Name: Na Vivo Único-molécula de rastreamento no Terminal do nervo Motor pré-sináptica da drosófila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Aprenda rastreamento de moléculas únicas in vivo usando PALM em terminais nervosos motores pré-sinápticos de larvas de Drosophila melanogaster. Esta técnica permite visualizar a dinâmica de proteínas sinápticas com alta resolução.

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Agradecemos a Jean-Baptiste Sibarita e Daniel Choquet (IINS, CNRS/Universidade de Bordeaux) por seu apoio gentil com a análise de único-molécula. Agradecemos especialmente Nick Valmas e Jessica Mcgaw (QBI, Universidade de Queensland) por sua ajuda com o vídeo, gravação de voz-over, bem como design gráfico de figura. Este trabalho foi financiado pelo projecto de descoberta de Conselho de pesquisa australiano (AR) (DP170100125 a F.A.M.), o Conselho australiano de pesquisa (LIEF Grant LE0882864 a F.A.M.), futuro Fellowship (FT100100725 a B.V.S.), Australian Research Council (LIEF Grant LE130100078 a F.A.M.) e projeto NHMRC conceder (APP1103923 a B.V.S.). F.A.M. é um NHMRC Senior Research Fellow (ONT1060075).

1. projeto de transgénicos Drosophila expressando proteínas mEos2-Tagged
<ol><li>Selecione a proteína a ser marcadas com a proteína mEos2. Para aumentar a taxa de sucesso de imagem, selecione proteínas com um domínio transmembrana na membrana neuronal de plasma14 (por exemplo, Syntaxin-1A), proteínas em vesículas sinápticas ou autophagosomes26,27 (por exemplo, Synaptobrevin-2), ou proteínas cytosolic com estreita interação com a membrana plasmática neuronal proteínas (por exemplo, Munc18-1).</li>
	<li>Construa transgenes codificação da proteína mEos2-Tag (Figura 1). Desenha os primers para diante e reversos para a proteína e o mEos2. Nota: A sequência de código de mEos2 pode ser amplificada do plasmídeo pmEos2-N1, destinada a fundir-se para o C-terminal da proteína de interesse. Clonagem por exemplo pode ser executada por recombinação em vivo em Saccharomyces cerevisiae utilizando o pFL44S-attB-MCS-w + vector14,28, alternadamente, outros métodos de clonagem poderiam ser usados como Gibson montagem de protocolo29.<ol>
<li>Linearizar o vetor com BamHI e XbaI e co se transformar em células de levedura ura3- juntamente com os fragmentos PCR codificação mEos2 e a proteína de interesse. Injete a construção para gerar uma linha de voar transgénicos30embriões da drosófila .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trás as culturas transgénicas voar no padrão médio de levedura e melaço ou algum outro substituto adequado contido em frascos de plástico. Para garantir razoavelmente grande e saudável boutons sináptica31, evitar superlotação moscas em frascos e flip moscas para novos frascos após cada dia de postura; Isso garante as terceiro ínstar larvas são bem alimentadas e atingem o tamanho adequado no momento que eles comecem a vaguear no meio. Elevar a voar transgénica à temperatura ambiente (25 ° C). Nota: Boutons sinápticas maiores tendem a produzir uma quantidade maior de proteínas visualizado durante a imagem latente.</li>
</ol>2. dissecação de terceiro ínstar de Larva
<ol><li>Fazer um ≤20 base cilíndrica ou semicylindrical em forma de polidimetilsiloxano (PDMS) milímetros de diâmetro e ≤20 mm de altura, usando um kit de elastômero de silicone apropriado (Figura 2A). Misture o elastómero de silicone com um silicone de endurecimento agente na proporção de 10:1.<ol>
<li>Agite a mistura abundantemente durante 5 min. Despeje a mistura em um molde com o dimsensions listada acima. Deixe endurecer em estufa a 100 ° C, durante 45 min. A base PDMS irá servir como a base sobre a qual deseja realizar a dissecação. Garantir que a base PDMS caiba dentro do poço de um prato de cultura com fundo de vidro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecione uma errante terceiro ínstar larva da parede do frasco. Use estéreo-microscópio óptico 4.5 ampliação para visualizar a larva colocada na base cilíndrica PDMS com o lado dorsal acima.</li>
	<li>Uso em curva e angulado pinças para enfiar alfinetes de minutien na cabeça sobre os ganchos de boca, entre os dois estendendo espiráculos anteriores e na cauda sobre o ânus, entre os dois espiráculos posteriores. Adicione 40 µ l de meio inseto do Schneider em temperatura ambiente para a larva imobilizada. Nota: Hemolyph-como soluções (HL3 ou HL6) podem também ser utilizadas no lugar solução32,33 do Schneider.</li>
	<li>Fornece acesso através do lado dorsal da parede abdominal do corpo da larva pelo uso de um pino de minutien que faça uma incisão na linha média da parede.</li>
	<li>Tesoura de mola de uso para cortar a parede do corpo aberto do ponto de incisão. Corte ao longo da linha mediana na direção ântero-posterior,34.</li>
