicos afinidade como ubiquitin vinculação ferramentas baseadas em domínio,²⁷. Desenvolvimento de um sistema de desnaturação, como Lise para estudar vários PTMs de uma proteína em um sistema compatível com o reagente de afinidade seria altamente benéfico para investigações de diafonia PTM.

Apesar de buffers de desnaturação têm vantagens chaves sobre buffers não-desnaturação para investigar PTMs, eles são menos comumente usados por causa de suas desvantagens significativas, tais como incompatibilidade com ensaios de proteína convencional, significativas genômica contaminação de Ácido desoxirribonucleico (DNA) e o rompimento de reagentes de imunoprecipitação (IP)²⁹. Estas desvantagens podem resultar em tempo de preparação estendida e potenciais danos às proteínas alvo quando corte de DNA genômico. Dois métodos comumente usados para cortar o DNA incluem seringa Lise e sonication²⁹. Ambos os métodos exigem otimização extensiva e muitas vezes faltam de reprodutibilidade precisa. Métodos alternativos para remover o DNA genômico incluem a adição de DNAses; no entanto, isso pode exigir otimização adicional e alterações na composição do tampão. Em última análise, um método simples e reprodutível para remover a contaminação de DNA genômica seria benéfico ao trabalhar com buffers de Lise para investigações de PTM de desnaturação.

O objetivo desta técnica é desenvolver um sistema para isolar e investigar ubiquitination (Ub), fosforilação da tirosina (pY), SUMOylation 2/3 (2/3 de SUMO) e PTMs de acetilação (Ac) em um único sistema para investigar melhor a diafonia PTM para uma proteína do alvo. Este sistema de deteção de PTM foi utilizado para investigar rapidamente o perfil PTM endógeno de várias proteínas de destino em um único sistema. Introspecção nova interferência potencial foi identificado^30,31. Em geral, a técnica descrita aqui melhora os métodos existentes para investigar PTMs e PTM conversa cruzada de três maneiras distintas: 1) um único buffer desnaturação foi desenvolvido que isola as proteínas de todos os compartimentos celulares, enquanto ainda está sendo compatível com Reagentes de afinidade PTM, 2) foi desenvolvido um sistema de filtro único que rapidamente remove a contaminação de DNA genômica de lysates desnaturado com alta reprodutibilidade e requer nenhum equipamento especializado e 3) a afinidade robusto grânulos, sistema de Lise e inibitórios os reagentes são compatíveis; simplificando assim, o isolamento destes quatro PTMs para uma proteína do alvo para maximizar a enriquecimento PTM e examinar com eficiência potencial interferência.

Protocolo

1. amostra preparação: Cultura de células

1. Cresce quatro placas de 150mm de células A431 no meio modificado águia de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino.
   1. Crescem as células A431 a confluência de 50%.
   2. Soro restringir as quatro placas de células A431 com DMEM isento de soro por 24 h.
   3. Trate de duas placas de células A431 com 33,3 mg/mL de fator de crescimento epidérmico para 1 h. deixe as outras duas placas não tratadas.
      Nota: As condições de crescimento e tratamento de célula mostradas aqui fornecem um exemplo; no entanto, esta metodologia é aplicável a muitos tipos de células diferentes e condições de tratamento.
2. Prepare blastR buffers Lise e diluição com inibidores (tabela 1). Aliam 2,895 mL de tampão de Lise blastR 15 µ l de inibidor da tirosina fosfatase, 30 µ l de deubiquitinase e inibidor de deSUMOylase, 30 µ l de inibidor de histona deacetilase (HDAC) e 30 µ l de coquetel de inibidor de protease.
   1. Combine 9,65 mL de tampão de diluição blastR com 50 µ l de inibidor da tirosina fosfatase, 100 µ l de deubiquitinase e inibidor de deSUMOylase, 100 µ l de inibidor de histona deacetilase (HDAC) e 100 µ l de coquetel de inibidor de protease.
      Nota: Consulte a Tabela de materiais para informações de composição e inibidor de buffer.
3. Deite fora os meios de cultura e colocar as células no gelo. Em seguida, lave as células duas vezes com 10 mL de 1x salina tamponada fosfato (PBS).
   1. Remova o PBS tanto quanto possível antes da adição de tampão de Lise blastR para maximizar a lise celular.
      Nota: Consulte a Tabela de materiais para composição do tampão.
4. Adicione 600 µ l de tampão de Lise blastR para cada placa de 150 mm. A quantidade de buffer é baseada no rendimento proteína esperada (tabela 2).
   1. Lise as células com uma espátula de célula. O lisado tornará viscoso devido à Lise nuclear.
5. Use uma ponta de pipeta de 1ml cortados para transferir o lisado petróleo bruto em um filtro de blastR que foi colocado em um tubo de coleta de 15 mL (Figura 1). Aqui, um tubo falcon de 15ml é usado.
6. Use um desentupidor de filtro fornecido completamente comprimir o filtro blastR e coletar o lisado por escoamento, incluindo quaisquer bolhas, em um tubo de 15 mL (Figura 1).
7. Opcional: Transferência esclareceu lisado para um tubo de 1,5 mL microcentrifuga e centrifugar o lisado a aproximadamente 10.000 x g por 1 min a 4 ° C.
   1. Transferi o sobrenadante para um novo tubo falcon de 15ml.
8. Diluir o esclareceu lisado com tampão de diluição blastR até um volume final de 3 mL por cada placa de 150 mm. O volume final é baseado no rendimento esperado proteína (tabela 2).
   Nota: Este passo é importante, como a composição do tampão final irá afectar o rigor de reação de IP.
9. Dose a concentração de proteína (secção 2).

