Interactome-Seq: Um protocolo para a construção da biblioteca de Domainome, a validação e a seleção por Phage Display e a próxima geração de sequenciamento

Summary

Os protocolos descritos permitem a construção, caracterização e seleção (contra o destino de escolha), de uma biblioteca de "domainome", feita a partir de qualquer fonte de DNA. Isto é conseguido por um pipeline de pesquisa que combina diferentes tecnologias: a exibição do fago, repórter dobrável e sequenciamento de próxima geração com uma ferramenta web para análise de dados.

Abstract

Repórteres de dobramento são proteínas com fenótipos facilmente identificáveis, tais como a resistência aos antibióticos, cujo dobramento e a função fica comprometida quando fundido ao mal dobrar proteínas ou frames de leitura abertos ao acaso. Temos desenvolvido uma estratégia onde, por meio de β-lactamases de TEM-1 (a enzima que confere resistência à ampicilina) em escala genômica, podemos selecionar coleções de domínios da proteína dobrada corretamente da porção codificação do DNA de qualquer intronless genoma. Os fragmentos de proteína obtidos por esta abordagem, o chamado "domainome", será bem expresso e solúvel, tornando-os adequados para estudos estrutural/funcional.

Clonagem e exibindo o "domainome" diretamente em um sistema de exibição do fago, mostramos que é possível selecionar domínios de proteínas específicas com as propriedades de vinculação desejado (por exemplo, para outras proteínas ou anticorpos), proporcionando assim essencial informações experimentais para identificação de anotação ou antígeno gene.

A identificação dos clones mais enriquecidos em uma população de polyclonal selecionado pode ser alcançada usando tecnologias romance sequenciamento de próxima geração (NGS). Por estes motivos, apresentamos a análise profunda de sequenciamento da biblioteca em si e as saídas de seleção para fornecer informações completas sobre a diversidade, abundância e mapeamento preciso de cada um do fragmento selecionado. Os protocolos aqui apresentados mostram as principais etapas para a construção da biblioteca, caracterização e validação.

Introduction

Aqui, descrevemos um método de alta produtividade para a construção e seleção das bibliotecas de domínios da proteína dobrada e solúvel de qualquer fonte de partida genic/genômica. A abordagem combina três tecnologias diferentes: phage display, o uso de um repórter de dobramento e sequenciamento de próxima geração (NGS) com uma ferramenta de web específica para análise de dados. Os métodos podem ser usados em muitos contextos diferentes de pesquisa à base de proteínas, para a identificação e a anotação de novos domínios de proteínas/proteína, a caracterização das propriedades estruturais e funcionais de proteínas conhecidas, bem como a definição de rede de interação de proteínas.

Muitas questões estão ainda presentes na pesquisa baseada em proteína e o desenvolvimento de métodos para a produção de proteína ideal é uma necessidade importante para vários campos de investigação. Por exemplo, apesar da disponibilidade dos milhares de genomas de procariotas e eucariotas¹, mapa correspondente do proteomes relativa com uma anotação direta dos peptídeos e proteínas codificadas ainda está faltando para a grande maioria dos organismos. O catálogo de proteomes completa está emergindo como um objetivo desafiador que exige um grande esforço em termos de tempo e recursos. O padrão ouro para anotação experimental permanece a clonagem de todos o Open Frames de leitura (ORFs) de um genoma, construindo o chamado "ORFeome". Geralmente, função do gene é atribuída com base na homologia de genes relacionados de actividade conhecida mas esta abordagem é mal exata devido à presença de muitas anotações incorretas na referência bases de dados^{2,3,4, 5}. Além disso, mesmo para as proteínas que foram identificadas e anotadas, estudos adicionais são necessários para atingir a caracterização em termos de abundância, padrões de expressão em diferentes contextos, incluindo propriedades estruturais e funcionais, bem como redes de interação.

Além disso, uma vez que as proteínas são compostas de diferentes domínios, cada um deles apresentando características específicas e contribuindo de forma diferente para funções de proteína, o estudo e a definição exata destes domínios podem permitir que um quadro mais abrangente, tanto para o single Gene e no nível do genoma completo. Toda esta informação necessária faz pesquisa baseada em proteína um campo amplo e desafiador.

Nesta perspectiva, um importante contributo poderia ser dada por métodos imparciais e alta produtividade para a produção de proteína. No entanto, o sucesso de tais abordagens, ao lado do considerável investimento necessário, conta com a capacidade de produzir construções de proteína solúvel/estável. Esta é uma grande limitação do fator desde que estima-se que apenas cerca de 30% de proteínas pode ser com êxito expressa e produzido em níveis suficientes para ser experimentalmente úteis^6,7,8. Uma abordagem para superar essa limitação é baseada na utilização de DNA fragmentado aleatoriamente para produzir diferentes polipeptídeos, que juntos fornecem sobrepostos representação fragmento de genes individuais. Apenas uma pequena percentagem dos fragmentos de DNA gerados aleatoriamente são ORFs funcionais, enquanto a grande maioria deles é não-funcional (devido à presença de códons de parada dentro de suas sequências) ou codifica para un-natural (ORF em uma moldura que não seja o original) polipeptídeos com nenhum significado biológico.

