Descrevemos as etapas que permitem rápida situ em amostragem de uma pequena porção de uma célula individual com alta precisão e mínima invasão usando microamostragem baseada em capilar, para facilitar a caracterização química de um instantâneo da atividade metabólica em viver de embriões utilizando uma plataforma de espectrometria de massa e eletroforese capilar Custom-Built única célula.
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Artigo de método
Microsonda eletroforese capilar espectrometria de massa para célula única Metabolomics em embriões de viver rã (Xenopus laevis)
Neste artigo
Resumo
Resumo
A quantificação de pequenas moléculas em células únicas gera novos potenciais para melhor compreender os processos básicos que fundamentam o desenvolvimento embrionário. Para habilitar monocelulares investigações diretamente em embriões vivos, novas abordagens analíticas são necessários, especialmente aqueles que são sensíveis, seletiva, quantitativos, robusta e escalável para tamanhos diferentes da célula. Aqui, apresentamos um protocolo que permite a análise em situ do metabolismo nas células únicas no livremente desenvolvimento de embriões do Sul Africana Xenopus (Xenopus laevis), um poderoso modelo em biologia celular e do desenvolvimento. Esta abordagem usa uma microsonda capilar para aspirar uma porção definida de simples células identificadas no embrião, deixando as células vizinhas intactas para análise posterior. O conteúdo da célula coletado é analisado por uma interface de microescala eletroforese capilar electrospray ionização (CE-ESI) acoplada a um espectrômetro de massa em tandem de alta resolução. Esta abordagem é escalável para vários tamanhos de célula e compatível com a complexa estrutura tridimensional do embrião em desenvolvimento. Como exemplo, demonstramos que microsonda que monocelulares CE-ESI-MS permite a elucidação de heterogeneidade celular metabólica que se desdobra como uma célula progenitora dá origem a descendentes durante o desenvolvimento do embrião. Além de célula e biologia do desenvolvimento, os protocolos de célula única análise descritos aqui são aptos para outros tamanhos de células, tipos de células ou modelos animais.
Introdução
Uma compreensão abrangente do desenvolvimento embrionário exige caracterização de todas as alterações moleculares que se desenrolam em cada célula do organismo em desenvolvimento. Enquanto a próxima geração de sequenciamento com amplificação molecular permite medição profunda de célula única transcriptomes1 em desenvolvimento sistemas2,3, consideravelmente menos é conhecida sobre o conjunto de moléculas menores produzido em células embrionárias única, incluindo proteínas e, especialmente, metabólitos (massa molecular < Da ~ 1.500). Com uma resposta rápida e dinâmica de eventos intrí....
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Protocolo
Todos os protocolos relacionados à manutenção e manipulação de Xenopus laevis foram aprovados pelo Comitê de uso da Universidade George Washington e institucional Cuidado Animal (IACUC nenhum. A311).
1. preparação dos instrumentos, meios de comunicação, solventes de amostragem e pratos de amostragem
- Preparar 1 x solução de Steinberg (SS), dissolvendo os seguintes sais em água ultrapura (~18.2 MΩ.cm a 25 ° C), na seguinte ordem e nas concentrações indicadas seguindo um padrão de protocolo33: (58,2 mM) de cloreto de sódio, cloreto de potássio ( 0,67 mM), nitrato de cálcio (0,34 mM), o sulfato de ma....
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Resultados
Nós recentemente empregados microsonda monocelulares CE-ESI-MS para caracterizar metabólitos em células individuais identificados livremente desenvolver embriões de Xenopus laevis 29,30. A microsonda permite rápido (~ 5 seg/cell), em situ aspiração de ~ 10 nL de uma célula individual, múltiplas aspirações da mesma célula, ou várias células diferentes dentro da mesmas ou posteriores estágios de desenvolvimento do .......