2. ensaio de quantificação da proteína

Nota: Utilize um ensaio de quantificação de proteína colorimétrico padrão para determinar a quantificação da proteína. Aqui, quantificação da proteína é determinada usando o ensaio de vermelho da proteína avançada de precisão.

1. Adicione 1 mL do reagente de ensaio de vermelho proteína avançada de precisão para cada uma das duas cubetas de 1 mL.
2. Mix 10 µ l de tampão de Lise blastR e 40 µ l de tampão de diluição blastR em um tubo de microcentrifuga limpa 1,5 mL no gelo.
   Nota: Este será usado para a leitura da amostra de proteína em branco.
3. Adicione 20 µ l de tampão lise/diluição mistura (da etapa 2.2) para o primeiro cubeta e misture invertendo-se duas a três vezes.
4. Adicionar 20 µ l da célula diluída lisada (de experiência) para a segunda cubeta, misturar como acima.
5. Incube as amostras por 1 min à temperatura ambiente.
6. Espectrofotômetro em branco com a amostra de mistura de tampão de Lise/diluição (da etapa 2.3).
7. Medir a absorvância da amostra do lisado (de passo 2.4) em 600 nm.
8. Determinar a concentração de proteína lisado como segue;
   amostra de leitura OD₆₀₀ x 5 = concentração de proteínas em mg/mL
   Nota: Leituras de OD abaixo de 0,05 ou acima de 0,5 estão perto da capacidade de escala linear do ensaio da proteína. Para leituras > 0,5, as amostras podem ser diluídas. Para leituras < 0.05, mais lisado pode ser adicionado para o reagente de ensaio de vermelho proteína avançada de precisão (até 50 µ l). Consulte a tabela 3 para multiplicadores para converter leituras espectrofotômetro a concentração de proteína lisado mg/mL. Se houver proteína insuficiente em uma placa, é recomendável usar 2 ou mais placas por IP. Neste caso, placas irão ser colhidas em série, transferindo o original 300 μL de tampão de Lise entre placas.
9. Com base na concentração de proteína, diluir a amostra com uma mistura de tampão (1 parte blastR lise: 4 peças blastR diluição) a uma concentração final desejada (geralmente de 1 mg/mL).
10. Snap freeze alíquotas de amostras que não serão usadas imediatamente.
    1. Armazenar as amostras a-70 ° C.
    2. Prossiga para a secção 3.

3. imunoprecipitação (IP) ensaio

Nota: Afinidade concentrações do grânulo, lisadas concentrações e tempos de incubação são recomendados diretrizes e podem ser exclusivos para cada proteína do alvo e PTM específico a ser investigado.