Para resolver todos esses problemas, o nosso grupo desenvolveu uma plataforma de análise com proteína de alta produtividade expressão e interação que pode ser usada em uma escala genômica^9,10,11,12. Esta plataforma integra as seguintes técnicas: 1) um método para selecionar conjuntos de domínios da proteína correctamente dobrada da parte codificação do DNA de qualquer organismo; 2) a tecnologia de exibição do fago para selecionar parceiros de interações; 3) o NGS completamente caracterizam a interactome toda sob estudo e identificar os clones de interesse; e 4) uma ferramenta web para análise de dados para usuários sem conhecimento de programação ou bioinformática executar análise Interactome-Seq de forma fácil e amigável.

O uso desta plataforma oferece vantagens importantes sobre estratégias alternativas de investigação; acima de tudo, o método é completamente imparcial, alta produtividade e modular para estudo que variam de um único gene até um genoma inteiro. A primeira etapa do gasoduto é a criação de uma biblioteca de DNA fragmentado aleatoriamente sob estudo, que então profundamente caracteriza-se por NGS. Esta biblioteca é gerada usando um vetor de engenharia onde/fragmentos de genes de interesse são clonados entre uma sequência de sinal para a secreção de proteínas para o espaço periplasmático (ou seja, um líder Sec) e o gene de β-lactamase TEM1. A proteína de fusão irá conferir resistência à ampicilina e a capacidade de sobreviver sob pressão de ampicilina somente se fragmentos clonados são em-frame com esses elementos e a proteína de fusão resultante é corretamente dobrado^{10,13 ,14}. Todos os clones resgataram após seleção de antibióticos, os chamados "clones de filtrado", são ORFs e, a grande maioria deles (mais de 80%), são derivados de genes real⁹. Além disso, o poder desta estratégia encontra-se nas conclusões que todos os clones ORF filtrado são codificação para proteínas corretamente dobrado/solúvel/domínios¹⁵. Como muitos clones, presentes na biblioteca e mapeamento de mesmo região/domínio, têm pontos diferentes inicial e final, isto permite a identificação imparcial, passo a passo dos fragmentos mínimos que poderão resultar em produtos solúveis.

Uma melhoria na tecnologia é dada pelo uso de NGS para caracterizar a biblioteca. A combinação dessa plataforma e uma ferramenta de web específico para análise de dados fornece importante informação imparcial sobre as sequências de nucleótidos exata e sobre a localização das ORFs selecionados na referência de DNA em estudo, sem a necessidade de mais extensas análises ou esforço experimental.

Domainome bibliotecas podem ser transferidas para um contexto de seleção e usadas como um instrumento universal para realizar estudos funcionais. A proteína do elevado-throughput expressão e interação análise plataforma que estamos integrados e que chamamos Interactome-Seq aproveita a tecnologia de exibição do fago, transferindo a ORF filtrada em um vetor de phagemid e criando um fago-ORF biblioteca. Uma vez re-clonado em um contexto de exibição do fago, proteína domínios são exibidos na superfície das partículas de M13; desta forma domainome bibliotecas podem ser selecionadas diretamente para fragmentos do gene codificação domínios com actividades enzimáticas específicas ou vincular propriedades, permitindo interactome redes de criação de perfil. Esta abordagem foi inicialmente descrita por et al . Zacchi ¹⁶ e mais tarde usado em vários outros contexto^13,17,18.

Em comparação com outras tecnologias utilizadas para estudar a interação da proteína-proteína (incluindo dois sistema híbrido de levedura e espectrometria de massa^19,20), uma das principais vantagens é a amplificação do parceiro de ligação que ocorre durante o fago exiba várias rodadas de seleção. Isto aumenta a sensibilidade de seleção, permitindo a identificação dos domínios dos baixo abundantes proteínas presentes na biblioteca. A eficiência da seleção realizada com biblioteca ORF-filtrado é ainda maior devido à ausência de clones não-funcional. Finalmente, a tecnologia permite que a seleção para ser executada contra tanto da proteína e da proteína não iscas^{21,22,23,24,25}.

Seleções do fago usando a biblioteca do fago-domainome podem ser realizadas usando anticorpos proveniente de soros de pacientes com diferentes condições patológicas, por exemplo, doenças auto-imunes¹³, câncer ou infecção doenças como isca. Esta abordagem é usada para obter a chamado "assinatura de anticorpo" da doença em estudo, permitindo-se maciçamente, identificar e caracterizar os antígenos/epítopos especificamente reconhecidos por anticorpos dos pacientes ao mesmo tempo. Em comparação com outros métodos, o uso do phage display permite a identificação de epítopos antigênicos lineares e conformacionais. A identificação de uma assinatura específica potencialmente poderia ter um impacto importante para a patogênese da compreensão, novo design de vacina, identificação de novos alvos terapêuticos e o desenvolvimento de ferramentas de diagnósticos e prognósticos de novas e específicas. Além disso, quando o estudo é focado em doenças infecciosas, uma grande vantagem é que a descoberta de proteínas imunogênicas é independente do cultivo de organismos patogénicos.

