Na Vivo Único-molécula de rastreamento no Terminal do nervo Motor pré-sináptica da drosófila

A comunicação baseia-se na liberação de neurotransmissores, que ocorre através da fusão regulamentada de neurotransmissor contendo vesículas sinápticas com a membrana plasmática¹. Este processo chamado exocitose^2,3,4,5,6 é altamente dinâmico e pode ser de cima - ou para baixo-regulado de acordo com as flutuações da taxa de estimulação⁷. As proteínas envolvidas nesses processos estão sujeitos a movimento browniano e, portanto, exibir nanoscópico organização capaz de sustentar uma gama de ações que sustentam essas funções fisiológicas de vinculação. Proteínas de membrana plasmática são altamente dinâmicas, permitindo o ajuste de registro lateral de moléculas em nanoclusters na membrana plasmática^{7,8,9,10,11, 12}. Como tal, investigando a mobilidade destas proteínas ajuda a elucidar o seu modo de ação⁸. Sinápticas proteínas como os solúvel N-proteà fator acessório proteína receptores (armadilhas), por exemplo Syntaxin-1A, são conhecidas por apresentar mobilidade rápida lateral, bem como lateral armadilhas dentro de nanoclusters que possam servir como molecular depósitos e sites para vesículas fusão^9,13,14,15.

O desenvolvimento recente de proteínas fluorescentes photoconvertible, tais como monomérico (m) Eos^16,17 e Kaede¹⁸, permitiu a resolução nanoscópico das proteínas de membrana de plasma neuronal através da utilização de abordagens tais como microscopia Localização foto-ativado (PALM) e reconstrução óptica estocástico microscopia (Tempestade)^14,15,19. Estes desenvolvimentos permitiram investigações sobre a mobilidade e a nanoclustering de proteínas biológicas em culturas de células vivas e os neurônios. Mais recentemente, têm sido realizados estudos para elucidar (em similares em alta resolução) a dinâmica e a organização destas proteínas de membrana nos neurônios de organismos vivos intactos tais Mus musculus, Caenorhabditis elegans e Melanogaster da drosófila^14,20,21,22.

Investigar a dinâmica e a organização de uma proteína na vivo requer não só a utilização das ferramentas de imagem recentemente desenvolvido Super-resolução (como fluorophores PALM, tempestade e photoconvertible), mas também a capacidade de superar obstáculos tais como a acessibilidade da proteína e a profundidade de penetração do laser de imagem. Imagem latente proteínas intracelulares em um animal intacto é inerentemente desafiadora como é imagem de proteínas em estruturas incorporadas profundamente dentro de tecidos vivos do animal intacto, tais como o hipocampo de um rato intacto. Portanto, proteínas sobre ou perto da superfície do tecido são mais facilmente fotografadas. Outra dificuldade com imagem latente na vivo é no sentido de garantir reprodutibilidade através de animais. Como a anatomia de uma amostra pode diferir para o outro, selecionar uma estrutura com facilidade de replicação em diferentes amostras animais intactas pode também constituir um desafio. O uso de estruturas estereotipadas, tais como as sinapses, ajudar a superar algumas destas dificuldades.

Estudos recentes têm fotografado mobilidade de proteína em animais com uma epiderme opticamente transparente como Caenorhabditis elegans²², enquanto outras investigações têm fotografado organização de proteína na superfície de um tecido/órgão, por exemplo imagem de actina em neurônios corticais através do crânio de um rato ao vivo²¹. Em alguns casos, anestésicos têm sido utilizados para manter o animal imóvel; no entanto, anestésicos específicos podem afetar adversamente a proteína de interesse. Meios alternativos para manter animais imóvel durante a imagem latente na vivo , portanto, devem ser explorados para minimizar o erro.

Outra ressalva a Super-resolução de imagem na vivo é que os lasers usados para iluminar as proteínas de interesse poderiam afetar adversamente o tecido circundante, e, portanto, manter a intensidade da excitação mais baixa possível é recomendado. Iluminação do tecido circundante pelo laser também tende a aumentar o sinal de fundo. O uso de intensidade baixa excitação ajuda a reduzir o plano de fundo, a advertência, sendo também pode levar a uma diminuição do rendimento de fóton de proteína fluorescente. Subtração de fundo durante a análise pode ser usada como um meio alternativo reduzir o sinal de fundo antes da análise de imagem.

