Protocolos para encenar o período pupal e medição de pigmentação de asa de Drosophila guttifera são descritos. Preparação e quantificação de pigmentação fornecem uma base sólida para estudar os mecanismos do desenvolvimento dos traços adultos e habilitar interespecífica comparação do desenvolvimento de traço.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Métodos de estadiamento Pupal períodos e medição de asa pigmentação da Drosophila guttifera
Neste artigo
Resumo
Resumo
Diversificadas espécies de Drosophila (mosca de fruta) fornecem oportunidades para estudar os mecanismos de desenvolvimento e alterações genéticas responsáveis por mudanças evolutivas. Em particular, a fase adulta é uma fonte rica de traços morfológicos para comparação interespecífica, incluindo comparação de pigmentação de asa. Para estudar as diferenças de desenvolvimento entre as espécies, a observação detalhada e preparo adequado são necessários para comparação precisa. Aqui descrevemos os protocolos para preparo dos períodos pupal e quantificação de pigmentação da asa de uma mosca de fruta bolinhas, Drosophila guttifera. Primeiro, descrevemos o método por observação morfológica detalhada e definição dos estágios pupal baseado em morfologias. Este método inclui uma técnica para remover o casulo, que é o caso de quitinoso exterior da pupa, para permitir a observação detalhada de morfologias pupal. Em segundo lugar, descrevemos o método para medir a duração da fase pupal definido. Finalmente, descrevemos o método para a quantificação de pigmentação de asa com base na análise de imagem usando imagens digitais e o software ImageJ. Com esses métodos, podemos estabelecer uma base sólida para a comparação de processos de desenvolvimento de traços adultos durante estágios pupal.
Introdução
Alguns dos traços morfológicos da drosófila são diversificados entre espécies1,2,3,4,5. Vamos aproximar-na questão da diversidade morfológica como surge, comparando os mecanismos de geração destas morfologias. Exemplos de tais morfologias são tricomas larvas, pentes de sexo adulto, aparelho genital externo, pigmentação abdominal e asa pigmentação6,7,8,9,
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. estoque de voar
- Use Drosophila guttifera para todos os protocolos a seguintes.
- Usar frascos plásticos (diâmetro 25 mm x altura 96mm) e tampões de celulose (diâmetro 23 milímetros x altura 26 mm) para a manutenção de estoque. Usar um padrão alimentar de farinha de milho/açúcar/levedura/agar e siga uma publicação descreveu três outras receitas alternativas para esta espécie2.
Nota: d. guttifera (número conservado em estoque 15130-1971.10) é fornecido pelo espécie Drosophila Stock Center da Universidade da Califórnia, San Diego. Embora d. guttifera pertence a immigrans-tripunctata
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
O período pupal de d. guttifera é dividido em 17 estágios (P1 - P15(ii); imagens de representante de três estágios (P1, P5 - 6, P10) são mostrados a Figura 3e todas as 17 fases estão ilustradas na Figura 4). Embora Bainbridge e Bownes17 reconhecido 20 fases no d. melanogaster, alguns destes estágios não poderiam ser aplicado a d. guttifera. A ordem dos dois eventos do desenvolvim.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Aqui descrevemos os protocolos para definição dos estágios pupal, removendo o casulo para observação detalhada, medindo durações dos estágios pupal e a medida da intensidade das manchas de preto em uma ala em d. guttifera. Esses protocolos podem ser aplicados para muitos Drosophila e relacionados a moscas espécies, especialmente com pigmentação de asa.
Observação em profundidade e descrição de eventos mais detalhados do desenvolvimento permitiria mais subdivisão dos estágios........
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nenhum conflito de interesses.