Nossa abordagem confirma que os repórteres dobráveis podem ser usados em escala genômica para selecionar o "domainome": uma coleção de domínios corretamente dobrado, bem expressa, as proteínas solúveis da porção codificação do DNA ou cDNA de qualquer organismo. Uma vez isolados os fragmentos de proteína são úteis para muitos propósitos, fornecendo informações essenciais de experimentais para anotação de gene, bem como para estudos estruturais, mapeamento de epítopo de anticorpos, identificação de antígeno, etc. A completude da elevado-throughput de dados fornecidos pelo NGS permite a análise de amostras altamente complexas, tais como bibliotecas de exibição do fago e detém o potencial para contornar a tradicional colheita trabalhosa e ensaio de clones individuais do fago resgatado.

Ao mesmo tempo graças as funcionalidades da biblioteca de filtrado e a extrema sensibilidade e poder de análise o NGS, é possível identificar o domínio de proteína responsável de cada interação diretamente em uma tela inicial, sem a necessidade de criar bibliotecas adicionais para cada um ligado a proteínas. NGS permite para obter uma definição abrangente do domainome inteiro de qualquer fonte de partida genic/genômica e a ferramenta de web de análise de dados permite a obtenção de uma caracterização altamente específica de um ponto de vista qualitativo e quantitativo do domínios dos interactome proteínas.

Protocol

1. a construção da biblioteca ORF (Figura 1)

