Análise clonal de precursores embrionárias células-tronco hematopoiéticas usando índice de célula única classificação combinada com células endoteliais nicho co-cultura

Resumo

Aqui apresentamos a metodologia para a análise clonal de precursores de células-tronco hematopoéticas durante o desenvolvimento embrionário murino. Combinamos que o índice de classificação de células únicas da região de aorta-gônada-mesonephros embrionária com co-cultura de células endoteliais e transplante para caracterizar as propriedades fenotípicas e potencial de enxertia de precursores hematopoiéticos único.

Resumo

A capacidade de estudar a gênese de células-tronco hematopoiéticas (HSC) durante o desenvolvimento embrionário tem sido limitada pela raridade dos precursores HSC no embrião precoce e a falta de ensaios que funcionalmente, identificar o potencial a longo prazo de multilineage enxertia de precursores HSC putativos individuais. Aqui, descrevemos a metodologia que permite o isolamento e caracterização de precursores HSC funcionalmente validados a nível de célula única. Primeiro, nós utilizamos índice classificação para catalogar o parâmetro fenotípico preciso de cada célula individualmente classificado, usando uma combinação de marcadores fenotípicos para enriquecer para os precursores HSC com marcadores adicionais para análise experimental. Em segundo lugar, cada célula de índice-classificados é co cultivada com estroma vascular nicho da região de aorta-gônada-mesonephros (AGM), que suporta a maturação dos precursores HSC não-engrafting de HSC funcional com enxertia de multilineage, a longo prazo potencial em ensaios de transplante. Esta metodologia permite a correlação de propriedades fenotípicas de precursores hemogenic clonal com seu potencial de enxertia funcional ou outras propriedades, como o perfil transcricional, proporcionando um meio para a análise detalhada do precursor do HSC desenvolvimento a nível de célula única.

Introdução

Clonais estudos revelaram heterogeneidade nas propriedades de enxertia de longo prazo de linfócitos adultos, fornecendo a introspecção nova de subtipos HSC e mudanças no comportamento HSC durante envelhecimento¹. Entretanto, estudos semelhantes de linfócitos embrionários e seus precursores foram mais desafiadora. Durante o desenvolvimento embrionário precoce, linfócitos surgem de uma população de precursores, conhecida como endotélio hemogenic em um processo transitório referido como o endotelial de transição hematopoiéticas². O primeiro HSC, definido por sua capacidade de fornecer enxertia multilineage robusta, a longo ....

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) do centro de pesquisas de câncer Fred Hutchinson e institucional Cuidado Animal.

1. preparação de monocamadas de AGM-CE para cultura co

1. 24 h antes da dissecação AGM e tipo, fazer AGM-CE meios de cultura e filtro esterilizar.
2. Adicionar 0,1% gelatina em água (100 µ l/poço) para cada poço de uma placa de 96 poços e incubar a temperatura ambiente por 15 min. Aspire a gelatina e deixar a placa em uma capa de cultura de tecidos com a tampa removida até os poços estão secos.
3. Dissocia o monocamadas de AGM-CE e placa para placas de 96 po....

Resultados

A figura 1A mostra um esquema do projeto experimental. Uma vez que tecidos P-Sp/AGM são dissecados, pool e dissociados em colagenase, eles estão manchados com anticorpos para VE caderina e EPCR para classificação de índice. Pré-HSC são enriquecidos em células classificadas em VE-caderina⁺EPCR^alta (figura 1B). Outros anticorpos conjugados a fluorocromo podem ser incluídos para analisar retrospectivamente parâ.......