	<li>Use a pinça fina e tesoura para desentranhar a larva de Primavera: remover os órgãos internos, incluindo as glândulas salivares, traqueia e intestino. Lave a larva duas vezes com o inseto médio do Schneider.</li>
	<li>Com a pinça fina, segure as duas abas da parede do corpo suavemente esticá-los para fora e enfiar dois minutien pinos de cada lado. Isto deve produzir uma preparação em forma de hexágono (Figura 2A).</li>
	<li>Desanexe o cérebro da medula nervosa ventral com uma tesoura de mola para diminuir a possibilidade de movimentos musculares durante a imagem latente; Isso também serve para segurar a preparação plano contra o prato da imagem latente. Use a pinça curvada para empurrar todos os seis pinos de minutien na base de PDMS. Nota: Apenas uma pequena parcela dos pinos deve ser incorporada dentro da parede abdominal.</li>
	<li>Para confirmar que a larva tem sobrevivido o processo de dissecação, picar ligeiramente o cabo ventral do nervo, isto deve provocar uma contração peristáltica da parede abdominal larva.</li>
</ol>3. ligeiramente oblíqua iluminação microscopia de rastreamento da único-partícula
<ol><li>Inverta a base de larva-PDMS dissecado em um prato de cultura com fundo de vidro. Encha o prato de imagem com 2 mL do meio do temperatura Schneider inseto (Figura 2B).</li>
	<li>Localize os neurônios motores dos segundo e terceiro segmentos com sinapses em músculos abdominais 6 e 735 usando o x 63 / 1.2 objectivo de imersão de água at em um microscópio de fluorescência (TIRF) fluorescente reflexão interna total.</li>
	<li>Use as oculares do microscópio para localizar a larva dissecada; Identifica o músculo 6 pelo uso de iluminação de campo claro.</li>
	<li>Use o software de aquisição de microscópio (ver Tabela de materiais), na configuração TIRF; Deslize o ângulo da câmera colimador para 1° para aumentar a profundidade de penetração, senão sair o ângulo crítico TIRF para alcançar a iluminação oblíqua.</li>
	<li>Liga o laser de 488 nm Visualizar mEos2 em verde. Usar um poder do laser de baixa (menos de 5% de 22,8 mW) para evitar o branqueamento a fluorescência verde. Localize as junções neuromusculares (que se parece com miçangas em uma cadeia de caracteres) e adquirir uma imagem TIRF de baixa resolução.</li>
	<li>Simultaneamente ligar o laser 405 nm (mEos2 de photoconverts de verde a espécie vermelha) e o laser de nm (imagem do mEos2 de photoconverted vermelho) 561 estocàstica localizar proteínas fluorescentes mEos2 único. Nota: O uso de baixa potência de laser 405 nm é recomendado (0,005 a 0,9% de 4,78 mW), isto permite uma taxa relativamente constante de photoconversion durante a aquisição do filme. Uso entre 50 e 75% do laser 561 nm (20,1 mW), como este é suficiente para adquirir a fluorescência da espécie mEos2 vermelho sem adversamente afetar a morfologia do tecido muscular em torno da junção neuromuscular.</li>
	<li>Para cada cadeia de junção neuromuscular, adquira um série composta de 15.000 quadros ou mais 33 Hz... salvar o formato as.czi para preservar os meta-dados que acompanha para possível referência de tempo.</li>
	<li>Use o ImageJ para converter arquivos de filme '.czi' para '. TIFF' arquivos.</li>
	<li>Analisar os filmes adquiridos com único-molécula adequado acompanhamento software analítico11,14,36 , tais como TrackMate em FIJI/ImageJ37 (ver Tabela de materiais). Localiza o 'x' e 'y' as coordenadas de cada localização pelo Gaussian ajuste do ponto de intensidade espalhar função (PSF). Nota: resolução de problemas: fluorescência verde não é observada ou é muito fraca na junção neuromuscular após a exposição ao laser 488 nm, brevemente em funcionamento com lasers de imagem e o photoconverting (405 nm e 561 nm), como o que ajuda a produzir mais do vermelho espécie de mEos2. Então volte ao laser 488 nm e levar uma imagem TIRF.</li>
</ol>4. single-molécula localização em larvas fixas
<ol><li>Para medir o tamanho de nanocluster de proteína através do PALM, substitua o inseto médio a Schneider após a dissecação com um fixador - paraformaldeído 4% diluído em salina tamponada fosfato (PBS).</li>
	<li>Incube a larva por 30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Remover a dissecação pinos e coloque a larva fixa em um 1,7 mL tubo de agarrar-fechamento microcentrifuga desobstruído.</li>
	<li>Dissecar e fixa como muitas outras larvas conforme necessário, depois lavagem-os três vezes com PBS.</li>
	<li>Substitua a PBS com buffer de bloco (uma solução de PBS, 0,1% Triton X-100 e 3% soro de cabra normal).</li>
	<li>Lave as larvas com PBS três vezes e, em seguida, faça a incubação com o anticorpo primário necessário (diluído em solução-tampão de bloco).</li>
	<li>Incubar durante a noite a 4 oC.</li>
	<li>Lave as larvas três vezes com PBS e, em seguida, faça a incubação com o anticorpo secundário necessário (diluído em solução-tampão de bloco).</li>