1. Preparação do ADN da inserção
   1. Preparação de fragmentos de DNA genômico ou sintético
      1. Extrato/purifica DNA usando métodos padrão²⁶.
      2. Fragmento de DNA pelo sonication. Se usando um sonicador padrão, como um começo de sugestão geral com 30 pulsos de s a 100% potência de saída.
         Nota: As experiências piloto devem ser feitas com poder diferente e sonication vezes para definir as condições ideais para a preparação de DNA. Após cada ensaio determine o tamanho dos fragmentos de DNA por eletroforese em gel de agarose.
      3. Carrega o DNA lisado em gel de agarose 1,5%, juntamente com uma escada de DNA bp 100. Realize uma eletroforese curto até 5 V/cm por 15 min e corte a parte do gel contendo o esfregaço do DNA fragmentado.
      4. Purificar o DNA de inserção com um kit de extração de gel à base de coluna e medir a concentração usando um espectrofotômetro UV.
         Nota: pelo menos 500 ng de inserções purificadas deve ser obtida após esta etapa, a ser ligado com 1 µ g de vetor digerido, conforme descrito na etapa 1.3. Verifica a qualidade da preparação de fragmentos, avaliando uma_260nm/A_280nm e um_260nm/A_230nm relações desde a baixa qualidade da amostra afetará a eficiência da ligadura.
      5. Trate até 5 μg das pastilhas com 1 μL da mistura rápida Kit embotamento enzima, de acordo com as instruções do fabricante. Inativar enzimas por aquecimento a 70 ° C por 10 min. as amostras podem ser armazenadas a-20 ° C até o uso.
   2. Preparação de fragmentos de cDNA
      1. Extraia o RNA com métodos padrão (por exemplo, usando TRizol ou reagentes semelhantes).
      2. Fragmento do mRNA por aquecimento antes de executar a transcrição reversa. O comprimento final de fragmento de DNA é controlado pelo tempo de ebulição de mRNA e concentração aleatória da primeira demão. Por exemplo, amostra de calor durante 6 minutos a 95 ° C.
      3. Prepare o cDNA utilizando primers aleatórios com qualquer kit disponível seguindo o protocolo do fabricante.
      4. Empobrecem o cDNA de caudas poli-dT por hibridação com biotinilado poli-por 3 h a 37 ° C e separado em grânulos magnético streptavidin como descrito por Carninci et al ¹³
      5. Recuperar material desacoplado e purificar-se com uma coluna com base em DNA purificação kit seguindo as instruções do fabricante. Medir a concentração usando um espectrofotômetro UV. Ver nota na etapa 1.1.1.4.
2. Preparação do vetor de filtragem
   1. Digest 5 µ g de clonagem purificada vector pFILTER3¹² com 10 U da EcoRV enzima de restrição, o protocolo do fabricante seguinte.
   2. Carregar 2 µ l (200 ng) do vetor digerido, juntamente com 100 ng do vetor não digerido e 1 k bp marcador molecular, em um gel de agarose a 1%, para verificar se há boa digestão. Calor inativar a enzima de restrição.
   3. Adicionar o volume de 1/10 de 10x buffer de fosfatase e 1 μl (5 U) de fosfatase e incubar a 37 ° C por 15 min. calor inativar por 5 min a 65 ° C.
   4. Purificar o plasmídeo digerido por extracção de gel de agarose e medir a concentração usando um espectrofotômetro UV. As amostras podem ser armazenadas a-20 ° C até o uso.
3. Ligadura e transformação
   1. Realizar a ligadura da seguinte forma: para 1 µ g de plasmídeo digerido adicionar 400 ng de inserções fosforiladas (plasmídeo: inserir razão molar 1:5), 10 µ l de 10x Buffer para T4 DNA Ligase, 2 µ l de alta concentração T4 DNA ligase em um volume final de 100 µ l. Incubar a reação na overni de 16 ° C ght. Calor inativar a 65 ° C por 10 min.
   2. Precipitar o produto da ligadura, adicionando 1/10 volume de solução de acetato de sódio (3 M, pH 5.2) e 2,5 volumes de etanol a 100%. Misture e congelar a-80 ° C por 20 min.
   3. Centrifugar a velocidade máxima por 20 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
   4. Adicionar 500 µ l de etanol a 70% frio a pelota e centrifugar a velocidade máxima por 20 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
   5. Ar seco a pelota. Ressuspender o precipitado de DNA em 10 µ l de água.
   6. Execute electroporation célula bacteriana.
      Nota: O uso de células de alta eficiência (acima de 5 x 10⁹ transformants por µ g de DNA) é necessária. Nós sugerimos o uso DH5αF de Escherichia coli' (F'/ endA1 hsd17 (rK − mK +) supE44 thi-1recA1 gyrA (Nalr) relA1 (lacZYA-argF) U169 deoR (F80dlacD-(lacZ)M15) produzido em casa ou comprados de vários fabricantes.
      1. Coloque o número apropriado de microcentrifuga tubos e 0,1 cm-electroporation cubetas no gelo. Adicionar 1 µ l de solução de ligadura purificado (em água DI) de 25 µ l de células e agite o tubo algumas vezes.
      2. Transfira a mistura de DNA-célula para a cubeta do fria, toque na bancada 2x, limpe a água exterior da cubeta, colocar no pulso electroporation módulo e pressione.
      3. Executar eletroporação com uma máquina de electroporator padrão usando 25 µF, 200 Ω e 1,8 kV. Constante de tempo deve ser 4-5 ms.
   7. Imediatamente, adicionar 1 mL de meio líquido 2xYT sem qualquer antibiótico, transfira para um tubo de 10 mL e deixe para crescer a 37 ° C, agitando a 220 rpm por 1h.
   8. Placa transformada DH5αF' em 15 cm 2xYT placas de ágar suplementado com 34 µ g/mL cloranfenicol (pFILTER resistência) e ampicilina 25 µ g/mL (marcador seletivo para ORFs) e incubar durante uma noite a 30 ° C.
   9. Diluições de placa da biblioteca em 10cm 2xYT placas de ágar suplementado com cloranfenicol + ampicilina e cloranfenicol somente, para realizar a titulação de biblioteca. Incubar durante uma noite a 30 ° C.
4. validação de biblioteca pFILTER-ORF
   1. Teste de 15-20 colônias de placas tanto cloranfenicol e ampicilina/cloranfenicol para estimar a distribuição de tamanho de inserção. Escolha única colônias com uma ponta e diluí-los separadamente em 100 µ l de 2xYT meio sem antibióticos. Use 0.5 µ l desta solução como modelo de DNA para uma reação de PCR, com qualquer padrão do polymerase TaqDNA seguindo o protocolo do fabricante.
   2. Executar 25 ciclos de amplificação utilizando um T recozimento de 55 ° C e um tempo de extensão de 40 s a 72 ° C. Sequências da primeira demão são fornecidas na Tabela de materiais.
   3. Carrega os produtos PCR em gel de agarose 1,5%, juntamente com uma escada de DNA bp 100 e executar.
5. coleção de biblioteca pFILTER-ORF
   1. Recolher as bactérias das placas de 150 mm de adicionar 3 mL de meio fresco 2xYT e colheita-os com uma espátula estéril, homogeneizar, completá-los com 20% de glicerol estéril e armazenar a-80 ° C em pequenas alíquotas.
   2. Purificar o Plasmídeo de uma alíquota da biblioteca (antes da adição de glicerol) usando um kit de extração baseados em colunas do plasmídeo, seguindo as instruções do fabricante.
   3. Medir a concentração com o espectrofotómetro de UV. As amostras podem ser armazenadas a-20 ° C até ser usado para a preparação de biblioteca phagemid e/ou caracterização por NGS.

2. subcloning de ORFs filtradas em um vetor de Phagemid (Figura 2)