1. Inverta o estoque tubos contendo grânulos de afinidade do Ub, grânulos de afinidade pY, grânulos de afinidade de 2/3 de SUMO e grânulos de afinidade Ac várias vezes para certificar-se que os grânulos são completamente resuspended no tubo.
2. Para cada ensaio IP, a suspensão da alíquota do grânulo em tubos de microcentrifuga separadas 1,5 mL no gelo (tubo IP). Aqui, adicione 20 µ l de grânulos de afinidade de ubiquitina, 30 µ l de grânulos de afinidade do phosphotyrosine, 40 µ l de grânulos de 2/3 afinidade SUMOylation ou 50 µ l de grânulos de acetilação afinidade para tubos de microcentrifuga individuais 1,5 mL no gelo.
   Nota: Consulte a tabela 4 para o volume recomendado de suspensão de grânulo para usar para cada grânulo de afinidade.
3. Inverta o estoque tubos contendo grânulos de controle IP ubiquitination e IgG controle contas várias vezes para certificar-se que os grânulos são completamente resuspended no tubo.
4. Contas de controle alíquota por reação de controle para determinar a ligação não-específica (tubo de controle IP). Aqui, adicione 20 µ l de grânulos de controle do Ub, 30 µ l de grânulos de controle pY, 40 µ l de grânulos de 2/3 controle de sumô ou 50 µ l de grânulos de controle Ac para tubos de microcentrifuga individuais 1,5 mL no gelo.
   Nota: Consulte a tabela 4 para o volume recomendado de suspensão de grânulo para usar para cada tipo de grânulo de afinidade.
5. Salve uma pequena quantidade de lisado (20 µ l) para ser executado como um western blot entrada controle lisado. Adicionar 5 µ l de tampão de amostra 5 x e ferva a 95 ° C por 5 min.
   Nota: Consulte a Tabela de materiais para composição do tampão.
6. Adicione o lisado para cada controle IP tubo e IP. Aqui, 1 mg de lisado foi usado por IP e controle de reação, resultando em um total de 8 reações de IP.
   Nota: recomenda-se 1,0 mg de lisado por ensaio como ponto de partida. A quantidade de lisado será necessário variar dependendo da abundância de proteína alvo modificados.
7. Incube os tubos em uma plataforma giratória completa sobre a 4 ° C por 2 h. Aqui, um rotador de tubo ATR foi usado em velocidade 22.
8. Coletar pérolas por centrifugação a 3.000-5.000 x g por 1 min a 4 ° C.
9. Aspire fora tanto sobrenadante possível sem perturbar os grânulos.
10. Lave os grânulos em 1ml blastR tampão de lavagem (inibidores não são necessários nesta fase) por 5 min em um 4 ° C plataforma de giro.
11. Coletar pérolas por centrifugação a 3.000-5.000 x g por 1 min a 4 ° C.
12. Aspire fora tanto sobrenadante possível sem perturbar os grânulos.
13. Repita a etapa de lavagem (etapas 3.10-3.12) mais duas vezes.
14. Após a lavagem final, remova completamente o sobrenadante de reserva. Mínimo de interrupção da pelota do grânulo é aceitável (até uma perda de 5%). Remover residual sobrenadante usando uma multa furo proteína ponta de carregamento.
15. Adicionar 30 µ l de tampão de eluição do grânulo e ressuspender os grânulos por suavemente tocando/passando rapidamente do lado do tubo. Não use uma pipeta nesta fase.
    Nota: Consulte a Tabela de materiais para composição do tampão.
16. Incube a temperatura ambiente por 5 min.
17. Gentilmente transferi cada suspensão do grânulo para uma coluna de rotação de microcentrifuga de 1,5 mL que foi colocada em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
    Nota: Recomenda-se cortar a extremidade da ponta da pipeta de transferência para transferência mais suave.
18. Centrifugar a 9.000-10.000 x g por 1 min à temperatura ambiente para coletar a amostra IP.
19. Adicionar 2 µ l de 2-Mercaptoetanol para cada amostra e misture bem.
    Nota: É conveniente tirar a tampa da coluna de rotação e usar isso para tampar o tubo de coleta para posterior processamento.
20. Colocar as amostras em um banho de água de 95 ° C por 5 min. coletar amostra por centrifugação a 10.000 x g por 1 min em RT
21. Se necessário, armazenar amostras a-70 ° C e parar aqui ou proceder à execução de SDS-PAGE, transferência e análise ocidental do borrão (secção 4).