	<li>Lave as larvas três vezes com PBS, anexar a larva volta para a base PDMS e imagem conforme descrito anteriormente para rastreamento único-molécula.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo descreve rastreamento único-molécula de proteínas mEos2-etiquetadas na junção neuromuscular da drosófila terceiro ínstar larva. Para evitar a sobre-expressão da proteína transgénica, Syntaxin-1A-mEos2 expressão foi guiado por promotor endógeno de Syntaxin-1A. Estudos de mobilidade de proteína sináptica na maior parte foram limitados às investigações em vitro de culturas de células e neurônios corticais9,11,12,13. Se estas proteínas apresentam assinaturas semelhantes de mobilidade em um animal vivo é desconhecida. Para visualizar a mobilidade de single-proteína na vivo, limitações, tais como a profundidade de penetração, acessibilidade e transparência óptica têm que ser superados. Dissecando a preparação larval e visualizando as junções neuromusculares incorporadas na superfície do músculo, evitamos a questão da transparência óptica e acessibilidade. Tentativas de mobilidade de único-molécula imagem na configuração normal TIRF provou ser um fracasso. No entanto, o uso de iluminação ligeiramente oblíqua permite para laser de excitação maior profundidade de penetração. Além disso, os pinos de minutien usados para imobilizar a larva ajudaram a evitar qualquer possível efeito adverso do uso anestésico na mobilidade de proteína. É possível usar mais elevados objectivos de ampliação, tais como a 100x objectivos de imersão de óleo, para visualizar moléculas simples em vivo. No entanto, maior ampliação pode aumentar a ocorrência de deriva fora de foco. Além disso, nós usamos uma intensidade mais baixa (~ 30%) 561 nm laser com êxito para moléculas simples de imagem nos terminais do nervo motor. Testes adicionais podem ser obrigado a usar a menor potência de laser.
Este protocolo é apropriado para visualizar a mobilidade das proteínas sinápticas dentro a proximidade da membrana plasmática neuronal. Usando essa abordagem, a mobilidade das proteínas SNARE - Syntaxin-1A e o autophagosome ligado a proteína Atg18a - foram com êxito a imagem em vivo14,26. A mobilidade das proteínas em neurônio motor axônios também podem ser investigado27. No entanto, a investigação da mobilidade de proteínas no cérebro ou cordão nervoso ventral pode revelar-se difícil avaliar devido o sinal de fundo elevado produzido pelo tecido subjacente; Além disso, visualizando a mobilidade de proteína na estrutura do cérebro mesmo exigirá a marcação fluorescente a estrutura do cérebro (para garantir a replicabilidade) e uso de imagem de câmera dupla seria necessário.
Métodos atuais disponíveis para microscopia de super-resolução em Drosophila limitam-se principalmente aos embriões de imagens, em vez do mais desenvolveram de terceiro ínstar larva38,39. O principal problema com estes protocolos é que eles produzem um número baixo de trajetórias na área de criação da imagem e, portanto, evitar a análise aprofundada de mobilidade Estados22,40. Nossa na vivo única molécula protocolo de rastreamento tem a capacidade de gerar um elevado número de trajetórias e, portanto, poderia ser usada em outros modelos animais como Caenorhabiditis elegans e zebrafish. Com efeito, cada cadeia MNJ gerados 2.400 ~ trajetórias, tornando-o adequado para analisar os diferentes Estados móveis e as transições entre esses Estados14,27. Além disso, muitos na vivo estratégias de imagem-única molécula contam com o uso de anestésicos para imobilizar os animais20,22, que pode alterar a função fisiológica, sob a qual a imagem é feita. Aqui nós aperfeiçoamos um protocolo 'anestesia-free' para imobilizar as larvas usando pinos minutien.
Um uso potencial do presente protocolo pode ser para poder visualizar a mobilidade das proteínas em três dimensões. Recentes avanços na microscopia de super-resolução permitem mobilidade de proteína ser visualizado em vitro no 'x', 'y' e 'z' dimensões41,42. Nosso método atual não leva em conta a mobilidade das proteínas no eixo 'z'. Ainda o drosófila terminal nervoso motor é uma estrutura esférica e uma abordagem valiosa do futura será para quantificar a mobilidade de proteína em um volume tridimensional,43. Imagem latente na dimensão z é viável usando uma lente astigmático. Alternativamente, em TIRF modo44,45, o z-resolução também é aumentado. No entanto, em nossos experimentos, nós usamos iluminação ligeiramente oblíqua para visualizar moléculas simples de syntaxin1A-mEos2 sem a lente astigmática.
Em conclusão, a disponibilidade de ambos um transgénico Drosophila voar estoque expressando proteínas marcados com uma proteína photoconvertible, uma base de PDMS para dissecar a larva transgênica, bem como um microscópio TIRF equipado com a possibilidade de mudar o ângulo de iluminação são as mais importantes ferramentas necessárias para visualizar proteínas única conforme descrito neste protocolo.