1. Preparação de ORF filtrada de fragmentos de DNA
   1. Configurar a digestão da enzima da limitação de 5 µ g de vetor purificado do vetor biblioteca pFILTER-ORF adicionando 10 U de BssHII e incubando conforme o protocolo do fabricante. Inativar a enzima e digerir com 10 U de NheI.
   2. Carrega o DNA digerido em gel de agarose 1,5%, juntamente com uma escada de DNA bp 100. Realize uma eletroforese curto corrido 5 V/cm por 15 min ou apenas o suficiente distinguir o esfregaço de fragmentos excisados e cortar a parte do gel que contém-los.
   3. Purificar o DNA de inserção com um kit de extração de coluna-base gel e medir a concentração usando um espectrofotômetro UV.
2. Preparação de phagemid DNA
   1. Configure a digestão da enzima de restrição de 5 µ g de pDAN5 purificado²⁷ quanto as inserções.
   2. Purificar o plasmídeo digerido pela execução DNA digerido em um gel de agarose 0,75% e extrair do gel com um kit baseados em colunas.
   3. Medir a concentração usando um espectrofotômetro UV. As amostras podem ser armazenadas a-20 ° C até o uso.
3. Coleta, transformação e ligadura da biblioteca
   1. Realize a ligadura e transformação conforme descrito por pFILTER vector.
   2. Placa transformada DH5αF' em 150 mm 2xYT placas de ágar suplementado com ampicilina 100 de µ g/mL e incubar durante uma noite a 30 ° C.
   3. Placa de diluições da biblioteca em 100 mm 2xYT placas de ágar suplementado com 100 ampicilina µ g/mL para determinar o tamanho da biblioteca.
   4. Execute a validação de biblioteca por PCR dos clones aleatoriamente escolhidos conforme descrito na etapa 1.4.
   5. Recolher a biblioteca phagemid-ORF por colheita bactérias das placas de 150mm, misture bem, completá-los com 20% de glicerol estéril e loja a-80 ° C em pequenas alíquotas.
   6. Purifica o Plasmídeo de uma alíquota da biblioteca usando um kit de extração baseados em colunas do plasmídeo, seguindo as instruções do fabricante.
   7. Medir a concentração no espectrofotómetro UV. As amostras podem ser armazenadas a-20 ° C até ser usado para a caracterização por NGS.