4. Western Blot Analysis: Identificação da proteína de interesse

1. Amostras separadas por sódio Dodecil sulfato de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e transferir para uma membrana de polivinilideno fluoreto (PVDF), de acordo com protocolos de laboratório padrão³².
2. Use um anticorpo primário para detectar as versões modificadas post-translationally da proteína de interesse. Aqui, PD-L1 anticorpo foi usado para detectar PD-L1 post-translationally modificados.
3. Utilize o reagente de detecção de quimioluminescência ultra-sensível para a deteção.
   Nota: O reagente quimioluminescente deve ser usado em conjunto com um HRP-etiquetado anticorpo secundário capaz de detectar o anticorpo primário.
4. Use um volume de 2 mL de reagente quimioluminescente por membrana transferência gel minitamanho (aproximadamente 8 x 7 cm).
   1. Após a incubação com anticorpo secundário adequado (recomenda-se 60 min a RT), lavar o blot 6 x 10 min em 30 mL de tampão tris salino com tween-20 (TBST).
      Nota: Consulte a Tabela de materiais para composição do tampão.
   2. Imediatamente antes do uso, misture 1 mL de reagente quimioluminescente A com 1 mL de reagente quimioluminescente B (suficiente para a membrana de um 8 x 7 cm).
   3. Adicionar o reagente quimioluminescente de membrana e incubar com balanço suave no RT para 1-5 min antes da visualização do sinal de proteínas usando a película de raio x ou imagem de câmera de dispositivo de carga acoplada (CCD).
      Nota: Tempos de incubação mais curtos no reagente quimioluminescente podem ser necessários para proteínas altamente abundantes.

Resultados

A capacidade destas ferramentas para investigar a diafonia PTM detectando eficazmente estas 4 PTMs é em parte dependente do sistema de tampão de Lise exclusivo. O buffer de desnaturação blastR efetivamente isola as proteínas de todos os compartimentos celulares da mesma forma que outros buffers de desnaturação, que assegura um perfil de proteína completa (Figura 2A). Além disso, preserva sinais PTM altamente instáveis como SUMO 2/3, que é rapidamente diminuída nos buffers não-desnaturação como ensaio de radioimmunoprecipitation (RIPA) (Figura 2B). Importante, quando diluído adequadamente, não afeta a integridade dos reagentes afinidade como outros buffers de desnaturação (por exemplo, buffer de Laemmli).

Um obstáculo significativo ao trabalhar com buffers de desnaturação é a capacidade de remover eficazmente a contaminação de DNA genômica. A metodologia convencional para reduzir a viscosidade é o DNA de cisalhamento usando uma agulha de seringa ou sonicating a amostra. Figura 3A mostra contaminação de DNA genômica na célula A431 lisado após o tratamento com o filtro BlastR, agulha da seringa ou sonication. Não há remoção quase completa do DNA genômico, usando o filtro BlastR, que não é o caso usando uma agulha de seringa convencional ou sonication. Contaminação de DNA genômica afeta significativamente a migração da proteína através de um gel de SDS-acrilamida; no entanto, o tratamento com o filtro BlastR remove DNA genômico, resultando em migração adequada de proteínas (Figura 3B). Alterado migração causada por contaminação de DNA genômica pode afetar significativamente a interpretação dos borrões ocidentais; por exemplo, o padrão EGFR manchado visto na não filtrada lisado pode ser erroneamente interpretado como expressão aumentada em relação a amostra filtrada (Figura 3).

Utilizando este sistema otimizado de enriquecimento e deteção de PTM, um pode rapidamente determinar se uma proteína alvo é modificada por um ou mais PTMs. investigação do perfil PD-L1 PTM foi recentemente realizada usando esta técnica, e os resultados mostraram que o PD-L1 foi ubiquitinated, acetilado e tirosina fosforilada em resposta a EGF (Figura 4). Importante, estes dados relatados alterações de PD-L1 PTM endógenas, que representou uma pequena porcentagem do PD-L1 total identificado.

Figura 1: filtragem de DNA genômico de lisado celular com filtro BlastR. Filtro de imagem de BlastR (A) . (B) Lysate é carregado no filtro que foi colocado em um tubo de coleta de 15 mL. (C) o atuador é colocado dentro da seringa e lisado é passado através do filtro por compressão. (D) recolha lisado, incluindo quaisquer bolhas através de compressão completo. (E) filtrada lisada.