A comunicação baseia-se na liberação de neurotransmissores, que ocorre através da fusão regulamentada de neurotransmissor contendo vesículas sinápticas com a membrana plasmática1. Este processo chamado exocitose2,3,4,5,6 é altamente dinâmico e pode ser de cima - ou para baixo-regulado de acordo com as flutuações da taxa de estimulação7. As proteínas envolvidas nesses processos estão sujeitos a movimento browniano e, portanto, exibir nanoscópico organização capaz de sustentar uma gama de ações que sustentam essas funções fisiológicas de vinculação. Proteínas de membrana plasmática são altamente dinâmicas, permitindo o ajuste de registro lateral de moléculas em nanoclusters na membrana plasmática7,8,9,10,11, 12. Como tal, investigando a mobilidade destas proteínas ajuda a elucidar o seu modo de ação8. Sinápticas proteínas como os solúvel N-proteÃ fator acessório proteína receptores (armadilhas), por exemplo Syntaxin-1A, são conhecidas por apresentar mobilidade rápida lateral, bem como lateral armadilhas dentro de nanoclusters que possam servir como molecular depósitos e sites para vesículas fusão9,13,14,15.
O desenvolvimento recente de proteínas fluorescentes photoconvertible, tais como monomérico (m) Eos16,17 e Kaede18, permitiu a resolução nanoscópico das proteínas de membrana de plasma neuronal através da utilização de abordagens tais como microscopia Localização foto-ativado (PALM) e reconstrução óptica estocástico microscopia (Tempestade)14,15,19. Estes desenvolvimentos permitiram investigações sobre a mobilidade e a nanoclustering de proteínas biológicas em culturas de células vivas e os neurônios. Mais recentemente, têm sido realizados estudos para elucidar (em similares em alta resolução) a dinâmica e a organização destas proteínas de membrana nos neurônios de organismos vivos intactos tais Mus musculus, Caenorhabditis elegans e Melanogaster da drosófila14,20,21,22.
Investigar a dinâmica e a organização de uma proteína na vivo requer não só a utilização das ferramentas de imagem recentemente desenvolvido Super-resolução (como fluorophores PALM, tempestade e photoconvertible), mas também a capacidade de superar obstáculos tais como a acessibilidade da proteína e a profundidade de penetração do laser de imagem. Imagem latente proteínas intracelulares em um animal intacto é inerentemente desafiadora como é imagem de proteínas em estruturas incorporadas profundamente dentro de tecidos vivos do animal intacto, tais como o hipocampo de um rato intacto. Portanto, proteínas sobre ou perto da superfície do tecido são mais facilmente fotografadas. Outra dificuldade com imagem latente na vivo é no sentido de garantir reprodutibilidade através de animais. Como a anatomia de uma amostra pode diferir para o outro, selecionar uma estrutura com facilidade de replicação em diferentes amostras animais intactas pode também constituir um desafio. O uso de estruturas estereotipadas, tais como as sinapses, ajudar a superar algumas destas dificuldades.
Estudos recentes têm fotografado mobilidade de proteína em animais com uma epiderme opticamente transparente como Caenorhabditis elegans22, enquanto outras investigações têm fotografado organização de proteína na superfície de um tecido/órgão, por exemplo imagem de actina em neurônios corticais através do crânio de um rato ao vivo21. Em alguns casos, anestésicos têm sido utilizados para manter o animal imóvel; no entanto, anestésicos específicos podem afetar adversamente a proteína de interesse. Meios alternativos para manter animais imóvel durante a imagem latente na vivo , portanto, devem ser explorados para minimizar o erro.
Outra ressalva a Super-resolução de imagem na vivo é que os lasers usados para iluminar as proteínas de interesse poderiam afetar adversamente o tecido circundante, e, portanto, manter a intensidade da excitação mais baixa possível é recomendado. Iluminação do tecido circundante pelo laser também tende a aumentar o sinal de fundo. O uso de intensidade baixa excitação ajuda a reduzir o plano de fundo, a advertência, sendo também pode levar a uma diminuição do rendimento de fóton de proteína fluorescente. Subtração de fundo durante a análise pode ser usada como um meio alternativo reduzir o sinal de fundo antes da análise de imagem.
Drosófila apresenta um organismo ideal para na vivo de imagens que fornece ferramentas de genéticas bem estabelecidas para a investigação da função da proteína específica. A sequência de ativação upstream (UAS)-sistema Gal4 permite a expressão temporal e espacial das proteínas e, portanto, pode ser usado para manipular a neurotransmissão23, tal que estimulação thermo-genética utilizando drosófila transitória família de sub potenciais receptores A1 (dTRPA1)24 ou estimulação opto-genética usando far-vermelhos-desloc CsChrimson25 pode ser combinada com imagem14. Nós superaram muitas das complicações da realização na vivo de imagem único-molécula neste sistema e agora descrever como único-partícula de rastreamento pode ser realizado em Drosophila melanogaster terceiro ínstar larvas.