Agradecimentos
Agradecemos a Sean B. Carroll e Thomas Werner para fornecer estoques voar, Naoyuki fusível para equipamentos, Byung Seok Jin por sua assistência na filmagem, Kiyokazu Agata para tutoria e Elizabeth Nakajima para edição inglesa. Este trabalho foi financiado pelo KAKENHI 17K 19427 e Takeda Science Foundation.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Drosophila guttifera | The Drosophila Species Stock Center na UC San Diego | 15130-1971.10 | Drosophila guttifera, uma espécie de mosca-da-fruta usada neste artigo |
| Frasco de plástico | Hightech | MKC-30 | Frasco de plástico, para manutenção de estoque |
| moscas Buzz plugs frascos e tampas de garrafas para frascos de vidro | Fisher Scientific | AS-271 | Tampão de celulose, para manutenção de estoque de moscas |
| Açúcar macio branco | Mitsui Sugar | J-500g | Açúcar macio branco, para alimentos padrão de fubá/açúcar/fermento/ágar |
| Farinha de milho | Nippon Flour Mills | F | Farinha de milho, para alimentos padrão de fubá/açúcar/fermento/ágar |
| Grãos de milho - C | Nippon Flour Mills GC | Grãos de milho - C, para alimentos padrão de fubá/açúcar/fermento/ágar | |
| Ágar em pó | Matsuki Kanten Sangyo | No.602 | Ágar em pó, para alimentos padrão de fubá / açúcar / fermento / ágar |
| Fermento de cerveja seca | Asahi Food & Healthcare | Y2A | Levedura de cerveja seca, para alimentos padrão de fubá/açúcar/fermento/ágar |
| P-hidroxibenzoato de butila | Nacalai Tesque | 06327-02 | P-hidroxibenzoato de butilo, para alimentos padrão de fubá/açúcar/fermento/ágar |
| Etanol | Wako | 057-00456 | Etanol, para alimentos padrão de fubá/açúcar/fermento/ágar |
| Microtubo de fundo plano | Ina Optica | CF-0150 | microtubo de 1,5 mL, para coletor de pupas |
| CAPSULEFUGE | Tomy | PMC-060 | Mini microcentrífuga, para coleta de pupas |
| Esterilizado Schale NB | Sansei Medical | 01-013 | Placa de Petri de plástico (diâmetro 90 mm x altura 15 mm) |
| Rack de tubo de soro | Iwaki | 9796-050 | Usado como uma câmara úmida, para observação de pupa |
| Corning Falcon Easy-Grip placa de cultura de tecidos | Corning | 353001 | Placa de Petri de plástico (diâmetro 35 mm x altura 10 mm) |
| Placa de cultura de tecidos padrão Falcon | Corning | 353002 | Placa de Petri de plástico (diâmetro 60 mm x altura 15 mm) |
| Pino | Kokuyo | 51233709 | Alfinete, para fazer furos na tampa do microtubo |
| Estereomicroscópio | Olympus | SZX16 | Estereomicroscópio, para observação morfológica |
| Câmera digital | Olympus | DSE-330-A | Câmera digital, para imagem |
| NICETACK fita dupla face | Nichiban | NW-15SF | Fita dupla face, para remoção de pupário |
| Dumont #5 fórceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Fórceps, para remoção de pupário |
| Van Gogh VISUAL Pincel | Talens Japão | GWVR-#5/0 | Pincel, para remoção de pupário |
| Greiner CELLSTAR 12 poços placa de cultura de células | Merck | 665-180 | Placa de cultura de células de 12 poços, para medir a duração dos períodos de pupa |
| NaCl | Wako | 191-01665 | NaCl, para PBS |
| KCl | Nacalai Tesque | 285-14 | KCl, para PBS |
| Na2HPO4· 12H2O | Wako | 196-02835 | Na2HPO4· 12H2O, para PBS |
| KH2PO4 | Nacalai Tesque | 28721-55 | KH2PO4, para PBS |
| Filtro de densidade neutra escalonada (ND) 0,04 - 3,0 | Edmund Optics | 64-384 | Filtro de densidade escalonada, para calibração de medição de pigmentação |
| Software ImageJ | NIH | 1.8.0-101 | Software ImageJ, para medição da intensidade de manchas pretas em uma asa (https://imagej.nih.gov) |
| FINE FROST lâmina de vidro | Matsunami Glass Ind | FF-001 | Lâmina de vidro, para medição da intensidade de manchas pretas em uma asa |
| Vidro de cobertura de microscópio quadrado 18 x 18 | Matsunami Glass Ind | C018181 | Lamínula, para medição da intensidade de manchas pretas em uma asa |
Referências
- Carson, H. L., Hardy, D. E., Spieth, H. T., Stone, W. S. The evolutionary biology of the Hawaiian Drosophilidae. Essays in evolution and genetics in honor of Theodosius Dobzhansky. Hecht, M. K., Steere, W. C. , Springer (Meredith Corporation). New York. 437-543 (1970).
- Markow, T. A., O'Grady, P. M. Drosophila: a guide to species id....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
