Caracterização de células tumorais, usando um fio de médico para a captura de células tumorais de circulação: uma abordagem 3D baseado no DNA peixe e imunofluorescência

CTC representa uma etapa chave de câncer célula difusão¹. Sua presença no sangue periférico de pacientes está associada (metastático) recaída e doença progressão^2,3. CTC isolamento e caracterização do sangue de pacientes com câncer é um tipo de biópsia líquida não-invasiva. Nos últimos anos, tornou-se cada vez mais evidente que a progressão e a resposta de tumores de diferentes tratamentos usando este tipo de análise de monitoramento fornece importantes informações clínicas^4,5. Biópsia líquida é ainda mais útil quando a cirurgia não é viável ou quando o tecido do tumor primário não está disponível, ou seja, para lesões não-biopsiable. Portanto, esta abordagem é promissor em configurações de câncer específicos como NSCLC metastático, onde a presença do CTC foi mostrada para ter um papel prognóstico negativo⁶. NSCLC é um tumor que beneficia especialmente de abordagens terapêuticas alvo^7,8,9 , projetado para funcionar em moléculas específicas (alvos moleculares) conhecidas por estar envolvido no crescimento, progressão, e propagação da doença. Portanto, a detecção de alvos específicos durante a progressão da doença é necessária. Investigação do CTC é uma abordagem de diagnóstica extremamente interessante para detectar e monitorar alvos de drogas sem a necessidade de tecidos primários ou metastáticos. Por exemplo, a detecção de translocações de gene ALK em células CPNPC é associada com sensibilidade para crizotinib, uma terapia-alvo específico¹⁰. No entanto, actualmente, a detecção de translocações ALK é executada apenas em agulha fina aspirados ou biópsias pequenas; Como resultado, sem um tumor tecido análise ALK não é possível. CTC é uma alternativa potencial para tumor investigações baseadas em tecido e representa uma abordagem diagnóstica do companheiro altamente promissor.

Apesar de sua importância potencial, CTC é ainda um assunto de grande debate entre pesquisa, principalmente por causa de sua raridade (1-10 células/mL de sangue periférico,¹¹). Métodos de biópsia líquida atual usam uma quantidade limitada de sangue (ou seja, 1-30 mL)^12,13, mas isso cria uma situação de qualidade inferior sensibilidade para a detecção de CTC. daí, pesquisa está garantida para encontrar abordagens e desenvolvendo dispositivos para realizar biópsias de líquido CTC-alvo em um volume maior de sangue periférico.

Um dispositivo alternativo, um fio de médico funcionalizado (ver Tabela de materiais), foi desenvolvido para superar as limitações de recolha de amostras de sangue e obter uma análise mais representativa do CTC. Este fio funcionalizado é um dispositivo médico que capta CTC directamente a partir da corrente sanguínea de pacientes de câncer¹CE-aprovado. É composto de um fio de aço inoxidável de 16 cm de comprimento (Figura 1a) com uma ponta funcionalizada de 2 cm de comprimento, revestida com uma camada de 0,2 µm de espessura de ouro. A camada por sua vez é coberta por um estrato de hidrogel de 1 a 5 µm de espessura policarboxilato covalentemente juntamente com anticorpos dirigidos contra o EpCAM, um dos mais amplamente expressos antígenos na superfície do CTC¹⁴. A funcionalizados ponta do fio é introduzida em uma veia do braço do paciente e permanece em posição durante pelo menos 30 min. Esta abordagem permite o isolamento do CTC em vivo, diretamente no sangue periférico e a tela de cerca de 1,5-3,0 L de sangue (aproximadamente 300-fold mais do que o volume usado para métodos alternativos)¹.

Pantel et al. demonstrou a eficácia desta abordagem no isolamento do CTC diretamente para as veias do braço de câncer de pulmão pacientes¹⁵. Eles tocaram imunofluorescência fio coloração para identificar CTC usando convencionais anticorpos dirigidos contra EpCAM e pan-cytokeratin e CD45 para a deteção de leucócito. O fio foi examinado sob um microscópio de fluorescência óptico¹⁵. Os autores demonstraram que o dispositivo foi capaz de isolar o CTC, mas eles não investigou todos os alvos terapia-relacionados, tais como translocações ALK.

O método apresentado visa identificar putativo CTC em linhas de células CPNPC com base em parâmetros fenotípica, por exemplo, EpCAM positividade e a presença de biomarcadores moleculares, por exemplo, o status ALK (Figura 1b). Este procedimento 3-dia-longo combina um fio funcionalizado e mancha com DNA fluorescênciain situ-hibridização DNA, chamado imuno-DNA-peixe. Dado que o CTC é entidades raras, a vantagem deste protocolo é que a CTC pode ser caracterizado no mesmo fio em termos recursos imunofenotípica e rearranjos do DNA.