<table><tbody><tr><td>PDMS (kit de elastômero de silicone Sylgard 184)</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>000000000001064291</td><td></td></tr><tr><td>Prato de Cultura com Fundo de Vidro</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D29-20-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Óptico Estereo-microscópio</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Pinças Curvas (Estilo 5/45)</td>Pinos Minutien <td>de Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>0208-5AC-PO</td><td></td></tr><tr><td>(0.1mm)</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Schneider's Insect Medium</td><td>Sigma, Ciências da Vida</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Mola Vannas</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Fina (Dumont #5)</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>ELYRA PS.1 Microscópio</td><td>Zeiss</td><td>PS.1</td><td></td></tr><tr><td>Tamponado com Fosfato Salino (PBS)</td><td>Lonza</td><td>17-515Q</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (16%)Ciências de</td> <td>Microscopia Eletrônica</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Cabra Normal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Maxyclear snaplock microcentrífuga Tubo (1,7 mL)</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Zen Black software de aquisição</td><td>Carl Zeiss, 2012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph software</td><td>Molecular Devices</td><td>7.7.8</td><td>PALM Tracer Plugin</td></tr><tr><td>Fly strain</td><td></td><td>w1118; HA-Sx1A-mEos2</td><td></td></tr></tbody></table>

na vivo Único-molécula de rastreamento no terminal do nervo motor pré-sináptica da drosófila

