Artigo de método

Combinando a cristalografia de raios x com espalhamento de raios-x de pequeno ângulo para modelar regiões não-estruturadas de Nsa1 de S. Cerevisiae

DOI:

10.3791/56953

⸱

10 de janeiro de 2018

 ,  , 
1Signal Transduction Laboratory, National Institutes of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services, National Institutes of Health

Neste artigo

Resumo

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Este método descreve a clonagem, expressão e purificação de recombinantes Nsa1 para determinação estrutural por cristalografia de raios x e espalhamento de raios-x de pequeno ângulo (SAXS) e é aplicável para a análise estrutural de híbrido de outras proteínas contendo os dois ordenados e desordenada de domínios.

Resumo

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Determinação da estrutura completo do fator de montagem do Ribossoma Nsa1 de Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) é um desafio por causa da desordenada e protease lábil C-terminal da proteína. Este manuscrito descreve os métodos para purificar Nsa1 recombinante de S. cerevisiae para análise estrutural por cristalografia de raios x e SAXS. Cristalografia de raios x foi utilizada para resolver a estrutura do domínio N-terminal WD40 bem-ordenado de Nsa1, e em seguida SAXS foi usado para resolver a estrutura do C-terminal da Nsa1 em solução. Dados de dispersão de solução foi colhidos em longa-metragem Nsa1 em solução. Calcularam-se as amplitudes de espalhamento teórico da estrutura de cristal de alta resolução do domínio do WD40, e em seguida, uma combinação de corpo rígido e ab initio modelagem revelou o C-terminal da Nsa1. Através desta abordagem híbrida a estrutura quaternária da proteína inteira foi reconstruída. Os métodos apresentados aqui devem ser geralmente aplicáveis para a determinação estrutural de híbrido de outras proteínas, composto por uma mistura de domínios estruturados e não estruturados.

Introdução

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Os ribossomas são máquinas de grande ribonucleoprotein que realizam o papel essencial de traduzir o mRNA em proteínas em todas as células vivas. Ribossomos são compostos por duas subunidades, que são produzidas em um processo complexo denominado Ribossoma biogênese1,2,3,4. Montagem do Ribossoma eucariota conta com a ajuda de centenas de montagem ribosomal essencial fatores2,3,5. Nsa1 (Nop7 associou 1) é um fator de montagem do Ribossoma eucariota qu....

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Protocolo

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1. recombinação da proteína produção e purificação da Nsa 1

  1. Design de plasmídeo de expressão Nsa1 e clonagem
    1. Obter ou comprar o DNA genômico de S. cerevisiae .
    2. PCR amplificar sequências alvo de Nsa1 (Nsa1FL, resíduos 1-463) e C-terminal truncado Nsa1 (Nsa1ΔC, resíduos 1-434) com primers apropriados usando o DNA genômico de isolados de S. cerevisiae e uma temperatura de fusão aproximadamente 60 ° C com um tempo de extensão de 1-2 min. Os seguintes primers foram utilizados para amplificar Nsa1:
      SC_Nsa1_FLFw:CGCCAAAGGCCTATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGTGGATAG
      SC_Nsa1_FLRv:AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTTGCTTTTCTTACT....

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Resultados

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Nsa1 foi PCR amplificados de DNA genômico de S. cerevisiae e subcloned em um vetor que contém uma marca de afinidade de 6 x-histidina N-terminal seguida de MBP e um site de protease TEV. Nsa1 transformou-se em células de Escherichia coli BL21(DE3) e rendimentos elevados da expressão da proteína foram obtidos após indução com IPTG e crescimento a 25 ° C durante a noite (figura 1A). Nsa1 foi afinidade-purified na resina de afinidade de cobalto.......