3. phage biblioteca preparação e processo de selecção

1. Produção do fago
   1. Diluir uma alíquota das ações da biblioteca de phagemid em 10 mL de caldo de líquido 2xYT suplementado com 100 ampicilina µ g/mL, a fim de ter uma overdose de_600nm = 0,05.
   2. Crescer a biblioteca diluída em um frasco estéril 5 - 10 vezes maior do que o volume original, a 37 ° C, com agitação a 220 rpm até atingir OD_600nm = 0,5.
   3. Infectar bactérias com fago auxiliar (por exemplo, M13K07) em uma multiplicidade de infecção 20:1. Deixe a 37 ° C por 45 min com agitação ocasional (a cada 10 min).
   4. Centrifugar as bactérias a 4000 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet de bactérias em 40 mL de caldo de líquido 2xYT suplementado com 100 µ g/mL ampicilina e 50 canamicina µ g/mL crescer a 28 ° C, com agitação a 220 rpm para pernoite.
   5. No dia seguinte, as bactérias do centrifugador a 4000 x g por 20 min a 4 ° C. Recolha o sobrenadante contendo fago.
2. PEG-precipitação do fago.
   1. Adicionar volume 1/5 de um 0,22 µm filtrados PEG/NaCl solução (20% w/v PEG 6000, 2,5 M NaCl) para os fago apuradas e incubar no gelo por 30-60 min.
      Nota: Solução tornou-se esfumaçado após alguns minutos, indicando uma precipitação de sucesso do fago. A turvação da solução irá aumentar ao longo do tempo de incubação.
   2. Centrifugar a 4000 x g por 15 min a 4 ° C. Um pequeno sedimento branco do fago irá formar.
   3. -Ressuspender em 1 mL de PBS estéril. Transferir para tubo de 1,5 mL e centrifugar a 4 ° C por 10 min na velocidade máxima para remover as bactérias contaminantes. Formará uma bolinha marrom.
   4. Transferi o fago contendo sobrenadante para um tubo novo. Manter o fago no gelo para a seleção de titulação e fago sucessiva.
3. Titulação do fago
   1. Prepare diluições em série da solução do fago. Colocar 10 µ l da solução do fago em 990 µ l de PBS para obter 10^-2 diluição. Dilua novamente esta preparação para fazer 10^-4 e com isso obter uma diluição de 10^-6 .
   2. Crescer DH5αF' células de bactérias em meio líquido 2xYT a 37 ° C, com agitação até OD_600nm = 0,5 é alcançado. Transferir 1 mL das bactérias preparadas num tubo de 1,5 mL e infectar-se imediatamente com 1 µ l da diluição 10^-4 do fago. Incube sem tremer a 37 ° C por 45 min. repetir o mesmo procedimento para a diluição de^-6 a 10.
   3. Diluições de placa das bactérias infectadas na placa 2xYT de 100 mm. Colocar a placa a 30 ° C durante a noite.
   4. Placa de 100 µ l de DH5αF não infectados ' em uma placa de ágar 2xYT suplementado com 100 ampicilina µ g/mL para verificar a ausência de contaminação na preparação.
   5. O dia depois de contar o número de colônias e calcular o título do fago. Título expresso como número de fago/mL. Título final esperado é^12-13 fago/10ml.
4. Seleção do fago
   1. Seleção do fago, usando como isca purificada de anticorpos
      1. Saturar o fago por diluição 200 µ l de preparação do fago em um volume igual de PBS - 4% de leite desnatado e incubar por 1h à temperatura ambiente em rotação lenta. Esta etapa permite bloquear do fago para vinculação inespecíficos. Transferi 30 µ l de grânulos magnéticos revestidos de proteína-G para um tubo de 1,5 mL.
      2. Lave duas vezes da seguinte forma: adicionar 500 µ l de PBS, incubar em uma roda em rotação lenta por 2 min à temperatura ambiente, desenhar os grânulos para o lado do tubo usando um ímã e remover o sobrenadante.
      3. Incube fago saturado com grânulos lavados por 30 min à temperatura ambiente com rotação lenta.
      4. Desenhe os grânulos para o lado usando um campo magnético. Recolha o sobrenadante contendo fago a ser usado para a etapa de selecção.
      5. Prepare-se grânulos magnéticos durante a realização da etapa anterior, por conjugação de anticorpos purificados. Lave 30 µ l de grânulos magnéticos revestidos de proteína-G, como descrito acima. Diluir 10 µ g de anticorpos purificados em 500 µ l de PBS, adicionar aos talões lavados e incubar em rotação lenta à temperatura de 45 min. Lave duas vezes com PBS.
         Observação: Realizar duas preparações diferentes de grânulos magnéticos: um com anticorpos de interesse e outro com controle anticorpos, por exemplo, os anticorpos purificados de doadores saudáveis. A sequência de antígenos selecionado com anticorpos são subtraídos durante a etapa de análise das saídas de controle. Alternativamente, os grânulos magnéticos carregados com anticorpos controle podem ser usados para executar uma etapa de Pre-esclarecimento do fago (siga o protocolo para a incubação com grânulos un-conjugados).
      6. Seleção do fago: desenhar grânulos para um lado do tubo usando um imã, remover a última lavagem, adicionar fago e incubar com rotação lenta à temperatura de 90 min. lavar 5 vezes com 500 µ l de PBS-0.1% Tween-20 e 5 vezes com PBS.
      7. Eluir fago acoplado, que representa a saída da seleção, misturando os grânulos com 1 mL de DH5αF' células cultivadas em OD₆₀₀ = 0,5. Incube as bactérias com grânulos por 45 min a 37 ° C, agitando ocasionalmente (a cada 10 min). Placa de saída em uma placa de ágar 2xYT 150mm suplementada com ampicilina 100 de µ g/mL.
      8. Placa de 100 µ l de não diluído e de diferentes diluições de saída (10^-1 a 10^-5) para realizar a titulação. No dia seguinte coletar bactérias das placas de 150mm, adicionando-se 3 mL de meio fresco 2xYT e colheita-os com uma espátula estéril, homogeneizar, completá-los com 20% de glicerol estéril e armazenar a-80 ° C em pequenas alíquotas.
      9. Cresce uma alíquota novamente para realizar uma segunda rodada de seleção. Repita todo o procedimento panning conforme descrito acima, exceto para as condições de lavagem. Neste caso lave 10 vezes com PBS - 1% Tween-20 (Coloque a solução no tubo e despejem imediatamente). Em seguida adicione 500 µ l de PBS e incubar em rotação em temperatura ambiente por 10 min. executar outras 10 lavagens com PBS. Prossiga com a etapa de eluição, quanto para a primeira rodada de seleção.
      10. Extrai o DNA do plasmídeo de uma alíquota de saída usando um jogo baseado em coluna, seguindo as instruções dos fabricantes. Loja do plasmídeo a-20 ° C até que será usado para sequenciamento profundo.
   2. Seleção do fago, usando como isca de proteínas recombinantes
      1. Saturar o fago por diluição 200 µ l de preparação do fago em um volume igual de PBS - 4% de leite desnatado e incubar por 1h à temperatura ambiente em rotação lenta.
      2. Adicione 100 µ l de grânulos magnético estreptavidina. Encube por 1h à temperatura ambiente para selecionar streptavidin-ligação fago. Remova os fago streptavidin-limite desenhando os grânulos para o lado usando um ímã. Leve o sobrenadante da etapa anterior e adicionar proteína biotinilado (em uma concentração de 100-550 nM) e incubar em um rotor em temperatura ambiente por 30 min a 1 h.
      3. Preparar os grânulos magnéticos: durante a realização da etapa anterior, lavar 100 µ l de grânulos streptavidin-magnético com PBS, resuspenda em PBS 2% de leite desnatado e incubar com rotação à temperatura ambiente por 30 min a 1 h.
      4. Seleção do fago: desenhar grânulos para um lado do tubo usando um imã, remover PBS - 2% de leite e ressuspender grânulos com mix de proteínas do fago. Incube com rotação lenta à temperatura de 90 min.
      5. Desenhar os grânulos ao lado do tubo usando um ímã, desprezar o sobrenadante e lavá-los cuidadosamente cinco vezes com 500 µ l de PBS 0,1% Tween-20. Execute a eluição, conforme descrito na sessão anterior.

