Obtenção de DNA genômico de alta qualidade dos tecidos de tumor é um primeiro passo essencial para a análise de alterações genéticas, utilizando a próxima geração de sequenciamento. Neste artigo, apresentamos um método simples e rápido para enriquecer as células do tumor e obter DNA intacto do toque espécimes de citologia de impressão.
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Artigo de método
Método simples e rápido para obter alta qualidade Tumor DNA de espécimes clínico-patológica usando toque citologia de impressão
Neste artigo
Resumo
Resumo
É fundamental para determinar o status mutacional no câncer antes de administração e tratamento de drogas de alvo moleculares específicas para pacientes com câncer. Na prática clínica, fixada em formol parafina (FFPE) os tecidos são amplamente utilizados para testes genéticos. No entanto, FFPE DNA geralmente é danificado e fragmentada durante o processo de fixação com formol. Portanto, FFPE DNA não às vezes é adequada para testes genéticos por causa de baixa qualidade e quantidade de DNA. Aqui nós apresentamos um método de citologia de impressão de toque (TIC) para obter o DNA genômico de células de câncer, que pode ser observado sob um microscópio. Número de células de morfologia e câncer de células pode ser avaliado usando amostras TIC. Além disso, a extração de DNA genômico de amostras TIC pode ser concluída dentro de dois dias. O montante total e qualidade de TIC DNA obtido usando esse método foi maior do que a da FFPE DNA. Este método rápido e simples permite que os pesquisadores para obter DNA de qualidade para testes genéticos (por exemplo, análise de sequenciamento na próxima geração, digital PCR e PCR quantitativo em tempo real) e para encurtar o tempo de retorno para relatar os resultados.
Introdução
Próxima geração tecnologia de sequenciamento forneceu pesquisadores avanços significativos na análise da informação do genoma em variações genéticas, doença mendeliana, predisposição hereditária e câncer 1,2,3 . O Atlas de genoma do câncer (TCGA) e International Cancer Genome Consortium (ICGC) têm perseguido a identificação de alterações genéticas em diversos tipos de cancros comuns4. Centenas de genes de condutor essencial do câncer foram identificadas com êxito, e algumas destas moléculas são sendo direcionadas para o desenvolvimento de drogas a
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Protocolo
1. TIC preparação para avaliação microscópica rápida usando o vidro Normal desliza
- Execute a preparação de TIC logo que possível após materiais clínicos tecido patológico estão disponíveis. Se espécimes TIC não podem imediatamente ser preparados, mantenha os materiais de tecido cobertos com solução salina umedecida gaze estéril e guarde na geladeira para evitar a secagem de tecidos.
- Prepare-se 5 mm3 tecido material tais como tumores sólidos (por exemplo, fígado, pulmão e os tecidos da mama) clinicamente obtido por endoscopia ou cirurgia.
- Gentilmente Limpe o tecido com gaze estéril-revestido com soro fisiológico e remover....
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Resultados
A Figura 1 mostra todo o processo de preparar espécimes TIC para extração de DNA. Notavelmente, o procedimento leva apenas dois dias para obter o DNA genômico de amostras TIC. Nós avaliamos quaisquer efeitos do armazenamento do tumor antes do processamento do slide. Nós achamos que as células tumorais foram anexadas a lâmina de vidro quando as amostras de tecido foram tocadas imediatamente para o slide, e quando os tecidos foram mantidos em salina umedecido-g.......