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Discussão
Microprobe CE-ESI-MS permite a caracterização directa dos metabolitos em células únicas em viver, livremente desenvolver embriões. O cerne da abordagem são dois subcomponentes técnicas, nomeadamente em situ microsampling capilar e alta sensibilidade CE-ESI-MS. em comparação à dissecação de células inteiras, microsampling capilar tem a vantagem de operação rápida (alguns segundos vs 5 min pilha / por dissecação), compatibilidade com a morfologia tridimensional complexa de embriões e escalabilidade de pequenas cél.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela National institutos de saúde subsídios GM114854 (de Parque Nacional) e CA211635 (de Parque Nacional), o Arnold e Mabel Beckman Fundação Beckman Young Investigator concedem (Parque Nacional), o prêmio DuPont jovem Professor (de Parque Nacional), a sociedade americana para a missa Prêmio de pesquisa espectrometria (de Parque Nacional) e bolsas COSMOS Club Foundation (para R.M.O e E.P.P.). As opiniões e conclusões expressadas nesta publicação são exclusivamente dos autores e não necessariamente representam a opinião oficial das fontes de financiamento.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagentes para meios de cultura de embriõescloreto de | |||
| potássio | Fisher Scientific | BP 366-1 | |
| Sulfato de magnésio | Fisher Scientific | M 65-3 | |
| Nitrato de cálcio | Sigma Aldrich | C1396 | |
| Cisteína | MP Biomedicals | 101444 | |
| Trizma cloridrato | Sigma Aldrich | T3253 | |
| Base Trizma | Sigma Aldrich | T1503 | |
| Cloreto de sódio | Fisher Scientific | 5641-212 | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo< | strong>Comentários |
| Metabolito Solventes de extração | |||
| Acetonitrila (grau LC-MS) | Metanol Fisher Scientific | A955 | |
| (grau LC-MS) | Água Fisher Scientific | A456 | |
| (grau LC-MS) | Fisher Scientific | W6 | |
| Nome | Empresa | Número do catálogo | Comentários |
| Solventes e Padrões para CE-ESI-MS | |||
| Ácido fórmico (grau LC-MS) | Fisher Scientific | A11710X1-AMP | |
| Metanol (grau LC-MS) | Água Fisher Scientific | A456-4 | |
| (grau LC-MS) | Fisher Scientific | W6 | |
| Cloreto de sódio | Fisher Scientific | 5641-212 | |
| Cloreto de acetilcolina | Acros Organics | 159170050 | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Configuração de fabricação de microssonda | |||
| Extrator de micropippette | Sutter Instrument Co. | P-1000 | |
| Capilares de borossilicato | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | |
| Pinça fina e afiada: Dumont #5, Biologie/Dumoxel | Fine Science Tools (USA) Inc | 11252-30 | Resistente à corrosão e autoclavável. |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Configuração de amostragem de microssonda | |||
| Micromanipulador | Eppendorf, Hauppauge, NY | Estereomicroscópio TransferMan 4r | |
| Nikon | SMZ18 | Deve ser isolado vibracionalmente. | |
| Iluminador, por exemplo, Goosenecks | Nikon | C-FLED2 | |
| Microinjetor | Warner Instrument, Handem, CT | PLI-100A | |
| Pipetas de transferência (plástico, descartável) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| placa de Petri 60 mm e 80 mm | Fisher Scientific | S08184 | |
| Pipetas de vidro Pasteur (borosilicato, descartável) | Fisher Scientific | Centrífuga 13-678-20A | |
| Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R | ||
| Nome | Empresa | Número de Catálogo | Comentários |
| CE-ESI-MS Configuração | |||
| Fonte de alimentação de alta tensão | Spellman | CZE1000R | O HVPS pode ser controlado remotamente usando um programa de baixa tensão gerado por um computador pessoal. Cuidado: Alto voltage apresenta risco de choque elétrico; Todas as partes conectivas devem ser aterradas ou cuidadosamente blindadas para evitar a exposição acidental dos usuários. |
| Bombas de seringa (2) | Aparelho | Harvard 704506 | |
| Estereomicroscópio | Amscope | SM-3BZZ | Estereomicroscópio capaz de ampliação de 4,5&vezes, equipado com um iluminador para monitorar o modo de pulverização da interface CE-ESI. |
| Estágio de tradução XYZ | Thorlabs | PT3 | |
| Estágio de tradução XYZ | Construído sob medida | Esta plataforma é capaz de carregar quantidades de nanolitros de amostra no capilar de separação por meio de injeção hidrodinâmica e fornecer o BGE para CE. Ambas as interfaces descritas neste trabalho foram capazes de injetar 6– 10 nL de amostra dentro de 1 min em um capilar de separação de 1 m | |
| Frascos de amostra de aço inoxidável | Frasco BGE de | ||
| Capilar | |||
| (40 µ m/105 e micro; m ID/OD; 100 cm) | Tecnologias Polymicro | TSP040105 | |
| Capilar de sílica fundida (75 µ m/360 e micro; m ID/OD; 100 cm) | Tecnologias Polymicro | TSP075375 | |
| Emissor de aço inoxidável com pontas rombas (130/260 µ m ID / OD) | Hamilton Co. | 21031A | Para um melhor desempenho, clive a laser e polir a ponta do emissor. |
| Seringas (à prova de gás): 500 - 1000 µ L | Hamilton Co. | Multímetro digital 1750TTL | |
| Fluke | Fluke 117 | ||
| Espectrômetro de massa de alta resolução | Bruker Daltonics | Maxis Impact HD | Espectrômetro de massa em tandem de alta resolução equipado com uma interface de pressão atmosférica configurada para ESI |
| Mistura de ajuste para calibração de espectrômetro de massa | Agilent technologies | ESI-L G1969-85000 | |
| Análise de dados ver. 4.3 software | Bruker Daltonics | ||
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Equipamento Auxiliar | |||
| Concentrador de vácuo capaz de operar em 4– 10° C | Labconco | 7310022 | |
| Microbalança analítica (XSE105DU) | Fisher Scientific | 01911005 | |
| Freezer (-20 ° C) | Fisher Scientific | 97-926-1 | |
| Freezer (-80 ° C) | Fisher Scientific | 88300ASP | |
| Fisher Scientific | 11475126 | ||
| Vortex-mixer | Benchmark | BS-VM-1000 |
Referências
- Tang, F. C., Lao, K. Q., Surani, M. A. Development and applications of single-cell transcriptome analysis. Nat. Methods. 8 (4), S6-S11 (2011).
- Veselovska, L., et al. Deep sequencing and de novo assem....
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Reimpressões e permissões