4. phage biblioteca sequenciamento profunda plataforma (Figura 3)

1. DNA insere recuperação de pFILTER-ORF-biblioteca, pDAN5-ORF-biblioteca ou selecionado-fago-bibliotecas
   1. Descongelar uma alíquota da biblioteca, quantificá-lo usando um espectrofotômetro, recuperar as inserções de ADN pela amplificação com primers específicos.
      Nota: Os primers utilizados para resgatar as inserções são ligados na sua extremidade 5' para sequências de adaptadores, permitindo assim a indexação sucessivas das piscinas amplicons obtidos e a sequenciação directa das inserções de DNA recuperado usando os sequenciadores. Sua sequência é a Tabela de materiais. Os adaptadores são indicados em negrito, e os primers específicos são indicados em itálico.
   2. Use 2,5 µ l da biblioteca (pFILTER/phagemid/selecionado-fago) como modelo de DNA para uma reação de PCR.
   3. Use o seguinte programa: 95 ° C por 3 min; 25 ciclos de 95 ° C por 30 s, 55 ° C por 30 s, 72 ° C por 30 s; 72 ° C por 5 min. de espera a 4 ° C.
      Nota: neste momento é aconselhável executar 1 µ l do produto do PCR em um Bioanalyzer ou TapeStation para verificar o tamanho da amplicons e verifique se eles estão no intervalo correto.
2. Limpeza do PCR
   1. Trazer as esferas magnéticas (por exemplo, AMPure) à temperatura ambiente. Transferi todo o produto do PCR do tubo de PCR para um tubo de 1,5 mL. Vórtice magnéticos grânulos para 30 s para certificar-se que os grânulos são uniformemente dispersos. Adicione 20 µ l de grânulos magnéticos a cada tubo contendo o produto do PCR, misture suavemente pipetando. Incube a temperatura ambiente sem tremer por 5 min.
   2. Coloque a placa em um carrinho magnético por 2 min ou até que o sobrenadante se dissipou. Com os produtos PCR no stand magnético, remover e descartar o sobrenadante.
   3. Lave os grânulos com 80% de etanol preparados na hora, com os produtos PCR no carrinho magnético, da seguinte forma: Adicionar 200 µ l de etanol a 80% recentemente preparada para cada amostra bem; Incubar a placa a depor magnético para 3 s; cuidadosamente, remover e descartar o sobrenadante.
   4. Realizar uma segunda lavagem de etanol, com os produtos PCR no stand magnético; no final da segunda lavagem cuidadosamente remover todo o etanol e permitir que os grânulos secar por 10 min.
   5. Remover os produtos PCR do suporte magnético, adicionar 17,5 µ l de pH de 10 mM Tris 8.5 a cada tubo, pipetar delicadamente acima e para baixo 10 vezes, certifique-se que os grânulos são totalmente resuspended. Incube a temperatura ambiente por 2 min.
   6. Colocar o tubo no stand magnético por 2 min ou até que o sobrenadante, cuidadosamente transferência 15 µ l do sobrenadante contendo os produtos PCR purificados para um novo tubo de 1,5 mL. Armazene os produtos PCR purificados a-15 ° C a-25 ° C por até uma semana se não prosseguir imediatamente ao índice do PCR.
3. Índice do PCR
   Nota: Depois de PCR limpar, execute índice do PCR. Use o kit de usina XT índice; assim, será possível sequenciar as bibliotecas indexadas duplas resultantes dentro multiplexado Illumina corre.
   1. Transferir todos os 15 μL contendo cada produto purificado para um novo tubo de PCR e configurar a seguinte reação contendo: 15 µ l de produto amplicons purificado, 5 µ l de índice Primer 1 e 5 µ l de índice Primer 2, 25 µ l de mistura de 2 x PCR; volume final de 50 µ l.
   2. Realizar PCR em um termociclador usando o seguinte programa: 95 ° C por 3 min, 8 ciclos de 95 ° C por 30 s, 55 ° C por 30 s, 72 ° C por 30 s; 72° C por 5 min, em seguida, mantenha a 4 ° C.
4. PCR limpar 2
   1. Siga o mesmo protocolo descrito na seção 4.2 para PCR limpar tudo com as seguintes alterações: na primeira etapa adicionar 56 µ l de grânulos magnéticos para cada 50 µ l de produto do PCR.
   2. Resuspenda as contas em 27,5 µ l de 10mm Tris pH 8,5 a etapa final de purificação e 25 µ l de transferência para um novo tubo (esta é a biblioteca de final purificada pronta para quantificação e sequenciamento de então).
   3. Armazene a placa a-15 ° C a-25 ° C por até uma semana se não proceder à quantificação da biblioteca.
5. Avaliação qualitativa e quantitativa da biblioteca de sequenciamento
   1. Após a purificação, executar 1 µ l de uma 01:10 diluição da biblioteca final sobre um bioanalyzer para verificar o tamanho e quantificá-lo selecionando a região do traço final da biblioteca.
   2. Em paralelo realizar a quantificação da biblioteca por PCR em tempo Real usando um kit de quantificação de biblioteca por protocolo do fabricante.
6. Sequenciamento de bibliotecas
   1. As bibliotecas indexadas duas, produzidas em conjunto com outras bibliotecas de sequenciamento indexada dual da piscina. Sequência que deste tipo de biblioteca, gerando tempo lê, pelo menos 250 final emparelhados de bp usando tanto o Hiseq2500 ou os MiSeq instrumentos para obter o primeiro caso 250bp PE lê e o segundo caso 300 bp PE lê.