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Discussão
Neste estudo, apresentamos um método alternativo para obtenção de tumor DNA de amostras clínicas patológicas, usando TIC. Preparação de TIC é muito simples e precisa de menos tempo em comparação com métodos FFPE, sem a exigência de instrumentos especiais10. Todos os procedimentos de preparação da TIC para extração de DNA podem ser concluídos dentro de dois dias (Figura 1). Esse método, portanto, encurta o tempo de retorno para a realização de testes genéticos. Notavel.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos a todo o pessoal médico e auxiliar do hospital e os pacientes para consentir a participar. Agradecemos a Gabrielle White Wolf, PhD, do grupo de Emilia (www.edanzediting.com/ac) para a edição de um projecto deste relatório. Este estudo foi suportado por um subsídio para o projeto de pesquisa do genoma da província de Yamanashi (YH e modus operandi) e uma subvenção da Fundação médica de The YASUDA (YH).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| FINE FROST white20 micro slide de vidro | Matsunami Glass ind, Ltd | SFF-011 | |
| Arcturus PEN Membrana Lâminas de Vidro | Thermo Fisher Scientific | LCM0522 | |
| Cyto Quick A solução | Muto Pure Chemicals | 20571 | |
| Cyto Quick B solução | Muto Pure Chemicals | 20581 | |
| May-Grunwald Solution | Muto Pure Chemicals | 15053 | |
| Giemsa solução | Muto Pure Chemicals | 15002 | |
| QIAamp DNA FFPE kit de tecido | Qiagen | 56404 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | |
| TaqMan RNase P Kit de Reagentes | de Detecção Thermo Fisher Scientific | 4316831 | |
| TaqMan Ensaio de FFPE DNA QC v2 | Placa | ||
| MicroAmp | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp Filme Adesivo Óptico | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | |
| MicroMixer E36 | TITEC | 0027765-000 | |
| ViiA 7 Sistema de PCR em Tempo Real | Thermo Fisher Scientific | VIIA7-03 | |
| Himac CF16RXII | Hitachi-koki | CF16RII | |
| Ion Library TaqMan Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | 4468802 | |
| Ion AmpliSeq v2 | Thermo Fisher Scientific | 4475346 | |
| Ion AmpliSeq 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Scientific 1-16 Kit | de Sequenciamento Thermo Fisher Scientific | 4471250 | |
| Ion PGM Hi-Q View (base 200) | Thermo Fisher Scientific | A30044 | |
| Ion Chef System | Thermo Fisher Scientific | 4484177 | |
| Veriti Termociclador de 96 poços | Thermo Fisher Scientific | Veriti200 | |
| Ion 318 Chip Kit v2 BC | Thermo Fisher Scientific | 4488150 | |
| Ion PGM System | Thermo Fisher Scientific | PGM11-001 | |
| Ion PGM Wash 2 Bottle kit | Thermo Fisher Scientific | A25591 | |
| Agencourt™ AMPure™ Kit XP | Beckman Coulter | A63881 | |
| Suporte Magnético de 16 posições | Thermo Fisher Scientific | 4457858 | |
| Antiaderente, Tubos Microfuge sem RNase, 1.5 mL (Tubo de baixa ligação) | Thermo Fisher Scientific | AM12450 | |
| Água livre de nuclease | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
| MicroAmp™ Placas de Reação Ópticas de 96 poços | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| MicroAmp™ Filme Adesivo Transparente | Thermo Fisher Scientific | 4306311 | |
| Agencourt™ AMPure™ Kit XP | Beckman Coulter | A63881 | |
| Etanol(99.5) | Nacalai Tesque | 08948-25 | |
| Hidróxido de sódio (10M) | Sigma | 72068 | |
| DTU-Neo | TAITEC | 0063286-000 | |
| E-36 | TAITEC | 0027765-000 | |
| ECLIPSE Ci-L | Nikon | 704354 | |
| Pipet-Lite LTS Pipeta L-2XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014393 | |
| Pipeta Pipet-Lite LTS L-10XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014388 | |
| Pipeta Pipet-Lite LTS L-20XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014392 | |
| Pipet-Lite LTS Pipeta L-100XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014384 | |
| Pipet-Lite LTS Pipeta L-200XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014391 | |
| Pipeta Pipet-Lite LTS L-1000XLS+ | METTLER TOLEDO | 17014382 | |
| petit-change | WAKEN | MODEL8864 | Mini centrífuga |
| petit-incubadora | WAKEN | WKN-2290 | Incubadora de ar |
| SensiCare Luvas de exame de nitrilo sem pó | MEDLINE | SEM486802 | |
| Gaze estéril | Osaki | 11138 | |
| Geladeira MediCool | SANYO | MPR-312DCN-PJ | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.130 | |
| FEATHER TRIMMING BLAD | FEATHER | No.260 | |
| FEATHER S | FEATHER | FA-10 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 41-0458 | Misturador de vórtice |
| Pincette | NATSUME | A-5 | |
| microtubo de 1,5 mL | BIOBIK | RC-0150 |
Referências
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The Path to Cancer - Three Strikes and You're Out. N Engl J Med. 373 (20), 1895-1898 (2015).
- Weinstein, J. N., et al. The cancer genome atlas pan-cancer analysis project. Nat. Genet. 45 (10), 1113-1120 (2013).
- Nagasaki, M., et al.
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Reimpressões e permissões