1. imuno-DNA peixes em uma lamela 2D

1. Célula de preparação e aderente de lamela semeadura
   Nota: Execute todas as etapas a seguir sob uma capa de fluxo laminar em condições estéreis.
   1. Mergulhe a lamela em etanol 100% para desinfectá-los.
      Nota: Nós usamos 12 mm × 12 mm com suporte do silicone quadrado lamelas (todos os reagentes são listados na Tabela de materiais).
   2. Coloque as lamelas em uma placa de Petri (100 mm de diâmetro). Usando seco forçou o fluxo de ar por 5 min.
   3. Lave a placa de Petri com fosfato de 15 mL estéril 1 × Dulbecco tampão salino (PBS).
   4. Lave a placa de Petri com 10 mL de meio completo (ver tabela 1).
   5. As células aderentes de sementes (aproximadamente 1.650.000 células em 10 mL de meio, contadas por análise de FACS) soltando suavemente a suspensão de células para o prato de Petri para obter chapeamento célula uniforme (cerca de 30.000 células/cm²).
      Nota: Para ~ 70% confluência, aderente as células devem ser cultivadas em lamelas pelo menos 48 h.
2. Fixação e permeabilização
   Atenção: A acetona é um inflamável e irritante substância volátil. Use apenas resistente a acetona plásticos ou recipientes de vidro (sem PVC ou PVDF).
   Nota: Execute estas etapas sob uma coifa de química.
   1. Remova o meio de cultura usando uma pipeta descartável aspiração.
   2. Lave a placa de Petri com 1 × PBS.
   3. Usando uma pinça, lave as lamelas mergulhando-os em um copo de vidro contendo 5 mL de 1 × PBS.
   4. Seque as lamelas em papel mata-borrão.
   5. Consertar as células na lamela por imersão em uma solução de acetona 100% por 10 min à temperatura ambiente (RT).
   6. Remova a lamínula por pinças. Lamela seca usando um fluxo de ar forçado por 5 min.
      Nota: O protocolo pode ser interrompido neste ponto. A lamela deve ser armazenada a-20 ° C.
3. Imunofluorescência dia 1
   Nota: Esta fase envolve uma incubação (O/N) durante a noite (~ 16 h).
   1. Lave as lamínulas no 1 × PBS duas vezes.
   2. Soltar a 100 µ l de tampão de diluição de anticorpo (ver tabela 1 para obter detalhes) no sentido do lamela e incube por 30 min em RT
      Nota: O volume da solução deve ser ajustada com base na superfície de lamela para cobrir a lamela toda e evitar o risco de estouro.
   3. Preparar a mistura de anticorpo (tabela 1), usando um 01:20 diluição de anticorpo primário monoclonal conjugados com fluocromo e anticorpo tampão de diluição, conforme especificado na folha de dados fornecida pelo fabricante.
      Nota: É recomendável usar anticorpos monoclonais conjugados com fluocromo thermostable. Se um não-thermostable fluorocromo é usado, a temperatura utilizada durante as etapas de DNA-peixe do protocolo pode danificar o fluorocromo e extinguir as emissões fluorescentes. Neste protocolo, optou-se por um anticorpo EpCAM-FITC (01:20 diluição), que não mostrou quaisquer problemas significativos com a temperatura utilizada.
   4. Enxague as lamelas duas vezes em 1 × PBS.