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Um número crescente de técnicas de microscopia de super-resolução está ajudando a desvendar os mecanismos que regem o mundo celular nanoescala. Imagem de único-molécula está ganhando força como ele fornece acesso excepcional para a visualização de moléculas individuais em pilhas vivas. Aqui, descrevemos uma técnica que desenvolvemos para executar o rastreamento da único-partícula microscopia de Localização foto-ativado (sptPALM) em larvas de Drosophila . Comunicação sináptica se baseia em proteínas pré-sináptica chaves que atuam por encaixe, primer e promover a fusão do neurotransmissor contendo vesículas com a membrana plasmática. Uma gama de interações proteína-proteína e proteína-lipídio firmemente regula esses processos e as proteínas pré-sináptica, portanto, apresentam alterações na mobilidade associada com cada um desses eventos chaves. Investigar como mobilidade destas proteínas correlaciona-se com sua função fisiológica em um animal vivo intacta é essencial para a compreensão de seu mecanismo preciso de ação. Extração de mobilidade de proteína com alta resolução na vivo requer superar limitações como transparência óptica, acessibilidade e profundidade de penetração. Descrevemos como photoconvertible proteínas fluorescentes marcadas à pré-sináptica proteína Syntaxin-1A pode ser visualizado através de ligeira iluminação oblíqua e rastreadas no terminal do nervo motor ou ao longo do axônio do neurônio motor do terceiro ínstar drosófila larva.

Usando o protocolo transgénico listados acima, Syntaxin-1A-mEos2 Drosophilamelanogaster foram gerados (Figura 1). Transgênico terceiro estádio Drosophila larvas foram dissecadas na base cilíndrica PDMS (Fig. 2A-F). Para visualizar moléculas simples de Syntaxin-1A, usamos o PALM em um microscópio TIRF com iluminação de laser ligeiramente oblíqua14.
Moléculas simples de Syntaxin-1A foram seguidas nos terminais do nervo motor pré-sináptica no músculo 6 do segundo segmento abdominal. A fluorescência verde de mEos2 poderia ser detectada como mostra a imagem de baixa resolução de Syntaxin-1A-mEos2 na boutons de 1b do tipo quando animado usando o 488 nm laser (Figura 3A). Nas experiências de geração de imagens, a 405 nm e 561 nm da excitação do laser de imagem profundidades foram 133,5 nm e 165,6 nm, respectivamente. A imagem verde foi adquirida como uma média de 16 quadros individuais. Esta imagem verde foi usada para criar a região de interesse, usado para limitar a análise de suas localizações no filme photoconverted para os terminais de nervo motor pré-sináptica sozinhos.
A análise dos filmes sptPALM photoconverted adquirida gerou uma intensidade super resolvida, coeficiente de difusão, e trajetória de mapas (Figura 3A). Mobilidade Syntaxin-1A-mEos2 mais foi quantificada pela análise do deslocamento quadrático (MSD) das trajectórias individuais (Figura 3B). Comparações estatísticas podem ser feitas usando a área sob a curva MSD (Figura 3B). Uma análise mais aprofundada da mobilidade produz a distribuição do coeficiente de difusão de Syntaxin-1A-mEos2, e isto pode ser estatisticamente avaliado pela comparação do mobile para as populações de imóveis (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig1.jpg"> Figura 1 : Gerando construções com tag mEos2. O pFL44S-attB-MCS-w + vetor é linearizada com BamHI e XbaI. Codificação da proteína de interesse (POI) de fragmentos sobrepostos reação em cadeia da polimerase (PCR) e mEos2, respectivamente, podem ser clonados, por exemplo, por recombinação em vivo em ura3 - células de levedura ou pela Assembleia de Gibson. Observe que, para gerar o transgene Syntaxin-1A-mEos2, nós clonados a construção ladeada pelas sequências de promotor e terminator Syntaxin-1A endógenas. A construção resultante pode ser posteriormente injetada embriões da drosófila para criar uma linha de mosca transgênica expressando a proteína de interesse (POI) fundida-se para mEos2. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig2.jpg"> Figura 2 : Drosophila dissecção de larva e iluminação oblíqua. (A) esquema mostrando a dissecação de larva de drosófila realizada na base PDMS meia-cilíndrica. Realizou-se uma larva em filetes para os PDMS do gel pelo uso dos pinos de minutien. (B-C) A preparação de larva-PDMS foi colocada dentro de um prato de cultura com fundo de vidro contendo meio de Schneider inseto. Um microscópio TIRF em uma configuração de iluminação ligeiramente oblíqua foi usado para visualizar Syntaxin-1A-mEos2 nos terminais de nervos motores. (D-F) Uma base PDMS meia-cilíndrica com larvas de Drosophila dissecada. A preparação de larva-PDMS foi colocada em um prato de imagem preenchido com meio de Schneider e a larva foi fotografada no microscópio Super-resolução PALM. Barra de escala, 10 mm. (este valor foi modificado de14). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56952/56952fig3.jpg"> Figura 3 : Na vivo rastreamento de Syntaxin-1A-mEos2 o nervo motor pré-sináptica terminal. (A), A baixa resolução TIRF imagem de Syntaxin-1A-mEos2 em uma tipo 1b nervosa motora terminal. Análise de filmes photoconversion fotografada em 33 Hz gerado sptPALM intensidade super resolvido, coeficiente de difusão e trajetória mapas. 5.309 trajetórias individuais foram imagem aquisição de filme de mais de 16.000 quadros. Barra de escala, 3 μm. (B-C) Deslocamento de quadrático (MSD) de Syntaxin-1A-mEos2 foi plotado de 6 terminais de nervos motores diferentes; área sob a curva MSD (AUC) foi utilizada para quantificar o nível de mobilidade. A distribuição do coeficiente de difusão revela populações de Syntaxin-1A móveis e imóveis que possam ser quantificadas como rácios do outro; uma média de 2.400 ~ trajetórias foram obtidos por terminal do nervo motor (n = 3 larvas). Os dados apresentados como médio erro-padrão da média. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56952/56952fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui ilustramos como microscopia de foto-ativado localização única molécula pode ser realizada no terminal nervoso motor de um vivo Drosophila melanogaster terceiro estádio de larva.