Figura 2: comparação de tampão de Lise BlastR aos buffers de Lise alternativo. Figura 2A adaptado de Horita et al 2017. Biosci. Rep. ³¹ (A) A431 células foram lysed com BlastR, RIPA, mPER lise IP, desnaturação (1% SDS) e Laemmli lise buffers. Todos os lysates desnaturação tinha removido usando BlastR filtro de DNA genômico. Isolamento de proteínas da membrana citoplasmática, mitocondrial e marcadores nucleares foram determinados utilizando anticorpos contra as proteínas do marcador respectivo compartimento. (B) células A431 foram lysed com BlastR, RIPA e buffer de desnaturação SDS 1%. Lisados foram immunoprecipitated com grânulos de afinidade 2/3 ou controle do IgG sumô. Amostras foram separadas por SDS-PAGE e analisadas pelo borrão ocidental, usando um anticorpo de peroxidase de 2/3-rábano (HRP) de sumô. Representante de borrões de N≥3 experimentos independentes são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: filtro de Lise BlastR é eficaz na remoção de DNA genômico. (A) A431 células foram lysed com um tampão de Lise a desnaturação. DNA genômico foi removido ou cortado com BlastR filtro, agulha da seringa ou sonication para 5, 10, 20 ou 30 segundos. 2% do lisado foi analisado por eletroforese em gel de agarose, brometo de etídio. (B) Lysate de células A431 lysed com um buffer de desnaturação ou era sem filtro ou filtro com o filtro BlastR. Amostras foram separadas por SDS-PAGE e visualizadas usando Coomassie mancha. (C) amostras de duplicata de B foram separadas por SDS-PAGE, transferido de PVDF, e proteína EGFR foi examinada usando um anticorpo EGFR. Representante borrões de experimentos independentes do N ≥3 são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: deteção de modificações borne-translational induzida por EGF para PD-L1. Figura adaptada de Horita et al 2017. neoplasia³⁰(A). Soro-restrito A431 células foram ambos unstimulated (UT) ou estimularam com EGF durante uma hora antes da lise com tampão de Lise BlastR. CMT foi analisado para níveis de PD-L1 (pistas 1,2). Grânulos de vinculação de ubiquitina (UBA01) foram usados para proteínas de ubiquitinated IP (pistas 3,4). Grânulos de vinculação do phosphotyrosine (APY03) foram usados para proteínas tirosina-fosforilada do IP (pistas 5,6). Grânulos de 2/3 ligação de sumô (ASM24) foram usados para IP SUMOylated 2/3 proteínas (pistas 7,8). Grânulos de vinculação acetil lisina (AAC01) foram usados para proteínas IP acetilado (pistas 9,10). Grânulos de controle de ligação de igG foram usados para proteínas de ligação não-específica IP (pistas 11,12). As amostras foram separadas por SDS-PAGE e analisadas pelo borrão ocidental, usando um anticorpo de PD-L1. Uma mancha representativa de experimentos independentes do N ≥3 é mostrada. Asteriscos brancos foram usados para destacar PD-L1 pY e bandas de proteínas Ac. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Cálculos para BlastR lise
	1,0 mL	2,0 mL	5,0 mL	10,0 mL
BlastR lise	965 Μ l	Μ L DE 1930	4,825 mL	9,650 mL
Tirosina fosfatase inibidor	5 Μ l	10 Μ l	25 Μ l	50 Μ l
inibidor de-ubiquitinase/de-sumoylase	10 Μ l	20 Μ l	50 Μ l	100 Μ l
Inibidor HDAC	10 Μ l	20 Μ l	50 Μ l	100 Μ l
Coquetel de inibidor de protease	10 Μ l	20 Μ l	50 Μ l	100 Μ l
Cálculos para BlastR tampão de diluição
	4,0 mL	8,0 mL	20,0 mL	40,0 mL
BlastR lise	3,86 mL	7,72 mL	19,3 mL	38,6 mL
Tirosina fosfatase inibidor	20 Μ l	40 Μ l	100 Μ l	200 Μ l
inibidor de-ubiquitinase/de-sumoylase	40 Μ l	80 Μ l	200 Μ l	400 Μ l
Inibidor HDAC	40 Μ l	80 Μ l	200 Μ l	400 Μ l
Coquetel de inibidor de protease	40 Μ l	80 Μ l	200 Μ l	400 Μ l

Tabela 1: Lise e diluição de Buffer preparação Chart. Gráfico de fornecer concentrações de inibidores para adicionar para um determinado Lise e diluição reserva volume ao preparar amortecedores para lise celular.

Teor de proteína da placa	Volume de tampão de Lise BlastR recomendado	Volume de tampão de diluição BlastR recomendado
< 1 mg	Combinar proteína de múltiplas placas	Tornar o volume final de 1,5 mL
1-2 mg	300 Μ l	Tornar o volume final de 1,5 mL
2-4 mg	600 Μ l	Tornar o volume final de 3 mL
4-6 mg	900 Μ l	Tornar o volume final de 4,5 mL

Tabela 2: Gráfico de Buffer BlastR lise/diluição. Gráfico fornecendo recomendado volumes de tampão de Lise e diluição ao obter lisado.