Drosófila apresenta um organismo ideal para na vivo de imagens que fornece ferramentas de genéticas bem estabelecidas para a investigação da função da proteína específica. A sequência de ativação upstream (UAS)-sistema Gal4 permite a expressão temporal e espacial das proteínas e, portanto, pode ser usado para manipular a neurotransmissão²³, tal que estimulação thermo-genética utilizando drosófila transitória família de sub potenciais receptores A1 (dTRPA1)²⁴ ou estimulação opto-genética usando far-vermelhos-desloc CsChrimson²⁵ pode ser combinada com imagem¹⁴. Nós superaram muitas das complicações da realização na vivo de imagem único-molécula neste sistema e agora descrever como único-partícula de rastreamento pode ser realizado em Drosophila melanogaster terceiro ínstar larvas.

1. projeto de transgénicos Drosophila expressando proteínas mEos2-Tagged

1. Selecione a proteína a ser marcadas com a proteína mEos2. Para aumentar a taxa de sucesso de imagem, selecione proteínas com um domínio transmembrana na membrana neuronal de plasma¹⁴ (por exemplo, Syntaxin-1A), proteínas em vesículas sinápticas ou autophagosomes^26,27 (por exemplo, Synaptobrevin-2), ou proteínas cytosolic com estreita interação com a membrana plasmática neuronal proteínas (por exemplo, Munc18-1).
2. Construa transgenes codificação da proteína mEos2-Tag (Figura 1). Desenha os primers para diante e reversos para a proteína e o mEos2.
   Nota: A sequência de código de mEos2 pode ser amplificada do plasmídeo pmEos2-N1, destinada a fundir-se para o C-terminal da proteína de interesse. Clonagem por exemplo pode ser executada por recombinação em vivo em Saccharomyces cerevisiae utilizando o pFL44S-attB-MCS-w + vector^14,28, alternadamente, outros métodos de clonagem poderiam ser usados como Gibson montagem de protocolo²⁹.
   1. Linearizar o vetor com BamHI e XbaI e co se transformar em células de levedura ura3- juntamente com os fragmentos PCR codificação mEos2 e a proteína de interesse. Injete a construção para gerar uma linha de voar transgénicos³⁰embriões da drosófila .
3. Trás as culturas transgénicas voar no padrão médio de levedura e melaço ou algum outro substituto adequado contido em frascos de plástico. Para garantir razoavelmente grande e saudável boutons sináptica³¹, evitar superlotação moscas em frascos e flip moscas para novos frascos após cada dia de postura; Isso garante as terceiro ínstar larvas são bem alimentadas e atingem o tamanho adequado no momento que eles comecem a vaguear no meio. Elevar a voar transgénica à temperatura ambiente (25 ° C).
   Nota: Boutons sinápticas maiores tendem a produzir uma quantidade maior de proteínas visualizado durante a imagem latente.

2. dissecação de terceiro ínstar de Larva

1. Fazer um ≤20 base cilíndrica ou semicylindrical em forma de polidimetilsiloxano (PDMS) milímetros de diâmetro e ≤20 mm de altura, usando um kit de elastômero de silicone apropriado (Figura 2A). Misture o elastómero de silicone com um silicone de endurecimento agente na proporção de 10:1.
   1. Agite a mistura abundantemente durante 5 min. Despeje a mistura em um molde com o dimsensions listada acima. Deixe endurecer em estufa a 100 ° C, durante 45 min. A base PDMS irá servir como a base sobre a qual deseja realizar a dissecação. Garantir que a base PDMS caiba dentro do poço de um prato de cultura com fundo de vidro.
2. Selecione uma errante terceiro ínstar larva da parede do frasco. Use estéreo-microscópio óptico 4.5 ampliação para visualizar a larva colocada na base cilíndrica PDMS com o lado dorsal acima.
3. Uso em curva e angulado pinças para enfiar alfinetes de minutien na cabeça sobre os ganchos de boca, entre os dois estendendo espiráculos anteriores e na cauda sobre o ânus, entre os dois espiráculos posteriores. Adicione 40 µ l de meio inseto do Schneider em temperatura ambiente para a larva imobilizada.
   Nota: Hemolyph-como soluções (HL3 ou HL6) podem também ser utilizadas no lugar solução^{32,33 do Schneider}.
4. Fornece acesso através do lado dorsal da parede abdominal do corpo da larva pelo uso de um pino de minutien que faça uma incisão na linha média da parede.
5. Tesoura de mola de uso para cortar a parede do corpo aberto do ponto de incisão. Corte ao longo da linha mediana na direção ântero-posterior,³⁴.
6. Use a pinça fina e tesoura para desentranhar a larva de Primavera: remover os órgãos internos, incluindo as glândulas salivares, traqueia e intestino. Lave a larva duas vezes com o inseto médio do Schneider.
7. Com a pinça fina, segure as duas abas da parede do corpo suavemente esticá-los para fora e enfiar dois minutien pinos de cada lado. Isto deve produzir uma preparação em forma de hexágono (Figura 2A).
8. Desanexe o cérebro da medula nervosa ventral com uma tesoura de mola para diminuir a possibilidade de movimentos musculares durante a imagem latente; Isso também serve para segurar a preparação plano contra o prato da imagem latente. Use a pinça curvada para empurrar todos os seis pinos de minutien na base de PDMS.
   Nota: Apenas uma pequena parcela dos pinos deve ser incorporada dentro da parede abdominal.
9. Para confirmar que a larva tem sobrevivido o processo de dissecação, picar ligeiramente o cabo ventral do nervo, isto deve provocar uma contração peristáltica da parede abdominal larva.