Na Vivo Único-molécula de rastreamento no Terminal do nervo Motor pré-sináptica da drosófila

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Rastreamento in vivo de molécula única no terminal nervoso motor pré-sináptico de Drosophila. Esta técnica descreve como proteínas únicas podem ser rastreadas e visualizadas in vivo nos terminais nervosos motores de larvas de Drosophila de terceiro ínstar. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite que proteínas únicas sejam visualizadas, rastreadas e localizadas em altas resoluções semelhantes às observadas em sistemas in vitro.Desenho de Drosophila transgênica. A proteína sináptica de interesse é marcada com um fluoróforo fotoconversível, e isso é expresso em Drosophila melanogaster. Dissecção da larva de Drosophila de terceiro ínstar.Coloque uma larva errante de terceiro ínstar em uma base de Sylgard cilíndrica ou semicilíndrica. Adicione 40 microlitros de meio de inseto de Schneider na larva. Sob um microscópio de dissecação, enfie um alfinete minucienal na cabeça e outro na cauda da larva para imobilizá-la.Para fornecer acesso, use um pino minuciano para fazer uma incisão estreita na linha média do lado dorsal da região abdominal da larva. A partir deste ponto de incisão, com tesoura de mola, corte ao longo da parede do corpo no sentido ântero-posterior. Remova os órgãos internos da larva com o auxílio de uma pinça fina e uma tesoura de mola.Lave a larva dissecada com o meio de insetos de Schneider. Cole dois pinos minucianos em cada uma das duas abas da parede do corpo para produzir uma preparação de larva dissecada em forma de hexágono. Use uma tesoura de mola para separar o cérebro da larva do cordão nervoso ventral.Usando uma pinça curva, empurre os pinos minucianos na base Sylgard. Microscopia de localização fotoativada de rastreamento de partícula única. Inverta a base Sylgard da larva em um prato de cultura com fundo de vidro cheio de dois mililitros de meio de inseto de Schneider em temperatura ambiente.Aplique água na objetiva de imersão em água 63x de um microscópio ELYRA PS.1 e, em seguida, coloque o prato no palco. Ligue a luz transmitida e use a ocular para localizar a larva na base Sylgard com o auxílio da objetiva de ar 10x. Mude para a objetiva de imersão em água 63x e identifique o músculo seis, usando iluminação de campo brilhante.Usando o software de aquisição ZEN Black, selecione a configuração Total Internal Reflection Fluorescence, TIRF. Mude o laser de 488 nanômetros para visualizar o eMos2 em verde. Localize as junções neuromusculares, que se parecem com contas em uma corda, e adquira uma imagem TIRF de baixa resolução, ligue simultaneamente o laser de 405 nanômetros e o laser de 561 nanômetros para fotoconverter e obter imagens de espécies vermelhas de eMos2.Utilize uma potência de laser muito baixa para o laser de 405 nanômetros para permitir fotoconversões estocásticas moderadamente constantes. Aqui, um laser de 405 nanômetros é operado a 0,09%, enquanto um laser de 561 nanômetros é operado a 50% Nas opções de ângulo TIRF no software, deslize levemente o ângulo crítico TIRF. Defina o tempo de exposição em 30 milissegundos.Adquira uma série temporal de imagens da junção neuromuscular. Aqui, um filme de 15.000 quadros foi adquirido. Salve o filme como um arquivo no formato czi.análise de dados. Analise os filmes adquiridos com um software analítico de rastreamento molecular único adequado. Localize as coordenadas x e y de cada localização de proteína fluorescente pelo ajuste gaussiano da função de propagação do ponto de intensidade.Para traçar a trajetória de cada localização, defina um limite de no mínimo oito aparências de quadro diferentes contínuas para cada localização e um máximo de três pixels de mobilidade entre cada quadro. Obtenha a imagem da trajetória, o deslocamento quadrado médio, bem como o coeficiente de difusão de todas as localizações rastreadas. Resultados representativos.O deslocamento quadrático médio das trajetórias individuais de Syntaxin-1A-eMos2 de múltiplas junções neuromusculares em três larvas diferentes foi plotado, como média mais menos erro padrão da média. A área sob a curva quadrada média de deslocamento também foi plotada. O coeficiente de difusão da Sintaxina-1A-mEos2 foi obtido de forma semelhante a partir de múltiplas junções neuromusculares e plotado como um histograma da distribuição de frequência relativa.O limiar do coeficiente de difusão revelou duas populações de Syntaxin-1A, uma população móvel e uma população imóvel. A razão entre as populações móveis e imóveis de Syntaxin-1A-mEos2 foi calculada. Conclusão. Este vídeo deve fornecer uma compreensão sobre como o rastreamento de proteína única pode ser realizado na junção neuromuscular das larvas de Drosophila.A técnica fornece uma maneira para os pesquisadores no campo da comunicação neuronal visualizarem e observarem a mobilidade e a organização de proteínas individuais em altas resoluções in vivo.