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Discussão

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Usando este protocolo, Nsa1 recombinante de S. cerevisiae foi gerado por estudos estruturais por cristalografia de raios x e SAXS. Nsa1 foi bem comportado na solução e cristalizado em múltiplas formas de cristal. Durante a otimização destes cristais, foi descoberto que o C-terminal da Nsa1 era sensível à degradação de protease. A alta resolução, forma de cristal ortorrômbico só poderia ser duplicada com variantes de truncamento do C-terminal do Nsa1, provavelmente porque o C-terminal flexível de Nsa1 impediu a e.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Difração foram recolhidos no sudeste equipe acesso Regional colaborativa (SER-CAT) 22-ID e 22-BM de luz síncroton no Advanced Photon Source (APS), Argonne National Laboratory. Os dados SAXS foi coletados sobre a trajetória de SIBILAS no avanço luz fonte (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. Gostaríamos de agradecer o pessoal da trajetória de SIBILAS por sua ajuda com a coleta de dados remoto e processamento. Estamos gratos à pesquisa de espectrometria de massa nacional Instituto de Ciências de saúde ambiental (NIEHS) e grupo de apoio para ajudar a determinar os limites do domínio da proteína. Este trabalho foi apoiado nos Instituto de saúde Intramural pesquisa....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Clonagem molecular de Nsa1
pMBP2 vetor paraleloSheffield et al, Expressão e purificação de proteínas 15, 34-39 (1999)Usamos uma versão modificada de pMBP2 que incluía um DNA genômico N-terminal His-tag (pHMBP)
S. cerevisiaeATCC204508D-5
Primers para clonagem de Nsa1
SC_Nsa1_FLFwIDTCGC CAA AGG CCT
ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT
GGATAG
SC_Nsa1_FLRvIDTAATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT
GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC
AGC
SC_Nsa1_DeltaCFwIDTGGGCGCCATGGGATCCATGAGG
TTACTAGTCAGCTGTGTGG
SC_Nsa1_DeltaCRvIDTGATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC
CTTCCTTTTTTGCTTCCC
Produção de proteínas recombinantes e purificação de Nsa1
Escherichia coli BL21 (DE3) Células estelaresInvitrogenC601003
pMBP-NSA1 e vários truncamentosLo et al., 2017
SelenometioninaDimensões molecularesMD12-503B
Coquetel de inibidor de protease livre
Cloreto de sódioCaledon Produtos químicos de laboratório7560-1-80
Cloreto de magnésio hexahidratadoSigma-AldrichM2670
Tris Buffer, 1 M pH7.5KD MedicalRGF-3340
GlicerolInvitrogen15514-029
beta-mercaptoetanolSigmaM6250
1M Imidazol, pH 8.0TeknovaI6980-06
Talon Affinity ResinaClonetech635503
Amicon Ultra 15 mL Filtro Centrífugo (MWCO 10K)MilliporeUFC901024
HiLoad 16/600 Superdex 200 Gel de Grau de Preparação Coluna de FiltraçãoGE-Healthcare28989335
TEV ProteasePreparada por NIEHS Expressão de Proteína Plasmídeo deExpressão Principal fornecido por NCI (Tropea et al. Métodos Mol Biology, 2009)
4-15% Mini-PROTEAN TGX Géis de Proteína Pré-moldadosBioRad456-8056
Cristalização, Triagem Proteolítica
Tela de cristalHampton ResearchHR2-110
Tela de cristal 2Hampton ResearchHR2-112
Sal RxHampton ResearchHR2-136
Tela de índiceHampton ResearchHR2-144
Tela PEG/IonHampton ResearchHR2-139
JCSG+Dimensões molecularesMD1-37
Wizard Precipitant SynergyDimensões MolecularesMD15-PS-T
Swissci 96-well 3-drop UVP placas de queda sentadasTTP Labtech4150-05823
Fita de vedação cristalina de 3 polegadas de larguraHampton ResearchHR4-506
Proti-Ace KitHampton ResearchHR2-429
PEG 1500Dimensões molecularesMD2-100-6
PEG 400Dimensões MolecularesMD2-100-3
HEPES/hidróxido de sódio pH 7,5Dimensões MolecularesMD2-011-Citrato
Sódio tribásicoDimensões MolecularesMD2-100-127
22 mm x 0,22 mm Lâminas de cobertura SiliconizadasHampton ResearchHR3-231
Placas de 24 poços com selante (Placa VDX com Selante)Hampton ResearchHR3-172
18 mM Loops de Nylon Montados (0.05 mm a 0.5 mM)Hampton ResearchHR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971
Kit de Contas de SementesHampton ResearchHR2-320
Tampas de Cristal MagnéticoHampton ResearchHR4-779
Varinha Cryo MagnéticaHampton ResearchHR4-729
Espuma criogênica DewarHampton ResearchHR4-673
Sistema de disco de cristalMiTeGenM-CP-111-021
Saia completa 96 bem Placa transparenteVWR10011-228
AxyMat Tapete de vedaçãoVWR10011-130
Equipment
UVEX-mJAN Scientific, Inc.
Espectrofotômetro Nanodrop LiteThermo-Fisher
Mosquito RobotTTP Labtech
Software/Websites
HKL2000Otwinoski e Minor, 1997
PhenixAdams et al., 2010
CootEmsley et al., 2010
ATSASPetoukhov et al., 2012https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/
ScatterRambo e Tainer, 2013
PymolO Sistema de Gráficos Moleculares PyMOL, Versão 1.8 Schrö dinger, LLC.
BUNCHPetoukhov e Svergun, 2005
CRYSOLSvergun et al, 1995
PRIMUSKonarev et al, 2003
EOMTria et al, 2015
IPTG, de dioxano Promega V3953 EDTA Sigma-Aldrich 4693159001 de

Referências

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  1. Thomson, E., Ferreira-Cerca, S., Hurt, E. Eukaryotic ribosome biogenesis at a glance. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 4815-4821 (2013).
  2. Woolford, J. L. Jr, Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
  3. Kressler, D., Hurt, E., Bas....

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