3. ligeiramente oblíqua iluminação microscopia de rastreamento da único-partícula

1. Inverta a base de larva-PDMS dissecado em um prato de cultura com fundo de vidro. Encha o prato de imagem com 2 mL do meio do temperatura Schneider inseto (Figura 2B).
2. Localize os neurônios motores dos segundo e terceiro segmentos com sinapses em músculos abdominais 6 e 7³⁵ usando o x 63 / 1.2 objectivo de imersão de água at em um microscópio de fluorescência (TIRF) fluorescente reflexão interna total.
3. Use as oculares do microscópio para localizar a larva dissecada; Identifica o músculo 6 pelo uso de iluminação de campo claro.
4. Use o software de aquisição de microscópio (ver Tabela de materiais), na configuração TIRF; Deslize o ângulo da câmera colimador para 1° para aumentar a profundidade de penetração, senão sair o ângulo crítico TIRF para alcançar a iluminação oblíqua.
5. Liga o laser de 488 nm Visualizar mEos2 em verde. Usar um poder do laser de baixa (menos de 5% de 22,8 mW) para evitar o branqueamento a fluorescência verde. Localize as junções neuromusculares (que se parece com miçangas em uma cadeia de caracteres) e adquirir uma imagem TIRF de baixa resolução.
6. Simultaneamente ligar o laser 405 nm (mEos2 de photoconverts de verde a espécie vermelha) e o laser de nm (imagem do mEos2 de photoconverted vermelho) 561 estocàstica localizar proteínas fluorescentes mEos2 único.
   Nota: O uso de baixa potência de laser 405 nm é recomendado (0,005 a 0,9% de 4,78 mW), isto permite uma taxa relativamente constante de photoconversion durante a aquisição do filme. Uso entre 50 e 75% do laser 561 nm (20,1 mW), como este é suficiente para adquirir a fluorescência da espécie mEos2 vermelho sem adversamente afetar a morfologia do tecido muscular em torno da junção neuromuscular.
7. Para cada cadeia de junção neuromuscular, adquira um série composta de 15.000 quadros ou mais 33 Hz... salvar o formato as.czi para preservar os meta-dados que acompanha para possível referência de tempo.
8. Use o ImageJ para converter arquivos de filme '.czi' para '. TIFF' arquivos.
9. Analisar os filmes adquiridos com único-molécula adequado acompanhamento software analítico^11,14,36 , tais como TrackMate em FIJI/ImageJ³⁷ (ver Tabela de materiais). Localiza o 'x' e 'y' as coordenadas de cada localização pelo Gaussian ajuste do ponto de intensidade espalhar função (PSF).
   Nota: resolução de problemas: fluorescência verde não é observada ou é muito fraca na junção neuromuscular após a exposição ao laser 488 nm, brevemente em funcionamento com lasers de imagem e o photoconverting (405 nm e 561 nm), como o que ajuda a produzir mais do vermelho espécie de mEos2. Então volte ao laser 488 nm e levar uma imagem TIRF.

4. single-molécula localização em larvas fixas

1. Para medir o tamanho de nanocluster de proteína através do PALM, substitua o inseto médio a Schneider após a dissecação com um fixador - paraformaldeído 4% diluído em salina tamponada fosfato (PBS).
2. Incube a larva por 30 min à temperatura ambiente.
3. Remover a dissecação pinos e coloque a larva fixa em um 1,7 mL tubo de agarrar-fechamento microcentrifuga desobstruído.
4. Dissecar e fixa como muitas outras larvas conforme necessário, depois lavagem-os três vezes com PBS.
5. Substitua a PBS com buffer de bloco (uma solução de PBS, 0,1% Triton X-100 e 3% soro de cabra normal).
6. Lave as larvas com PBS três vezes e, em seguida, faça a incubação com o anticorpo primário necessário (diluído em solução-tampão de bloco).
7. Incubar durante a noite a 4 ^oC.
8. Lave as larvas três vezes com PBS e, em seguida, faça a incubação com o anticorpo secundário necessário (diluído em solução-tampão de bloco).
9. Lave as larvas três vezes com PBS, anexar a larva volta para a base PDMS e imagem conforme descrito anteriormente para rastreamento único-molécula.

