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Artigo de método

Métodos de estadiamento Pupal períodos e medição de asa pigmentação da Drosophila guttifera

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DOI:

10.3791/56935

24 de janeiro de 2018

Neste artigo

Resumo

Protocolos para encenar o período pupal e medição de pigmentação de asa de Drosophila guttifera são descritos. Preparação e quantificação de pigmentação fornecem uma base sólida para estudar os mecanismos do desenvolvimento dos traços adultos e habilitar interespecífica comparação do desenvolvimento de traço.

Resumo

Diversificadas espécies de Drosophila (mosca de fruta) fornecem oportunidades para estudar os mecanismos de desenvolvimento e alterações genéticas responsáveis por mudanças evolutivas. Em particular, a fase adulta é uma fonte rica de traços morfológicos para comparação interespecífica, incluindo comparação de pigmentação de asa. Para estudar as diferenças de desenvolvimento entre as espécies, a observação detalhada e preparo adequado são necessários para comparação precisa. Aqui descrevemos os protocolos para preparo dos períodos pupal e quantificação de pigmentação da asa de uma mosca de fruta bolinhas, Drosophila guttifera. Primeiro, descrevemos o método por observação morfológica detalhada e definição dos estágios pupal baseado em morfologias. Este método inclui uma técnica para remover o casulo, que é o caso de quitinoso exterior da pupa, para permitir a observação detalhada de morfologias pupal. Em segundo lugar, descrevemos o método para medir a duração da fase pupal definido. Finalmente, descrevemos o método para a quantificação de pigmentação de asa com base na análise de imagem usando imagens digitais e o software ImageJ. Com esses métodos, podemos estabelecer uma base sólida para a comparação de processos de desenvolvimento de traços adultos durante estágios pupal.

Introdução

Alguns dos traços morfológicos da drosófila são diversificados entre espécies1,2,3,4,5. Vamos aproximar-na questão da diversidade morfológica como surge, comparando os mecanismos de geração destas morfologias. Exemplos de tais morfologias são tricomas larvas, pentes de sexo adulto, aparelho genital externo, pigmentação abdominal e asa pigmentação6,7,8,9,

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Protocolo

1. estoque de voar

  1. Use Drosophila guttifera para todos os protocolos a seguintes.
  2. Usar frascos plásticos (diâmetro 25 mm x altura 96mm) e tampões de celulose (diâmetro 23 milímetros x altura 26 mm) para a manutenção de estoque. Usar um padrão alimentar de farinha de milho/açúcar/levedura/agar e siga uma publicação descreveu três outras receitas alternativas para esta espécie2.
    Nota: d. guttifera (número conservado em estoque 15130-1971.10) é fornecido pelo espécie Drosophila Stock Center da Universidade da Califórnia, San Diego. Embora d. guttifera pertence a immigrans-tripunctata

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Resultados

O período pupal de d. guttifera é dividido em 17 estágios (P1 - P15(ii); imagens de representante de três estágios (P1, P5 - 6, P10) são mostrados a Figura 3e todas as 17 fases estão ilustradas na Figura 4). Embora Bainbridge e Bownes17 reconhecido 20 fases no d. melanogaster, alguns destes estágios não poderiam ser aplicado a d. guttifera. A ordem dos dois eventos do desenvolvim.......

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Discussão

Aqui descrevemos os protocolos para definição dos estágios pupal, removendo o casulo para observação detalhada, medindo durações dos estágios pupal e a medida da intensidade das manchas de preto em uma ala em d. guttifera. Esses protocolos podem ser aplicados para muitos Drosophila e relacionados a moscas espécies, especialmente com pigmentação de asa.

Observação em profundidade e descrição de eventos mais detalhados do desenvolvimento permitiria mais subdivisão dos estágios........

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Divulgações

Os autores não têm nenhum conflito de interesses.