Volume de lisado celular adicionado a 1 ml de reagente de precisão vermelho proteína ensaio (µ l)	Multiplicador para usar com amostra ler OD600
10	10
20	5
30	3.3
40	2.5
50	2

Tabela 3: Multiplicadores para converter as leituras de espectrofotômetro para mg/mL lisado. Gráfico fornecendo números de conversão para auxiliar com o cálculo de concentração de proteína.

grânulos de afinidade	volume do grânulo da pasta/IP (mL)
Ubiquitination	20
Phosphotyrosine	30
SUMOylation 2/3	40
Acetilação	50
contas de controle	volume do grânulo da pasta/IP (mL)
Grânulos de controle ubiquitination	20
Grânulos de controle Phosphotyrsoine	30
Grânulos de 2/3 controle SUMOylation	40
Grânulos de controle de acetilação	50

Tabela 4: Recomendado Volume de grânulos/IP Chart. Gráfico fornecendo recomendadas quantidades de grânulos de afinidade para usar por reação de IP.

Discussão

Abordagens iniciais utilizadas para determinar se uma proteína alvo é modificada por uma PTM podem ser executadas usando o anticorpo específico de proteína alvo para IP, seguido por western blot com um anticorpo PTM (EG., antiacetil lisina), ou usando um anticorpo PTM para IP, seguido por western blot com o anticorpo específico alvo de proteína^30,31,33. Embora ambas as abordagens teoricamente funcionam, utilizar um anticorpo específico da proteína-alvo tem mais armadilhas potenciais, tais como o anticorpo pode não ser compatível com IP, ou grandes modificações PTM podem bloquear o site do reconhecimento de anticorpos na proteína alvo^{34 ,35}. A vantagem dos grânulos PTM afinidade é que os domínios de anticorpo ou vinculação reconhecem especificamente o PTM de interesse; assim, as modificações à proteína alvo não devem alterar reconhecimento pelos grânulos de afinidade. Como exemplo, PD-L1 Ub foi identificado com a técnica descrita aqui, e ambos endógena mono - e poli-Ub foi observada (Figura 4). Uma recente publicação pela Lim et al. utilizado em vitro Ub técnicas para investigar o Ub PD-L1, e o resultado foi muito semelhante para os resultados mostrados na Figura 4³⁶. Curiosamente, eles também tocaram IP com um anticorpo PD-L1 para enriquecer PD-L1 do lisado, celular, onde foi overexpressed Ub e MG-132 foi adicionado para aumentar o sinal. O padrão de Ub não era robusto e muito distintas do padrão em vitro Ub. Investigação de endógena Ub PD-L1 em modelos de cultura de células não foi realizada no Lim et al. relatório para esclarecer a diferença entre os dados de cultura e in vitro da célula.

A investigar se uma proteína é modificada por um PTM pode ser um desafio, devido à sua baixa abundância e natureza transitória^37,38e muitas vezes requer enriquecimento através de IP. IP eficaz de PTMs requer a otimização de várias etapas-chave e reagentes, tais como buffers de Lise e reagentes de afinidade. Ao investigar várias PTMs de uma proteína do alvo, aumenta a otimização necessária provável. Utilizar o sistema de Lise blastR é um passo crítico no presente protocolo, como ele mantém robusta capacidade IP, permitindo a deteção de PTM do pY, SUMO de 2/3, Ub e PTMs de Ac em um único sistema. Esta técnica otimiza o tempo e os recursos necessários para determinar se uma proteína alvo específico é modificada por essas quatro PTMs e potencialmente fornece uma melhor imagem do crosstalk PTM em relação ao comparar os resultados da PTM executados usando vários sistemas de Lise. Realizou-se a investigação da compatibilidade do sistema blastR lise com PTMs alternativos, como glicosilação, no entanto, não examinou exaustivamente todos os tipos de PTMs.

