As mitocôndrias contêm várias enzimas dependentes de flavina que podem produzir espécies reativas de oxigênio (ROS). Liberação de sites individuais nas mitocôndrias monitoramento ROS é um desafio devido às reações colaterais indesejados. Apresentamos um método fácil e barato para avaliação direta do nativas taxas para liberação ROS usando flavoenzymes purificado e microplacas fluorometry.
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Artigo de método
Medição simultânea de peróxido de hidrogénio superóxido e produção de NADH por desidrogenases mitocondriais contendo Flavin
Neste artigo
Resumo
Resumo
Tem sido relatado que a mitocôndria pode conter até 12 fontes enzimáticas de espécies reativas de oxigênio (ROS). A maioria desses sites incluem complexos respiratórios flavin-dependente e desidrogenases que produzem uma mistura de superóxido (O2● -) e peróxido de hidrogênio (H2O2). Pode ser um desafio devido à presença de sistemas de defesa antioxidante e reações colaterais que também formam O2●-/ h2O2quantificação exata do potencial produção de ROS de sites individuais em mitocôndrias isoladas. Uso de inibidores inespecíficos que podem interromper a bioenergética mitocondrial também pode comprometer as medições alterando ROS lançamento de outros sites de produção. Aqui, apresentamos um método fácil para a medição simultânea de dinucleótido de nicotinamida e adenina (NADH) produção e lançamento de H2O2 por desidrogenases purificadas flavin-lig. Para este efeito, utilizámos purificada piruvato desidrogenase complexo (PDHC) e α-cetoglutarato desidrogenase complexo (KGDHC) de origem suína coração como exemplos. Este método permite uma medida exata de taxas lançamento2 de2O de H de nativos por sites individuais de produção, eliminando outras fontes potenciais de sistemas ROS e antioxidante. Além disso, este método permite uma comparação direta da relação entre a versão de2 H2O e atividade enzimática e o rastreio da eficácia e seletividade de inibidores para a produção de ROS. Em geral, esta abordagem pode permitir a avaliação aprofundada das taxas nativas de introdução ROS em enzimas individuais antes de conduzir experiências mais sofisticadas com mitocôndrias isoladas ou permeabilized fibra muscular.
Introdução
O objetivo final do metabolismo de nutrientes é tornar trifosfato de adenosina (ATP). Em células de mamíferos, isso ocorre nas mitocôndrias, organelas double-membraned que convertem a energia armazenada em carbono em ATP. A produção de ATP começa quando o carbono é queimado pela mitocôndria formando duas transportadoras de elétrons, NADH e dinucleótido de flavina e adenina (DANIII2)1. NADH e DANIII2 são então oxidados por complexos respiratórios multi subunidade I e II, respectivamente, e os elétrons libertados são levados até o terminal do elétron aceitador oxigênio molecular (O2) no complexo IV
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Protocolo
1. produtos químicos e enzimas purificadas
- Adquirir os seguintes materiais: PDHC e KGDHC de origem porcina coração (ou outra flavoenzyme mitocondrial purificada); H2O2 (solução a 30%), piruvato, α-cetoglutarato, NAD+, NADH, CoASH, pirofosfato de tiamina (TPP), sacarose manitol, HEPES, EGTA, Ácido valérico de 3-metil-2-oxo (KMV), superóxido dismutase (SOD), peroxidase de rábano (HRP), 10-acetil-3,7-dihydroxyphenoxazine reagente (AUR) e CPI-613.
2. planejamento do ensaio e preparação dos reagentes
- Configure o ensaio de acordo com a tabela 1 em uma placa de 96 poços.
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Resultados
Figura 3A fornece um traço representativo para a RFU recolhida durante a medição simultânea de H2O2 e a produção de NADH por KGDHC purificado. Os dados brutos da RFU para cada intervalo de tempo são representados na Figura 3B. Os dados brutos da RFU são então exportados para análise. Por extrapolando curvas padrão apresentadas na Figura 2, pode ser determinada a quantidade absol.......
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Discussão
Este protocolo é vantajoso desde, 1) elimina quaisquer reacções concorrentes que caso contrário podem interferir com o H2O2 detecção (por exemplo, sistemas antioxidantes ou outras fontes de ROS), 2) fornece uma avaliação directa da taxa nativa de ROS de lançamento por uma desidrogenase mitocondrial contendo flavin, 3) permite a comparação do nativo ROS liberar a taxas de dois ou mais purificado desidrogenases flavin-baseado, 4) pode permitir a uma comparação direta da taxa de atividade de l.......
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Divulgações
Não há nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelas ciências naturais e engenharia pesquisa Conselho de Canadá (NSERC). Produção de vídeo foi realizada em colaboração com o centro de inovação no ensino e aprendizagem (DIOC) na Memorial University of Newfoundland.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Complexo de piruvato desidrogenase | SIGMA | P7032-10UN | complexo de flavoenzima purificada |
| alfa-cetoglutarato desidrogenase | SIGMA | K1502-20UN | purificada de flavoenzima |
| 30% | SIGMA | HX0640-5 | reagente, curvas padrão |
| NAD + | SIGMA | N0632-1G | reagente, atividade / ensaio |
| de liberação de ROSReagente NADH | SIGMA | N4505-100MG | , curvas padrão |
| piruvato | SIGMA | P2256-5G | reagente, ensaio de atividade / liberação de ROS |
| reagente alfa-cetoglutarato | SIGMA | 75892-25G | , ensaio de atividade / liberação de ROS |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | reagente, atividade / ensaio de liberação de ROS |
| pirofosfato de tiamina | SIGMA | C8754-1G | reagente, atividade/ensaio de liberação de ROS |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | |
| manitol | SIGMA | M4125-100G | |
| componente do amortecedor sacarose | SIGMA | S7903-250G | componente |
| do amortecedor EGTA | SIGMA | E3889-10G | |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | , inibidor da liberação |
| CPI-613 | Santa Cruz | reagente sc-482709 | , inibidor de liberação de ROS |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | reagente, detecção de liberação de ROS |
| peroxidase de rábano | SIGMA | P8375-1KU | reagente, detecção de liberação de ROS |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | reagente, detecção de liberação de ROS |
| Leitor de microplacas Biotech Synergy 2 | BioTek Instruments | leitor de microplacas para ensaios | |
| Gen5 software | BioTek Instruments | , usado para coleta de software RFU Graphpad Prism Graphpad | |
| , análise de dados | |||
| Microsoft EXCEL | Software Microsoft | , análise de dados |
Referências
- Mailloux, R. J. Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species. Redox Biol. 4, 381-398 (2015).
- Nicholls, D. G.
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Reimpressões e permissões