Agradecimentos

Agradecemos a Sean B. Carroll e Thomas Werner para fornecer estoques voar, Naoyuki fusível para equipamentos, Byung Seok Jin por sua assistência na filmagem, Kiyokazu Agata para tutoria e Elizabeth Nakajima para edição inglesa. Este trabalho foi financiado pelo KAKENHI 17K 19427 e Takeda Science Foundation.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Drosophila guttiferaThe Drosophila Species Stock Center na UC San Diego15130-1971.10Drosophila guttifera, uma espécie de mosca-da-fruta usada neste artigo
Frasco de plásticoHightechMKC-30Frasco de plástico, para manutenção de estoque
moscas Buzz plugs frascos e tampas de garrafas para frascos de vidroFisher ScientificAS-271Tampão de celulose, para manutenção de estoque de moscas
Açúcar macio brancoMitsui SugarJ-500gAçúcar macio branco, para alimentos padrão de fubá/açúcar/fermento/ágar
Farinha de milhoNippon Flour MillsFFarinha de milho, para alimentos padrão de fubá/açúcar/fermento/ágar
Grãos de milho - CNippon Flour Mills GCGrãos de milho - C, para alimentos padrão de fubá/açúcar/fermento/ágar
Ágar em póMatsuki Kanten SangyoNo.602Ágar em pó, para alimentos padrão de fubá / açúcar / fermento / ágar
Fermento de cerveja secaAsahi Food & HealthcareY2ALevedura de cerveja seca, para alimentos padrão de fubá/açúcar/fermento/ágar
P-hidroxibenzoato de butilaNacalai Tesque06327-02P-hidroxibenzoato de butilo, para alimentos padrão de fubá/açúcar/fermento/ágar
EtanolWako057-00456Etanol, para alimentos padrão de fubá/açúcar/fermento/ágar
Microtubo de fundo planoIna OpticaCF-0150microtubo de 1,5 mL, para coletor de pupas
CAPSULEFUGETomyPMC-060Mini microcentrífuga, para coleta de pupas
Esterilizado Schale NBSansei Medical01-013Placa de Petri de plástico (diâmetro 90 mm x altura 15 mm)
Rack de tubo de soroIwaki9796-050Usado como uma câmara úmida, para observação de pupa
Corning Falcon Easy-Grip placa de cultura de tecidosCorning353001Placa de Petri de plástico (diâmetro 35 mm x altura 10 mm)
Placa de cultura de tecidos padrão FalconCorning353002Placa de Petri de plástico (diâmetro 60 mm x altura 15 mm)
PinoKokuyo51233709Alfinete, para fazer furos na tampa do microtubo
EstereomicroscópioOlympusSZX16Estereomicroscópio, para observação morfológica
Câmera digitalOlympusDSE-330-ACâmera digital, para imagem
NICETACK fita dupla faceNichibanNW-15SFFita dupla face, para remoção de pupário
Dumont #5 fórcepsFine Science Tools11252-20Fórceps, para remoção de pupário
Van Gogh VISUAL PincelTalens JapãoGWVR-#5/0Pincel, para remoção de pupário
Greiner CELLSTAR 12 poços placa de cultura de célulasMerck665-180Placa de cultura de células de 12 poços, para medir a duração dos períodos de pupa
NaClWako191-01665NaCl, para PBS
KClNacalai Tesque285-14KCl, para PBS
Na2HPO4· 12H2OWako196-02835Na2HPO4· 12H2O, para PBS
KH2PO4Nacalai Tesque28721-55KH2PO4, para PBS
Filtro de densidade neutra escalonada (ND) 0,04 - 3,0Edmund Optics64-384Filtro de densidade escalonada, para calibração de medição de pigmentação
Software ImageJNIH1.8.0-101Software ImageJ, para medição da intensidade de manchas pretas em uma asa (https://imagej.nih.gov)
FINE FROST lâmina de vidroMatsunami Glass IndFF-001Lâmina de vidro, para medição da intensidade de manchas pretas em uma asa
Vidro de cobertura de microscópio quadrado 18 x 18Matsunami Glass IndC018181Lamínula, para medição da intensidade de manchas pretas em uma asa
de

Referências

  1. Carson, H. L., Hardy, D. E., Spieth, H. T., Stone, W. S. The evolutionary biology of the Hawaiian Drosophilidae. Essays in evolution and genetics in honor of Theodosius Dobzhansky. Hecht, M. K., Steere, W. C. , Springer (Meredith Corporation). New York. 437-543 (1970).
  2. Markow, T. A., O'Grady, P. M. Drosophila: a guide to species id....

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