Na Vivo Único-molécula de rastreamento no Terminal do nervo Motor pré-sináptica da drosófila

Rastreamento in vivo de molécula única no terminal nervoso motor pré-sináptico de Drosophila. Esta técnica descreve como proteínas únicas podem ser rastreadas e visualizadas in vivo nos terminais nervosos motores de larvas de Drosophila de terceiro ínstar. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite que proteínas únicas sejam visualizadas, rastreadas e localizadas em altas resoluções semelhantes às observadas em sistemas in vitro.

Desenho de Drosophila transgênica. A proteína sináptica de interesse é marcada com um fluoróforo fotoconversível, e isso é expresso em Drosophila melanogaster. Dissecção da larva de Drosophila de terceiro ínstar.

Coloque uma larva errante de terceiro ínstar em uma base de Sylgard cilíndrica ou semicilíndrica. Adicione 40 microlitros de meio de inseto de Schneider na larva. Sob um microscópio de dissecação, enfie um alfinete minucienal na cabeça e outro na cauda da larva para imobilizá-la.

Para fornecer acesso, use um pino minuciano para fazer uma incisão estreita na linha média do lado dorsal da região abdominal da larva. A partir deste ponto de incisão, com tesoura de mola, corte ao longo da parede do corpo no sentido ântero-posterior. Remova os órgãos internos da larva com o auxílio de uma pinça fina e uma tesoura de mola.

Lave a larva dissecada com o meio de insetos de Schneider. Cole dois pinos minucianos em cada uma das duas abas da parede do corpo para produzir uma preparação de larva dissecada em forma de hexágono. Use uma tesoura de mola para separar o cérebro da larva do cordão nervoso ventral.

Usando uma pinça curva, empurre os pinos minucianos na base Sylgard. Microscopia de localização fotoativada de rastreamento de partícula única. Inverta a base Sylgard da larva em um prato de cultura com fundo de vidro cheio de dois mililitros de meio de inseto de Schneider em temperatura ambiente.

Aplique água na objetiva de imersão em água 63x de um microscópio ELYRA PS.1 e, em seguida, coloque o prato no palco. Ligue a luz transmitida e use a ocular para localizar a larva na base Sylgard com o auxílio da objetiva de ar 10x. Mude para a objetiva de imersão em água 63x e identifique o músculo seis, usando iluminação de campo brilhante.

Usando o software de aquisição ZEN Black, selecione a configuração Total Internal Reflection Fluorescence, TIRF. Mude o laser de 488 nanômetros para visualizar o eMos2 em verde. Localize as junções neuromusculares, que se parecem com contas em uma corda, e adquira uma imagem TIRF de baixa resolução, ligue simultaneamente o laser de 405 nanômetros e o laser de 561 nanômetros para fotoconverter e obter imagens de espécies vermelhas de eMos2.

Utilize uma potência de laser muito baixa para o laser de 405 nanômetros para permitir fotoconversões estocásticas moderadamente constantes. Aqui, um laser de 405 nanômetros é operado a 0,09%, enquanto um laser de 561 nanômetros é operado a 50% Nas opções de ângulo TIRF no software, deslize levemente o ângulo crítico TIRF. Defina o tempo de exposição em 30 milissegundos.

Adquira uma série temporal de imagens da junção neuromuscular. Aqui, um filme de 15.000 quadros foi adquirido. Salve o filme como um arquivo no formato czi.

análise de dados. Analise os filmes adquiridos com um software analítico de rastreamento molecular único adequado. Localize as coordenadas x e y de cada localização de proteína fluorescente pelo ajuste gaussiano da função de propagação do ponto de intensidade.

Para traçar a trajetória de cada localização, defina um limite de no mínimo oito aparências de quadro diferentes contínuas para cada localização e um máximo de três pixels de mobilidade entre cada quadro. Obtenha a imagem da trajetória, o deslocamento quadrado médio, bem como o coeficiente de difusão de todas as localizações rastreadas. Resultados representativos.

O deslocamento quadrático médio das trajetórias individuais de Syntaxin-1A-eMos2 de múltiplas junções neuromusculares em três larvas diferentes foi plotado, como média mais menos erro padrão da média. A área sob a curva quadrada média de deslocamento também foi plotada. O coeficiente de difusão da Sintaxina-1A-mEos2 foi obtido de forma semelhante a partir de múltiplas junções neuromusculares e plotado como um histograma da distribuição de frequência relativa.

O limiar do coeficiente de difusão revelou duas populações de Syntaxin-1A, uma população móvel e uma população imóvel. A razão entre as populações móveis e imóveis de Syntaxin-1A-mEos2 foi calculada. Conclusão. Este vídeo deve fornecer uma compreensão sobre como o rastreamento de proteína única pode ser realizado na junção neuromuscular das larvas de Drosophila.

A técnica fornece uma maneira para os pesquisadores no campo da comunicação neuronal visualizarem e observarem a mobilidade e a organização de proteínas individuais em altas resoluções in vivo.