in-vivo-single-molecule-tracking-at-drosophila-presynaptic-motor

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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Dissecção e imagem das Zonas de Ativos no Drosophila Junção neuromuscular

Este vídeo demonstra a técnica para registrar correntes sinápticas de um botão sináptico na junção neuromuscular da larva de Drosophila. Esta técnica permite monitorar a atividade de um único botão sináptico, o que é importante para o estudo de linhas de mosca mutantes com atividade sináptica espontânea ou assíncrona aumentada.

Registrando correntes sinápticas na junção neuromuscular larval de Drosophila

Neste vídeo, as fibras nervosas das larvas de Drosophila são imersas em corante FM, que se liga aos lipídios da membrana celular. O microeletrodo de sucção e os pulsos elétricos estimulam o processo de endocitose, incorporando o corante FM em vesículas endocíticas recém-formadas. Este método, que visualiza estágios pré-sinápticos de neurotransmissão, é útil para estudar a função sináptica e a liberação de neurotransmissores.

Carga e descarga de corante FM mediada por microeletrodo em células nervosas de larvas de Drosophila

Aqui nós mostramos como quantificar o número ea distribuição espacial das zonas ativas sinápticas em fotorreceptores de Drosophila melanogaster, destacou com um marcador molecular geneticamente codificado, e sua modulação após a exposição prolongada à luz.

Analisando Synaptic Modulação da<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotorreceptores após exposição à luz prolongada

Aqui, nós descrevemos o método que nós empregamos à imagem filopódia dendríticas altamente motile em uma preparação viva do cérebro larval da Drosophila , e o protocolo que nós desenvolvemos para quantificar conjuntos de dados da imagem latente do lapso de tempo 3D para avaliações quantitativas do dendrito dinâmica no desenvolvimento de neurônios.

Tempo-lapso de imagem ao vivo e quantificação da dinâmica da filial dendrítica rápida no desenvolvimento de neurônios de Drosophila

Descrevemos um método para rastreamento retrógrado dos neurônios motores embrionários Drosophila usando corantes fluorescentes lipofílicos.

Rastreamento retrógrado de neurônios motores embrionários drosophila usando corantes fluorescentes lipofílicos

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para visualizar as redes de microtúbulos nas junções neuromusculares e células musculares. Combinado com as poderosas ferramentas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita muito a triagem genética e a análise da dinâmica de microtúbulos para o papel das proteínas reguladoras da rede de microtúbulos no sistema nervoso.

Usando a junção neuromuscular de larvas de Drosophila e células musculares para visualizar a rede de microtúbulos

Aprenda rastreamento de moléculas únicas in vivo usando PALM em terminais nervosos motores pré-sinápticos de larvas de Drosophila melanogaster. Esta técnica permite visualizar a dinâmica de proteínas sinápticas com alta resolução.

Na Vivo Único-molécula de rastreamento no Terminal do nervo Motor pré-sináptica da drosófila

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