DNA genômico abundante pode interferir com medições de proteínas usando um colorimétrico ou nanodrop métodos, afetar a migração das proteínas em um gel do acrilamido do SDS e evitar a interação de matriz de proteína e afinidade durante os ensaios IP. O método descrito aqui utiliza um filtro especializado para remover eficazmente a contaminação de DNA genômica, que é outro passo fundamental do presente protocolo. Para destacar este ponto, efectuaram-se testes de viscosidade antes e após o tratamento de filtro blastR, e os resultados mostraram uma redução de uma alta viscosidade para a viscosidade da água (dados não mostrados). Esta mudança na viscosidade foi apoiada pelos resultados na Figura 3, mostrando que quase todo o DNA genômico tinha sido removido. Importante, DNA não é cortado com este método, como qualquer DNA cortado não será capturado pelo filtro (dados não mostrados). Esta ferramenta é superior aos métodos convencionais, como sonication ou seringa-DNA-corte, porque exige nenhum equipamento especializado, é altamente reprodutível e remove o DNA em vez de la corte. Além disso, ele não irá degradar proteína no lisado, que pode ocorrer usando métodos convencionais de²⁹. Utilizar o filtro leva 5-30 segundos por exemplo em comparação com métodos alternativos onde repartição eficaz do DNA pode levar alguns minutos (ou seja, corte de seringa) e pode resultar em heterogeneidade da amostra como contaminantes de DNA permanecem no lisado. Realizou-se uma análise extensiva da filtragem lisado blastR pré e pós, e nenhuma diferença observável no perfil de proteína foi observada por Coomassie, alvos ocidentais, ou totais e alvos PTM análises; assim, a integridade do perfil da proteína pode não ter sido afetada, filtrando o DNA genômico. Em última análise, este sistema de filtro é benéfico para qualquer ocidental ou aplicativo IP onde o DNA genômico está presente e pode afetar a interpretação da análise de proteínas.

É importante notar que há potencial para detecção falsa negativa, utilizando esta técnica, que pode ser devida em parte à saturação do grânulo de afinidade, interferência do sítio de ligação ou mascaramento de PTM. Por exemplo, uma proteína do alvo específico pode ser alterada pela Ac em níveis muito baixos; assim, ele não pode ser isolado por grânulos de afinidade de lisina pan-acetil que têm sido saturados por mais abundantes proteínas alvo Ac-modificado. Estudos em curso estão sendo realizados para avaliar os limites de detecção dos reagentes afinidade utilizados neste protocolo, mas uma recente publicação sugere um limite de detecção muito robusto. Os dados mostraram que esta técnica poderia identificar sómente 17 moléculas de proteína alvo acetilado por célula³¹. Ainda, circunstâncias específicas, tais como célula digite especificidade, PTMs transitórias em resposta a estímulos específicos, ou mascaramento de PTMs devido à interação de proteínas pode todos resultar em resultados falsos negativos. Estas são possíveis armadilhas desta técnica, bem como a maioria dos métodos de PTM IP. Assim, recomenda-se confirmar os resultados em múltiplas abordagens.