   5. Coloque as lamelas célula-lado em um úmido câmara e soltar 100 µ l do mix anticorpo na lamela.
      Nota: O volume da solução deve ser ajustada com base na superfície de lamela para cobrir a lamela toda e diminuir o risco de estouro.
   6. Incubar O/N (~ 16 h) no escuro a 4 ° C.
4. 2º dia de imunofluorescência
   1. Bloquear a incubação do anticorpo lavando as lamelas em 1 × PBS duas vezes.
      Nota: Loja as lamelas imerso em 100 µ l de 1 × PBS a 4 ° C em uma câmara com ambiente úmido constante no escuro até que o ensaio de peixe é executado.
5. DNA-peixe 2D dia 2
   Atenção: Deve ser atenção especial para a alta temperatura dos instrumentos e a câmara húmida.
   1. Configurar o forno de hibridização e o calor seco (~ 3 h antes de iniciar o protocolo de DNA-peixe). Programar o forno de hibridização em 75 ° C, programar o forno de calor seco a 37 ° C e esfriar a solução SSC 0,4 × (pH = 7,0 ± 0,1) (para receita SSC ver tabela 1) a 4 ° C.
      Nota: o status de pH de buffers de peixe é crítico: pH = 7,0 ± 0,1.
   2. Lave a lamela três vezes gelada 0,4 × SSC solução.
   3. Seque a lamela sob uma coifa química por 10 min no escuro.
   4. Vórtice de 10 s e realizar uma volta rápida para baixo (a taxa máxima) da sonda da parede do tubo-sonda.
   5. Coloque a lamela celular-lado para baixo em uma gota de 5 µ l de sonda de peixe em um slide e selo todas as bordas da lamela com cimento de borracha.
      Atenção: Nas duas próximas etapas envolvem altas temperaturas. Use luvas protetoras.
   6. Colocar o slide em uma câmara escura úmida no forno durante 8 min a 75 ° C para completa desnaturação do ADN da hibridação.
   7. Mova a câmara húmida para a estufa de calor seco a 37 ° C O/N.
6. DNA-peixe 2D dia 3
   1. Definir o banho de água a 72 ° C e coloque um frasco de slide-coloração com buffer SSC 0,4 × nele (tabela 1). Depois de 30 min, verifique a temperatura do buffer 0,4 × SSC, que deve estar em 72 ± 1 ° C.
   2. Prepare dois copos de vidro: um com 2 × SSC + 0,05% Tween buffer (pH = 7,0 ± 0,1) (tabela 1) e outro com água destilada.
   3. Retire a câmara húmida do forno, cuidadosamente remova o cimento de borracha do slide e desanexar a lamela com uma pinça.
   4. Lave a lamela mergulhando em 0,4 × SSC por 2 min a 72 ° C.
   5. Lave a lamela mergulhando no 2 × SSC + 0,05% Tween reserva por 30 s.
   6. Enxágue a lamela em água destilada.
   7. Seque as lamelas sob uma coifa química por 10 min no escuro.
   8. Monte a lamela em meio líquido de montagem com 1,5 µ g/mL de 4´, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para counterstain DNA total. Coloque a lamela celular-lado para baixo em uma gota de 5 µ l de meio de montagem em um slide, pressione a pinça na lamela para obter o ar para fora e selar com unhas polonês.
      Nota: Volume médio de montagem deve ser ajustada em função do tamanho da superfície da lamela.
7. Análise e observação do microscópio 2D
   Nota: As imagens podem ser adquiridas com sistemas diferentes de microscópio.

