Artigo de método

Celular agregação ensaios para avaliar a vinculação do entalhe drosófila com Trans-ligantes e sua inibição pelo Cis-ligantes

DOI:

10.3791/56919

⸱

2 de janeiro de 2018

 , 
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology, Baylor College of Medicine

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Complexidade dos sistemas na vivo torna difícil distinguir entre a ativação e a inibição do receptor do entalhe por trans- e cis-ligantes, respectivamente. Aqui, apresentamos um protocolo baseado em vitro ensaios de agregação de célula para avaliação qualitativa e semi-quantitativa da vinculação de entalhe de Drosophila Trans-ligantes vs cis-ligantes.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Entalhe de sinalização é um sistema de comunicação célula-célula evolutivamente conservada usado amplamente no desenvolvimento animal e manutenção de adulta. Interação do receptor Notch com ligantes de vizinhas células induz a ativação da via de sinalização (trans-ativação), enquanto a interação com ligantes da mesma célula inibe a sinalização (cis-inibição). Equilíbrio adequado entre trans-ativação e cis-inibição ajuda a estabelecer os níveis ideais de entalhe sinalização em alguns contextos durante o desenvolvimento do animal. Por causa dos domínios de expressão sobreposição de entalhe e seus ligantes em muitos tipos de células e a existência de mecanismos de feedback, estudando os efeitos de uma determinada modificação pós-traducional na trans- contra cis-interações de entalhe e seus ligantes na vivo é difícil. Aqui, descrevemos um protocolo para o uso de células de Drosophila S2 em célula-agregação ensaios para avaliar os efeitos de derrubar um modificador de via Notch na ligação de entalhe para cada ligante trans e cis. Células S2 estàvel ou transitoriamente transfectadas com um vetor de entalhe-expressando são misturadas com células expressando cada ligante de entalhe (S2-Delta ou S2-Serrate). Trans-ligação entre o receptor e ligantes resulta na formação de agregados de células heterotypic e é medido em termos de número de agregados por mL, composto de > 6 células. Para examinar o efeito inibitório do cis-ligantes, S2 células expressando co entalhe e cada ligante são misturadas com células S2-Delta ou S2-Serrate e o número de agregados é quantificado como descrito acima. A diminuição relativa do número de agregados devido à presença de cis-ligantes fornece uma medida de cis-ligand-mediados por inibição da trans-ligação. Estes ensaios simples podem fornecer dados semi quantitativos sobre os efeitos de manipulações genéticas ou farmacológicos na ligação de entalhe para seus ligantes e podem ajudar a decifrar os mecanismos moleculares subjacentes os efeitos na vivo de tais manipulações na sinalização Notch.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Canônico de sinalização Notch é um mecanismo de comunicação de curto alcance de célula para célula que exige contato físico dos vizinhos células para facilitar a interação entre receptores Notch e seus ligantes1. Interação do receptor do entalhe (presente na superfície das células do sinal de recepção) com ligantes (presentes na superfície de sinal-enviando células) inicia sinalização Notch e é conhecida como trans-ativação2. Por outro lado, a interação entre entalhe e seus ligantes na mesma cela leva à inibição da via de entalhe de e é conhecida como cis-inibição3. O equilíbrio ....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. preparação do RNA encalhado dobro (dsRNA) para Knockdown de Souza

  1. Amplificação por PCR dos produtos
    1. Use o DNA genômico do selvagem-tipo branco amarelo (y w) e pAc5.1-EGFP como modelo e os seguintes pares de cartilha para amplificar os fragmentos de DNA usados na síntese de dsRNA. Use o seguinte perfil térmico de PCR: desnaturação (95 ° C, 30 s), recozimento (58 ° C, 30 s) e extensão (72 ° C, 1 min).
      Reforçada a proteína verde fluorescente (EGFP) dsRNA Cartilhas (5' - 3')-
      Primeira demão para diante-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
      Reverter a primei....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As nossas observações na vivo sugeriram que a perda dos resultados xylosyltransferase gene Souza em ganho de entalhe sinalização devido ao aumentado mediada por Delta trans-ativação de entalhe sem afetar o cis-inibição da Entalhe por ligantes8. Para testar esta noção, realizaram-se ensaios de agregação em vitro celular. Primeiro, Souza expressão nas células S2 foi derrubado usando Souza dsRNA. EGFP<.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Canônico de sinalização Notch depende das interacções entre o receptor do entalhe e seus ligantes5. Embora a maioria dos estudos sobre a via de Notch principalmente considerar a vinculação do entalhe e ligantes em células vizinhas (trans), entalhe e ligantes mesmo células interagem e estes so-called cis-interações podem desempenhar um papel inibitório no entalhe sinalização de3,4. Nesse sentido, para decifrar os mecanismo.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nenhum conflito de interesses.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores reconhecem o apoio do NIH/NIGMS (R01GM084135 de HJN) e Fundação de Mizutani para eficientemente (grant #110071 para HJN) e é grato ao Tom V. Lee para discussões e sugestões sobre os ensaios e Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine e a drosófila genômica recurso Center (DGRC) para plasmídeos e linhas celulares.

....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
BioWhittaker Schneider' s Meio de Drosophila, solução Lonza04-351Q
HyClone Penicilina-Estreptomicina 100XGE Healthcare lifescience 
Placa de 6 poçosCELLSTAR Greiner Bio-One657 160
Placa de 24 poços CELLSTARGreiner Bio-One662160
Mini agitador VWRMarshell Sceintific12520-956
HemocitômetroFisher Sceintific 267110
FuGENE HD Transfecção ReagentePromegaE2311
MEGAscrip T7 Kit de TranscriçãoAmbionAM1334
Quick-RNA MiniPrep (Kit de purificação de RNA)Zymo ResearchR1054
Microscópio Invertido VistaVisionVWR
9MP USB2.0 Microscópio Câmera Digital + Software AvançadoAmScopeMU-900 Aquisição deimagem usando o software ToupView
Kit de extração rápida de gelInvitrogenK210012
Soro fetal bovinoGenDepotF0600-050
MetotrexatoSigma-AldrichA6770-10
Higromicina BInvitrogenHY068-L6
Sulfato de cobreMacron Fine Chemicals4448-02
Células S2InvitrogenR69007
S2-SerrateTom cellsPresente de R. Fleming (Fleming et al, Desenvolvimento, 2013)
Células S2-DeltaDGRC152
Células S2-NotchDGRC154
vetor pMT-DeltaDGRC1021Presente de S. Artavanis-Tsakonas
pMT-SerratePresente de Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)
Vetor pMT-NotchDGRC1022Presente de S. Artavanis-Tsakonas
pAc5.1-EGFPPresente de Hugo Bellen
TaqMan RNA-to-Ct 1-Step KitBiossistema Aplicado1611091
Ensaio de Expressão Gênica TaqMan para CG9996 (Shams)Biossistema AplicadoDm02144576_g1 com corante FAM-MGB
Ensaio de expressão gênica TaqMan para CG7939 (RpL32)Dm02151827_g1de biossistema aplicadocom corante FAM-MGB
Sistema de PCR em tempo real rápido da Applied Biosystems 7900HTde4351405 de 96 poçosApplied Biosystem
SV30010Vetor Módulo de bloco da

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing. Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).
  2. Fortini, M. E.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Sinaliza o NotchEnsaio de Agrega o CelularTransativa oCis inibi oC lulas S2 de DrosophilaContagem em Hemocit metroAgitador OrbitalMicrosc pio Composto InvertidoRNA de Fita DuplaIndu o por Sulfato de Cobre

Artigos relacionados