Discussão

O estudo da gênese HSC durante o desenvolvimento embrionário necessita de meios para detectar potencial precursores de hemogenic ainda falta a competência para fornecer a longo prazo multilineage reconstituição hematopoiética em transplantados adultos destinatários de HSC. Neste protocolo, apresentamos um ensaio clonal de precursores hemogenic embrionárias pela cultura co do estroma em nicho vascular ECs de AGM, que suporta a maturação dos precursores de HSC, com posterior análise funcional em ensaios de transplante. Inc.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
AGM-EC meios de cultura
Materiais para cultura de células endoteliais
TrypLE Express	Gibco	12605-028	Use para dissociar monocamadas AGM-EC
Gelatina 0,1% em água	StemCell Technologies	7903	Use para aderir monocamadas AGM-EC ao plástico
Placas de cultura de tecidos de 96 poços	Corning	3599	Uso para co-cultura de monocamadas AGM-EC e clones classificados por índice
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (PBS)	Gibco	14190-144	Uso para dissecção e coloração FACS Frascos
de filtro de 500 ml	Fisher Scientific	9741202	Uso para filtro estéril Meios endoteliais
AGM-EC meios de cultura (500 mls)
Meio de Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM)	Gibco	12440-053	400 mls
Hyclone Fetal Soro	Bovino Fisher Scientific	SH30088.03	100 ml
Penicilina Estreptomicina	Gibco	15140-122	5 mls
Heparina	Sigma	H3149	50 mg dissolvido em 10 mls de meio
L-glutamina (200 mM)	StemCell Technologies	7100	5 mls
Endotelial Mitogen (ECGS)	Alfa Aesar	J64516 (BT-203)	Adicione 10 mls de mídia para dissolver e adicione
Materiais para classificação de índice AGM
Collagenase (0.25%)	StemCell Technologies	7902	Uso para dissociação de tecidos embrionários
Seringa de 3ml	BD Biosciences	309657	Use para filtrar soluções de anticorpos estéreis para FACS
0,22 e micro; Filtro acionado por seringa	M Millipore	SLGP033RS	Use para filtrar estéril soluções de anticorpos para FACS
Tubo de poliestireno de 5 ml com tampa de filtro de células	Corning	352235	Use para remover aglomerados de células antes do FACS
DAPI (preparado como estoque de 1 mg/ml em H2O)	Millipore	268298	Use para excluir células mortas do tipo
anti-camundongo CD16/CD32 (bloco FcR)	BD Biosciences	553141	Use para bloquear a coloração não específica para receptores Fc
Anticorpos para classificação de índice AGM
Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7	eBioscience	25-1441-82	Coloração
de rato IgG1 kappa Controle de isotipo, PE-Cyanine7	eBioscience	25-4301-81	Controle de isotipo para CD144 PE-Cyanine7
Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710	eBioscience	46-2012-80	Controle de
isotipo de rato IgG2b kappa, PerCP-eFlour710	eBioscience	46-4031-80	Controle de isotipo para CD201 PerCP-eFluor710
Anti-mouse CD41 PE	BD Biosciences	558040	Coloração
de rato IgG1 kappa Controle de isotipo, PE	BD Biosciences	553925	Controle de isotipo para CD41 PE
Anti-mouse CD45 FITC	eBioscience	11-0451-85	Controle de
isotipo de rato IgG2b kappa, FITC	eBioscience	11-4031-81	Controle de isotipo para CD45 FITC
AGM-meio livre de soro (10mls)
X-Vivo 20	Lonza	04-448Q	10 mls
de fator de células-tronco murinas recombinantes (SCF)	Peprotech	250-03	10 ml (estoque de 100 mg/ml) Concentração final 100 ng/ml
ligante FLT3 humano recombinante (FLT3L)	Peprotech	300-19	10 ml (estoque de 100 mg/ml) Concentração final 100 ng/ml
trombopoetina humana recombinante (TPO)	Peprotech	300-18	2 ml (estoque de 100 mg/ml) Concentração final 20 ng/ml
interleucina-3 murina recombinante (IL3)	Peprotech	213-13	2 ml (estoque de 100 mg/ml) Concentração final 20 ng/ml
Materiais para coloração de células co-cultivadas
96 placa de poço, fundo em V	Corning	3894	Uso para análise FACS
Anticorpos para análise de clones classificados por índice co-cultivados com células endoteliais
Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5	eBioscience	45-0451-82	Controle de
isotipo de rato IgG2b kappa, PE-Cyanine5.5	eBioscience	35-4031-80	Controle de isotipo para CD45 PerCP-Cyanine5.5
Anti-mouse CD201 (EPCR) PE	eBioscience	12-2012-82	Controle de
isotipo de rato IgG2b kappa, PE	eBioscience	12-4031-81	Controle de isotipo para CD201 PE
Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC	eBioscience	17-5981-83	Controle de
isotipo de rato IgG2a kappa, APC	eBioscience	17-4321-81	Controle de isotipo para Ly-6A / E APC
Anti-mouse F4 / 80 FITC	eBioscience	11-4801-81	Controle de
isotipo de rato IgG2a kappa, FITC	eBioscience	11-4321-41	Controle de isotipo para F4 / 80 FITC
Anti-mouse Ly-6G / C (Gr1) FITC	BD Biosciences	553127	Coloração
de rato IgG2b kappa Controle de isotipo, FITC	BD Biosciences	556923	Controle de isotipo para Ly-6G/C e CD3 FITC
Materiais para injeção de veia caudal para transplante
1/2 ml seringas de insulina com agulhas 29G 1/2"	BD Biosciences	309306	Uso para injeção de veia caudal para transplante
Anticorpos para análise de sangue periférico após translant
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP	Biolegend	108426	Coloração
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP	Biolegend	400629	Controle de isotipo para Ly-6G/C PerCP
Anti-mouse F4/80 PE	eBioscience	12-4801-82	Coloração
Controle de isotipo de rato IgG2a kappa, PE	eBioscience	12-4321-80	Controle de isotipo para F4 / 80 PE
Anti-mouse CD3 FITC	BD Biosciences	555274	coloração
anti-camundongo CD19 APC	BD Biosciences	550992	coloração
de rato IgG2a kappa Controle de isotipo, APC	BD Biosciences	553932	Controle de isotipo para CD19 APC
Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-cianina7	eBioscience	25-0453-82	Controle de
isotipo de rato IgG2a kappa, PE-Cyanine7	eBioscience	25-4321-81	Controle de isotipo para CD45.1 PE-Cyanine7
Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780	eBioscience	47-0454-82	Controle de
isotipo de rato IgG2a kappa, APC-eFluor780	eBioscience	47-4321-80	Controle de isotipo para CD45.2 APC-eFluor780
Equipment
FACSAria II com software DIVA	BD Biosciences
BD FACSCanto II com leitor de placas	BD Biosciences
Haemocytometer	Fisher Scientific	S17040	Para contagem de células
Pipeta multicanal	Fisher Scientific	14-559-417	Para software
de análise FACS	FlowJo/BD Biosciences		https://www.flowjo.com/solutions/flowjo

BD de células dispensadoras