5. Bioinformatic dados análise usando a ferramenta de Web Interactome-Seq

1. Analise as leituras que se originou de sequenciamento de biblioteca pFILTER/phagemid/selecionado-fago com o pipeline de análise de dados Interactome-seq. A ferramenta de web está disponível gratuitamente no seguinte endereço: http://interactomeseq.ba.itb.cnr.it/

Results

A abordagem de filtragem é esquematizada na Figura 1. Cada tipo de DNA intronless pode ser usado. Na figura 1A é representada a primeira parte da abordagem de filtragem: após o carregamento em um gel de agarose ou um bioanalyzer, uma boa fragmentação do DNA de interesse aparece como uma mancha de fragmentos com uma distribuição de comprimento no tamanho desejado da bp 150-750. Uma imagem de gel de virtual representativa do DNA fr...

Discussion

A criação de uma biblioteca filtrada altamente diversificada de alta qualidade ORFs é o primeiro passo crítico em todo o processo desde que afetará todas as etapas subsequentes do pipeline.

Uma característica importante e vantajosa do nosso método é que qualquer fonte de DNA (intronless) (cDNA, DNA genômico, PCR derivado ou DNA sintético) é apropriado para a construção da biblioteca. O primeiro parâmetro que deve ser levado em conta é que o comprimento dos fragmentos do DNA clonado no vetor pF...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Homogeneizador ultrassônico Sonopuls	Bandelin	HD2070	ou equivalente
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0321	ou equivalente
GeneRuler 1 kb DNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	SM0311	ou equivalente
Molecular Biology	Agarose BioRad	161-3102	ou equivalente
Green Gel Plus	Fisher Molecular Biology	FS-GEL01	ou equivalente
6x DNA Loading Dye	Thermo Fisher Scientific	R0611	ou equivalente
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	ou equivalente
Quick Blunting Kit	New England Biolabs	E1201S
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
Kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade	Thermo Fisher Scientific	4368813
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs	S1420S	ou equivalente
QIAquick PCR purification Kit	Qiagen	28104	ou equivalente
EcoRV	New England Biolabs	R0195L
Fosfatase Antártica	New England Biolabs	M0289S
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202T
Acetato de Sódio 3M pH5.2			de laboratório geral
Etanol para biologia molecular	Sigma-Aldrich	E7023	ou células de
bactérias DH5aF equivalentes	Thermo Fisher Scientific
0,2 ml tubos fornecedor	de laboratório geral
Tubos de 1,5 ml			geral de laboratório
0,1 cm cubetas de eletroporação	Biosigma	4905020
Electroporator 2510	Eppendorf
2x YT medium	Sigma-Aldrich	Y1003
Ampicilina sal de sódio	Sigma-Aldrich	A9518
Cloranfenicol	Sigma-Aldrich	C0378
DreamTaq DNA Polimerase	Thermo Fisher Scientific	EP0702
Desoxinucleotídeo (dNTP) Mistura de solução New	England Biolabs	N0447S
(com tampa aquecida)	fornecedor
de placas de 150 mm	fornecedor
placas de 100 mm	fornecedor	de laboratório geral
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516
BssHII	New England Biolabs	R0199L
NheI	New England Biolabs	R0131L
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104	ou equivalente
M13KO7 Helper Phage	GE Healthcare Life Sciences	27-1524-01
Sulfato de canamicina de Streptomyces kanamyceticus	Sigma-Aldrich	K1377
Polietilenoglicol (PEG)	Sigma-Aldrich	P5413
Cloreto de Sódio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S3014
PBS	fornecedor de laboratório
Dynabeads Proteína G para Imunoprecipitação	Thermo Fisher Scientific	10003D	ou equivalente
MagnaRack de Separação Magnética	Thermo Fisher Scientific	CS15000	ou equivalente
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Leite em pó desnatado	EuroClone	EMR180500
KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Kapa Biosystems, Fisher Scientific	7958935001
contas AMPure XP	Agencourt, Beckman Coulter	A63881
Nextera XT dual Index Primers	Illumina	FC-131-2001 ou FC-131-2002 ou FC-131-2003 ou FC-131-2004
MiSeq ou Hiseq2500	Illumina
Spectrophotomer	Nanodrop
Agilent Bioanalisador ou TapeStation	Agilent
Forward PCR primer	fornecedor geral de laboratório		5' TACCTATTGCCTACGGCA GCCGCTGGATTGTTATTACTC 3'
Fornecedor		primer PCR reverso	5' TGGTGATGGTGAGTACTA TCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3'
Primário direto para		de laboratório geral	5' TCGTCGGCAGCGTCAGA TGTGTATAAGAGACAGGCA GCAAGCGGCGCGCATGC 3';
Primário reverso para		de laboratório geral	5' GTCTCGTGGGCTCGGAGA TGTGTATAAGAGACAGGGG ATTGGTTTGCCGCTAGC 3';