1. Adquirir imagens usando uma câmera digital de 12 bits e 20 × / 0,50 ND e objectivo de at 40 × / 0,65 com filtros adequados para vermelho (excitação: 599 nm, emissão: 588 nm), verde (excitação: 509, emissão: 524) e azul (excitação: 367 nm, emissão: 452 nm) sondas.
2. Analise imagens usando a ferramenta de software de escolha.
   Nota: Para avaliar a mancha da imunofluorescência e a localização de ALK-sonda, usamos ImageJ. Slides podem ser armazenados a-20 º C no escuro por um período máximo de 3 semanas. Para armazenamento prolongado, sugerimos usar o meio de montagem específico para armazenamento a longo prazo.

2. imuno-DNA peixe no fio

1. Célula linha pico-no fio (suporte 3D)
   Nota: A configuração preliminar envolve uma exata seleção de aderente células linhas com base em EpCAM-positividade. O fio é acrescido com anticorpos anti-EpCAM para que apenas as células EpCAM positivo estão manchadas.
   Nota: Não toque a parte funcionalizada do fio para evitar qualquer dano.
   Nota: Todas as etapas devem ser efectuadas sob uma capa de fluxo laminar em condições estéreis.
   1. Resuspenda todo o conteúdo de um frasco de T75 (80% confluência) em um frasco de 5 mL, utilizando 4 mL de meio completo; por um único pico-no, cerca de 2.000.000 células são recomendadas para maximizar a adesão de células para o fio.
   2. Retire o fio da sua embalagem de vidro.
   3. Mergulhe a parte funcionalizada ouro do fio dentro do frasco, garantindo que o fio-rolha é um ajuste à prova d'água para o frasco. Vede com filme de laboratório.
      Nota: Recomenda-se o uso de tubo de 5 mL para permitir que uma correspondência correta entre o fio-rolha e o tubo de ensaio.
   4. Incubar durante 30 min em RT em um rotador de tubo (0-120 ângulo).
   5. Enxágue o fio três vezes em solução de PBS × 1 usando 3 diferentes frascos limpos.
2. Fixação e permeabilização
   Atenção: A acetona é uma substância inflamável que pode irritar o trato respiratório. Só uso acetona-resistente plásticos ou recipientes de vidro (sem PVC ou PVDF).
   Nota: Execute estas etapas sob uma coifa de química.
   1. Secar ao ar livre do fio.
   2. Corrigi as células por mergulhar o fio numa solução de acetona 100% por 10 min em RT. Use um tubo de 5 mL.
      Nota: O fio-rolha não deve entrar em contacto com o fixador.
   3. Secar ao ar livre do fio durante 5 min à RT
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. O fio deve ser armazenado a-20 ° C. Ao embalar o fio para armazenamento a longo prazo, colocar a rolha de fio ao lado da ponta funcionalizada e inserir o fio cuidadosamente o tubo de vidro do armazenamento, tomando cuidado para não danificar a ponta funcionalizada. Fechar o vidro do armazenamento e armazenar (verticalmente ou horizontalmente) a-20 ° C.
3. Imunofluorescência dia 1
   Nota: Esta fase envolve uma incubação O/N (~ 16 h).
   1. Lave duas vezes 1 × PBS solução usando tubo de 5 mL.
   2. Incube o fio no tampão de diluição de anticorpo durante 30 min à RT usando tubo de 5 mL.
   3. Prepare 150 µ l de mistura de anticorpo com uma diluição de anticorpo primário monoclonal conjugado com fluocromo em tampão de diluição de anticorpo, conforme especificado na ficha. Por exemplo, o anticorpo EpCAM-FITC foi usado com um 01:20 diluição.
   4. Use uma ponta de p200 para realizar a incubação, como segue: extrair o fio a fio-rolha e inserir delicadamente o fio através do furo maior da ponta. Insira a extremidade unfunctionalized primeiro e puxe lentamente o fio através do furo menor até a parte de ouro é apenas além do furo maior.
   5. Solte suavemente 150 µ l do mix anticorpo (por exemplo, anti EpCAM_FITC anticorpo 01:20 diluído) na ponta. Para evitar o risco de formação de bolha, Gire suavemente o fio até a parte funcionalizada é completamente mergulhada.
   6. Selem o buraco da ponta. Envolvimento de filme de laboratório ao redor do buraco pode ajudar.
   7. Incube verticalmente O/N (~ 16 h) no escuro a 4 ° C.
4. 2º dia de imunofluorescência
   1. Bloquear a incubação do anticorpo lavando o fio duas vezes em 1 × PBS.
   2. Re-insira o fio em seu fio-rolha.
      Nota: Loja em 1 X PBS a 4 ° C em 5 mL de um frasco até que o ensaio de peixe é executado.
5. DNA-peixe 3D dia 2
   Atenção: Deve ser atenção especial para a alta temperatura da câmara húmida e instrumentos.
   1. Configurar o forno de hibridização e o calor seco (~ 3 h antes de iniciar o protocolo de DNA-peixe). Definir o forno de hibridização em 75 ° C, o forno de calor seco a 37 ° C e esfriar a solução SSC 0,4 × (pH = 7,0 ± 0,1) a 4 ° C.
      Nota: O status de pH de buffers de peixe é fundamental e deve ser 7,0 ± 0,1.
   2. Lave o fio 3 vezes gelada 0,4 × SSC solução.
      Nota: Mantenha o fio no escuro para evitar fluorocromo fotobranqueamento durante os procedimentos a seguir.
   3. Seco por 10 min no escuro sob a hotte.
   4. Vórtice e girar a sonda por 5 s.
   5. Caem 10 µ l da sonda ocopo microtubos. Cubra com filme de laboratório.
   6. Girar os microtubos da seguinte forma: envolva o microtubo em um seco colocar absorvente, papel para um tubo de 50 mL e girar brevemente.
   7. Cuidadosamente coloque o fio seco para o microtubo e inserir o fio-rolha. Selar com cimento de borracha.
      Atenção: Nas duas próximas etapas envolvem altas temperaturas.