Usando o protocolo transgénico listados acima, Syntaxin-1A-mEos2 Drosophilamelanogaster foram gerados (Figura 1). Transgênico terceiro estádio Drosophila larvas foram dissecadas na base cilíndrica PDMS (Fig. 2A-F). Para visualizar moléculas simples de Syntaxin-1A, usamos o PALM em um microscópio TIRF com iluminação de laser ligeiramente oblíqua14.

Moléculas simples de Syntaxin-1A foram seguidas nos terminais do nervo motor pré-sináptica no músculo 6 do segundo segmento abdominal. A fluorescência verde de mEos2 poderia ser detectada como mostra a imagem de baixa resolução de Syntaxin-1A-mEos2 na boutons de 1b do tipo quando animado usando o 488 nm laser (Figura 3A). Nas experiências de geração de imagens, a 405 nm e 561 nm da excitação do laser de imagem profundidades foram 133,5 nm e 165,6 nm, respectivamente. A imagem verde foi adquirida como uma média de 16 quadros individuais. Esta imagem verde foi usada para criar a região de interesse, usado para limitar a análise de suas localizações no filme photoconverted para os terminais de nervo motor pré-sináptica sozinhos.

A análise dos filmes sptPALM photoconverted adquirida gerou uma intensidade super resolvida, coeficiente de difusão, e trajetória de mapas (Figura 3A). Mobilidade Syntaxin-1A-mEos2 mais foi quantificada pela análise do deslocamento quadrático (MSD) das trajectórias individuais (Figura 3B). Comparações estatísticas podem ser feitas usando a área sob a curva MSD (Figura 3B). Uma análise mais aprofundada da mobilidade produz a distribuição do coeficiente de difusão de Syntaxin-1A-mEos2, e isto pode ser estatisticamente avaliado pela comparação do mobile para as populações de imóveis (Figura 3).

Figura 1 : Gerando construções com tag mEos2. O pFL44S-attB-MCS-w + vetor é linearizada com BamHI e XbaI. Codificação da proteína de interesse (POI) de fragmentos sobrepostos reação em cadeia da polimerase (PCR) e mEos2, respectivamente, podem ser clonados, por exemplo, por recombinação em vivo em ura3 - células de levedura ou pela Assembleia de Gibson. Observe que, para gerar o transgene Syntaxin-1A-mEos2, nós clonados a construção ladeada pelas sequências de promotor e terminator Syntaxin-1A endógenas. A construção resultante pode ser posteriormente injetada embriões da drosófila para criar uma linha de mosca transgênica expressando a proteína de interesse (POI) fundida-se para mEos2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Drosophila dissecção de larva e iluminação oblíqua. (A) esquema mostrando a dissecação de larva de drosófila realizada na base PDMS meia-cilíndrica. Realizou-se uma larva em filetes para os PDMS do gel pelo uso dos pinos de minutien. (B-C) A preparação de larva-PDMS foi colocada dentro de um prato de cultura com fundo de vidro contendo meio de Schneider inseto. Um microscópio TIRF em uma configuração de iluminação ligeiramente oblíqua foi usado para visualizar Syntaxin-1A-mEos2 nos terminais de nervos motores. (D-F) Uma base PDMS meia-cilíndrica com larvas de Drosophila dissecada. A preparação de larva-PDMS foi colocada em um prato de imagem preenchido com meio de Schneider e a larva foi fotografada no microscópio Super-resolução PALM. Barra de escala, 10 mm. (este valor foi modificado de14). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Na vivo rastreamento de Syntaxin-1A-mEos2 o nervo motor pré-sináptica terminal. (A), A baixa resolução TIRF imagem de Syntaxin-1A-mEos2 em uma tipo 1b nervosa motora terminal. Análise de filmes photoconversion fotografada em 33 Hz gerado sptPALM intensidade super resolvido, coeficiente de difusão e trajetória mapas. 5.309 trajetórias individuais foram imagem aquisição de filme de mais de 16.000 quadros. Barra de escala, 3 μm. (B-C) Deslocamento de quadrático (MSD) de Syntaxin-1A-mEos2 foi plotado de 6 terminais de nervos motores diferentes; área sob a curva MSD (AUC) foi utilizada para quantificar o nível de mobilidade. A distribuição do coeficiente de difusão revela populações de Syntaxin-1A móveis e imóveis que possam ser quantificadas como rácios do outro; uma média de 2.400 ~ trajetórias foram obtidos por terminal do nervo motor (n = 3 larvas). Os dados apresentados como médio erro-padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada para divulgar.