Modificações como glicosilação e fosforilação têm sido mostradas para competir por semelhante aminoácidos^39,40e outros PTMs como ubiquitination e fosforilação têm sido mostrados para trabalhar em sequência para regular uma proteína função de^17,41. Trabalho recente na proteína Tau neuropatológica destacou a importância do crosstalk PTM, onde hiper Tau-fosforilação e Tau SUMOylation realçados os outros⁴². Além disso, este grupo mostrou que a SUMOylation de Tau impediu poli-Ub e subsequente degradação de Tau, possivelmente levando a agregação. Este é apenas um dos muitos exemplos de interferência PTM regulamentar, e a utilidade desta técnica vai ajudar a iluminar a importância da PTMs e sua interferência na regulação de proteínas chaves na saúde e na doença.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
lise celular / remoção e análise de DNA genômico< / forte>
1x tampão comum de solução salina tamponada com fosfato (PBS)		Receita: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4
		BLST01	Mistura proprietária de detergentes, sais e outros aditivos tampão
Tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA)	tampão		Receita: Tris-HCl, NaCl, SDS, Desoxicolato de Sódio, Igepal
Reagente de extração de proteína de mamíferos (mPER)	Thermofisher	78503	Mistura proprietária de detergentes, sais e outros aditivos tampão
Imunoprecipitação (IP) Lise	Pierce	87787	Mistura proprietária de detergentes, sais e outros aditivos tampão tampão
desnaturante 1% de dodecil sulfato de sódio (SDS) tampão			Receita: PBS, SDS, EDTA, EGTA
Tampão		Laemmli	Receita: Tris-HCl, SDS, glicerol, azul de bromofenol
Tampão de diluição BlastR	Cytoskeleton Inc.	BDB01	Mistura proprietária de detergentes, sais e outros aditivos tampão
Inibidor de protease Coquetel	Citoesqueleto Inc.	PIC02
N-Etilmaleimida (NEM) & N,N,N′,N′-Tetrakis(2-piridilmetil)etilenodiamina (TPEN)	Citoesqueleto Inc.
Tricostatina A (TSA) e Citoesqueleto de Nicotinamida	Inc.	Ortovanadato de sódio ativado por TSA01
(Na3VO4)	Cytoskeleton Inc.	Raspadores de células PYI01
	Costar	3008
BlastR Filter	Cytoskeleton Inc.	BLR02
BD Agulha de seringa de insulina	BD	08290-3284-11
sonicador (Branson Sonifier)	Branson	Sonifier 450
Precision Red Advanced Protein Reagent	Cytoskeleton Inc.	ADV02
1 mL cubetas	Fisher	14955127
Espectrofotômetro (Genesys20)	Thermofisher	4001	Outros espectrofotômeros podem ser usados para medir a concentração de proteínas
Agarose	Fisher	BP1356-500
1kb Escada de ácido desoxirribonucléico (DNA)	NEB	N3232L
Caixa de gel de DNA	Thermofisher	7312 B1A
Tampão		comum Tris/Borato/EDTA (TBE)	Receita: Tris-HCl, Ácido bórico, EDTA
forte>PTM Imunoprecipitação
fosfotirosina	Citoesqueleto Inc.	APY03-grânulos Grânulos
ubiquitinação	Citoesqueleto Inc.	UBA01-grânulos
SUMOilação 2/3 grânulos Citoesqueleto	Inc.	ASM24-grânulos
Grânulos de acetilação	Cytoskeleton Inc.	AAC04-grânulos Grânulos
de controle de fosfotirosina	Citoesqueleto Inc.	CIG01-beads
Grânulos de controle de ubiquitinação	Cytoskeleton Inc.	CUB02-beads
SUMOilação 2/3 contas de controle	Cytoskeleton Inc.	CIG01-grânulos Grânulos
de controle de acetilação	Cytoskeleton Inc.	CIG02-beads
BlastR tampão de lavagem	Citoesqueleto Inc.	BWB02	Mistura proprietária de detergentes, sais e outros aditivos tampão
Tampão de eluição de grânulos	Citoesqueleto Inc.	BEB01	Mistura proprietária de detergentes, sais e outros aditivos tampão
microcentrífuga	Eppendorf	5417	Outras microcentrífugas podem ser usadas
rotador de tubo	ATR	RKVSD	Outros rotadores de tubo de ponta a ponta podem ser usados
pontas de carga de proteínas	VWR	37001-150
colunas de rotação	Cytoskeleton Inc.	SPN22
95 ° C	Benchmark	BSH1002
SDS-PAGE/Transfer/Western analysis
5x tampão de amostra	receita de tampão		: azul de bromofenol, ditiotreitol (DTT), Glicerol, SDS, Tris-HCl
novex poço de cunha 4-20% Géis Tris-gly	Invitrogen	XP04200BOX	Os grandes poços de cunha são excelentes para carregar grandes volumes
1x Receita	de buffer comum de buffer		: Tris-HCl, Glicina, SDS
seeblue protein ladder	Technologies	LC5625
Célula de eletroforese	Invitrogen	Xcell surelock	Outras células de eletroforese podem ser usadas, no entanto, estas são compatíveis com os géis novex wedgewell
fonte de alimentação	Biorad	PowerPac HC	Outras fontes de alimentação podem ser usadas
de tampão comum de tampão		de transferência	: Tris-HCl, glicina, metanol
Célula de transferência	Biorad	mini célula trans-blot	Outras células de transferência podem ser usadas
Membranas Immobilon-P (PVDF)	milipore	IPVH 304F0
	prosperam	813503015095
solução salina tamponada com Tris (TBST)	tampão		: Tris-HCl, NaCl, Tween 20
Reagente de Detecção Quimioluminescente	Citoesqueleto Inc.	CLRA/CLRB
Crescimento e tratamento celular
Meio de Eagle modificado de Dulbecco	ATCC	30-2002
Soro fetal bovino	ATLAS&	nbsp; F-0500-A
Fator de crescimento epidérmico	Cytoskeleton Inc.	CN02-A
Placas de cultura de células de 150 mm	Corning	430599