Usando o procedimento descrito acima, é possível realizar um ensaio imuno-DNA peixe na CTC (ou outras células equivalentes), enriquecido pelo fio funcionalizado. Antes de configurar este protocolo, a compatibilidade das duas técnicas foi determinado (imuno-fluorescência com peixe) em suportes 2D padrão. Duas diferentes linhas de células CPNPC expressando EpCAM (necessário para aderir ao fio juntamente com anticorpos contra EpCAM) foram selecionadas. Eles têm um status diferente de ALK, que é útil para testar diferentes condições de partida. O primeiro, NCI-H1975, tem genes ALK tipo selvagem (WT), enquanto o segundo, NCI-H3122, caracteriza-se por translocações ALK.

Utilizou-se um sistema de detecção de ruptura-distante do gene ALK para o ensaio de peixe. O sistema consiste de duas sondas, uma (laranja) hybridizing à região proximal dentro ALK em 23 de p 2 e um (verde) hybridizing distal para ALK. Em suportes 2D, imuno-DNA peixe fornecido sinais bem definidos para ambos os anticorpos e sonda (Figura 2). Em particular, ambos células linhas mostrou a localização de membrana EpCAM bem definida. Além disso, os sinais de sonda apareceram claro e nítido: células NCI-H1975 mostraram a sobreposição de sondas laranja e verdes, confirmando o status de sua do gene ALK (Figura 2a, b). Por outro lado, células NCI-H3122 mostraram sinais sobrepostos e único pontos verdes, refletindo uma deleção do gene ALK (Figura 2-c, d). Quando o ensaio imuno-DNA de peixes foi realizado sobre o 3D suportam fio funcionalizado, anticorpo e sonda sinais eram geralmente menos definidos do que com o apoio 2D. EpCAM coloração era visível. ALK sonda sinais eram menos definidas, mas ainda reflete o status ALK esperado (Figura 3). Os resultados mostraram que mancha da imunofluorescência não interferiu com sinais de peixe de DNA. As sondas hibridizadas especificamente com seus alvos. Linhagem de células NCI-H3122 mostrou um status de gene ALK aberrante (Figura 3b), em contraste com NIC-H1975, com um gene ALK tipo selvagem (Figura 3a).

Figura 1 : Acrescida de fio, arranjo esquemático de sondas de pausa-distante de ALK, esquema de padrões esperados de rearranjo ALK e suporte especial. (um) vermelho caixas destacam as três principais partes do fio: acrescida de ponta, fio-rolha e ponta un-funcionalizada. A ponta funcionalizada é a parte mais delicada do fio e não deve ser tocada durante o manuseio para evitar o desprendimento de células ou danos. (b) as sondas verdes e vermelhas respectivamente ligam a sequências de upstream e downstream de Locus gene ALK (à esquerda). À direita, padrões ilustrativa dos arranjos de ALK são mostrados. Sinal de localização co vermelho e verde sobre as células normais; separados os sinais verdes e vermelhos indicam uma quebra de cromossomas gene ALK (translocação do gene ALK) e sinal de um verde-laranja colocalization (célula aberrante-1). Um sinal vermelho e dois sinais verdes indicam a perda de um sinal vermelho, sugerindo uma translocação cromossômica e uma exclusão (célula aberrante-2). (c) fio titular; caixas vermelhas destacam as áreas onde o cuidado é necessário ao manusear o fio durante a análise de microscopia. O fio pode sofrer uma análise de 360 °, girando o rotator. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Ensaio imuno-DNA peixe no suporte 2D (lamela). (a, b) ICN-H1975 células fracamente positivo para EpCAM. EpCAM FITC sinais eram apreciáveis. As sondas de laranja e verdes do ALK pausa-apart sobrepunham, confirmando o status WT do gene ALK em linhagem de células NCIH1975. Células exibindo mais de dois sinais emparelhados estiveram presentes devido à sua aneuploidia. (c, d) Na linha de célula EpCAM-expressando NCIH3122 alta, sinais de imunofluorescência foram brilhantes, que acentuou-se em junções célula-célula. PEIXE análises confirmadas deleções do gene ALK, típica desta linha de celular. Setas vermelhas indicam sondas verdes única (sem sondas laranja correspondentes), refletindo a supressão do gene ALK. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Peixe imuno-DNA do ensaio usando o fio funcionalizado como suporte 3D. (um) representante imagem de células NCI-H1975 no fio. Embora a forma 3D das células no fio tornam difícil adquirir imagens totalmente em foco, EpCAM sinal é bem visível em todas as células. imagem (b), representante das células NCI-H3122 no fio. Sondas ALK mostraram exclusão de gene (setas vermelhas), como já visto no suporte a 2D. Os sinais visíveis do fundo foram provavelmente devido à presença da camada de polímero. No entanto, isso não afetou significativamente análise de identificação ou fluorescência de célula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Receitas de soluções.

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.